检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱的方法及试剂盒与应用

摘要

本发明公开一种检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱的方法及试剂盒与应用。该方法包括如下步骤：设计扩增非小细胞肺癌七种相关基因外显子区段的扩增引物，共15对，将扩增引物分组配制成扩增引物混合液，分为6组，使用扩增引物混合液分别对待检样品进行多重PCR扩增后进行酶消化；设计用于检测热点突变位点的延伸引物，共39条，将延伸引物分组配制成延伸引物混合液，对应于扩增引物混合液，也为6组，将前述消化后的PCR产物进行延伸反应，接着酶消化，得到的产物进行毛细管电泳，通过软件分析，作出结果判断。本发明提供的试剂盒包含扩增非小细胞肺癌七种相关基因外显子区段的扩增引物以及用于检测热点突变位点的延伸引物。本发明简单、通量大，耗时短。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱的方法，特别涉及一种检测非小细胞 肺癌驱动基因突变谱的方法及试剂盒与应用。

背景技术

肺癌的发病率及病死率在肿瘤中均位于首位。传统的治疗方法是基于病人的临床特征及 病理类型选择化学治疗方案，但无疾病进展期（PFS）只有6个月。近年来，肺癌的靶向治 疗取得了显著进展，最突出的例子是：以表皮生长因子（EGFR）为靶点的小分子酪氨酸激酶 抑制剂在含突变型EGFR的非小细胞肺癌患者中显示出显著的疗效，PFS达到了9-13个月。 随后，以EML4-ALK融合基因为靶点的克唑替尼在非小细胞肺癌的靶向治疗中也显示出同样 的临床疗效。显然，肺癌的单一的病理分型已不能满足临床需要，需从基因水平深入了解在 肺癌的发生、发展过程中起关键作用的分子及其分子机理。研究表明，可根据肺癌的分子突 变状态，将非小细胞肺癌分成不同的分子亚组。近10年来的研究进展发现了许多药物治疗的 靶点，并陆续有文献报道了非小细胞肺癌驱动基因突变谱，超过80%的肺腺癌，约47%的肺 鳞癌伴有驱动基因的突变，为非小细胞肺癌的靶向治疗提供了分子基础。

除了以EGFR、EML4-ALK融合基因为靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂已在临床应用外， PI3K抑制剂、BRAF抑制、MEK抑制剂均已进入临床试验阶段，因此，急需开发一种试剂 盒或方法为临床提供一次性进行肺癌基因突变谱的检测，以便为临床试验筛选患者或将来为 患者选择治疗方法提供指导依据。

本发明单位前期对国人非小细胞肺癌中EGFR、KRAS、PIK3CA、BRAF、PTEN、MEK1 等基因研究数据显示，东亚人与西方人的非小细胞肺癌分子突变谱存在差异，如表1所示。 EGFR在东亚人和西方人中的突变率分别为47.9%和19.2%；KRAS分别为26.1%和11.2%。

表1非小细胞肺癌驱动基因的热点突变

基因名称 核酸位点 氨基酸 基因名称 核酸位点 氨基酸 BRAF 1397G>T G466V KRAS 34G>T/A/C G12C/S/R 1406G>C G469A 35G>T/A/C G12V/D/A 1789C>G L596V 37G>T/A/C G13C/S/R 1798G>A V600K 38G>C/A/T G13A/D/V 1799T>G/A V600G/E PTEN 388C> R130 517C>T R173C PIK3CA 1624G>A E542K 697C>T R233X 1633G>C/A E545Q/K 800A>G K267fs*9 1636C>A Q546K EGFR 2155G>A/T G719S/C 1637A>G Q546R 2156>A/C G719D/A 3139C>T H1047Y 2235_2249del15 E746_A750(1) 3140A>T/G H1047L/R 2236_2250del15 E746_A750(2) 3145G>A/C G1049S/R 2369C>T T790M NRAS 34G>C/T/G G12R/C/S 2573T>C L858R 35G>A/C/T G12D/A/V 2582T>A L861Q 37G>T/A/C G13C/S/R 38G>C/A/T G13A/D/V MEK1 167A>C Q56P 181C>A/G Q61K/E 171G>T K58N

182A>C/T/G Q61P/L/R 199G>A D67N 183A>T/C Q61H

目前，基因突变常见的检测方法有：直接测序法、ARMS法、HRM法、DHPLC法等， 这些方法共同缺点是每次只能检测一个突变或一段基因的突变，检测通量低，只能逐个筛查 驱动基因的突变状态，病人等待结果的时间较长。同时，由于晚期病人取材较难，样本量较 少，往往不能满足上述方法检测基因突变谱的需要。深度测序方法虽能在通量上满足临床需 要，但由于价格昂贵不能在临床应用中普及。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测非小细胞肺癌驱动基 因突变谱的方法。应用多重PCR结合单碱基延伸方法检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱。本 申请所指的驱动基因为EGFR、BRAF、PIK3CA、PTEN、MEK1、KRAS和NRAS等七种与 非小细胞肺癌发生与维持相关基因。

本发明的另一目的在于提供检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱的试剂盒。该试剂盒为依 据上述方法设计得到。

本发明的再一目的在于提供上述试剂盒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱的方法， 包含如下步骤：

（1）设计扩增非小细胞肺癌七种相关基因外显子区段的扩增引物

所设计的扩增非小细胞肺癌七种相关基因外显子区段的扩增引物如表2所示：

表2各相关基因外显子区段的扩增引物（5'-3'）

用表2所示的引物对非小细胞肺癌七种相关基因BRAF、EGFR、PI3K、PTEN、MEK1、 KRAS和NRAS中包含热点突变位点的外显子DNA区段进行扩增，其中，BRAF的外显子区 段为BRAF_EX11、BRAF_EX15；EGFR的外显子区段为EGFR_EX18、EGFR_EX19、 EGFR_EX20、EGFR_EX21；KRAS的外显子区段为KRAS_EX2；NRAS的外显子区段为 NRAS_EX2、NRAS_EX3；PI3K的外显子区段为PIK3K_EX9、PIK3K_EX20；PTEN的外显 子区段为PTEN_EX5、PTEN_EX6、PTEN_EX7；MEK1的外显子区段为MEK1_EX2；

（2）多重PCR扩增

将步骤（1）设计的扩增非小细胞肺癌七个驱动基因外显子区段的扩增引物配制成扩增引 物混合液，分为P1、P2、P3、P4、P5、P6等6个组，如表3所示：

表3七个驱动基因外显子区段的扩增引物混合液的配制

分别使用扩增引物混合液P1、P2、P3、P4、P5、P6进行多重PCR扩增，获得PCR产物；

（3）PCR产物消化：步骤（2）获得的PCR产物经碱性磷酸酶及核酸外切酶消化；消化 体系为：PCR产物2μl、核酸外切酶0.5μl、碱性磷酸酶1μl、H₂O6.5μl；消化条件为：37℃ 60分钟，75℃15分钟；

（4）设计用于检测热点突变位点的延伸引物：针对表1中所述的非小细胞肺癌驱动基因 的热点突变设计用于单碱基延伸方法的延伸引物，七个非小细胞肺癌驱动基因的39条用于检 测热点突变位点的延伸引物序列如表4所示：

表4用于检测热点突变位点的延伸引物（5'3'）

（5）延伸反应：按表5将延伸引物配制成引物混合液，相应于上述的PCR组别，其延 伸引物组分别为E1、E2、E3、E4、E5、E6，采用AB公司生产的SNaPshot Multiplex Ready  Reaction Mix酶对步骤（3）消化后的PCR产物分别进行延伸反应；

表5延伸引物混合液的配制

（6）酶消化：在延伸反应产物中加入碱性磷酸酶进行消化；

（7）毛细管电泳：消化后的延伸产物取1μl，加入9μl甲酰胺，0.2μl LIZ120，混匀，在 AB3730基因分析仪上进行毛细管电泳，电泳结果以GeneMapper4.1软件分析得出各目的基 因的突变状况，作出结果判断；

（8）结果判断：1）根据电泳峰的位置确定基因位点；2）根据电泳峰的颜色确定碱基类 型：蓝色代表G碱基、绿色代表A碱基、红色代表T碱基、黑色代表C碱基；

步骤（2）所述的多重PCR扩增的条件为：95℃5分钟；（95℃20秒、58℃30秒、72℃ 1分钟），40个循环；72℃3分钟；

步骤（2）所述的多重PCR扩增的体系为：Premix Hotstart Taq5μl、扩增引物混合液1μl、 DNA模板20ng，双蒸水补至10μl；

步骤（5）所述的延伸反应的体系为：SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix2μl、消化 后的PCR产物2μl、延伸引物混合液1μl、H₂O5μl；

步骤（5）所述的延伸反应的条件为：96℃30秒；(96℃10秒、50℃10秒、60℃30秒)， 35个循环；

步骤（6）所述的酶消化的条件为：延伸反应产物9μl、碱性磷酸酶1μl；37℃60分钟消 化，75℃15分钟灭活剩余的酶；

步骤（7）所述的毛细管电泳的操作条件为AB3730基因分析仪用户手册标准操作程序；

一种检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱的试剂盒，为依据上述检测非小细胞肺癌驱动基 因突变谱的方法设计得到，包含表2所列的扩增非小细胞肺癌七种相关基因外显子区段的扩 增引物和表4所列的用于检测热点突变位点的延伸引物；

所述的检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱的试剂盒，优选包含按表3所列P1、P2、P3、 P4、P5、P6的扩增引物混合液以及按表5配制的E1、E2、E3、E4、E5、E6延伸引物混合液；

所述的检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱的试剂盒，优选还包含Premix Hotstart Taq、碱 性磷酸酶和核酸外切酶和SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix酶；

所述的检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱的试剂盒作为诊断试剂在临床中进行应用，用于 检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱；

所述的检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

①用扩增引物混合液P1、P2、P3、P4、P5、P6分别进行PCR扩增，获得PCR产物； PCR扩增条件为：95℃5分钟；（95℃20秒、58℃30秒、72℃1分钟），40个循环；72℃3分 钟；PCR扩增体系为：Premix Hotstart Taq5μl、扩增引物混合液1μl、DNA模板20ng，双蒸 水补至10μl；

②将步骤①获得的PCR产物经碱性磷酸酶及核酸外切酶消化；消化体系为：PCR产物2μl、 核酸外切酶0.5μl、碱性磷酸酶1μl、H₂O6.5μl；消化条件为：37℃60分钟，75℃15分钟；

③延伸反应：按表5将延伸引物配制成延伸引物混合液，分别为E1、E2、E3、E4、E5、 E6；延伸反应体系为：SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix2μl、PCR产物2μl、延伸引物 混合液（分别为E1、E2、E3、E4、E5、E6）1μl、H₂O5μl；延伸反应条件为：96℃30秒； (96℃10秒、50℃10秒、60℃30秒)，35个循环；

④将步骤③获得的每管PCR产物中加入1μl的碱性磷酸酶，37℃60分钟消化，75℃15 分钟灭活剩余的酶；

⑤消化后的延伸产物取1μl，加入9μl甲酰胺，0.2μl LIZ120，混匀，在AB3730基因分 析仪上进行毛细管电泳；电泳结果以GeneMapper4.1软件分析得出各目的基因的突变状况， 作出结果判断。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）通量高：现有的基因突变检测方法步骤烦琐（如直接测序法）、一次只能检测一 个基因的几个位点（如HRM、ARMS、DHPLC），通量较低；本发明提供的方法和试剂盒一 次可以检测非小细胞肺癌7个驱动基因共37(其中EGFR_EXON19的两个缺失突变分别从正 反两个方向检测)个位点的突变；本发明相对于直接测序及ARMS检测技术，单次检测的基 因数目及突变位点多。

（2）步骤简单：本发明提供的方法和试剂盒相对于直接测序技术及DHPLC技术，操 作步骤简单，结果容易判断。

（3）时间短：由于本发明提供的方法和试剂盒一次可检测多个基因的热点突变，完成 7个驱动基因的检测仅需要两个工作日，140ng DNA，而直接测序法则需要三个工作日，300ng  DNA。既可以缩短检测时间，又可以大大节省DNA的使用量。

附图说明

图1为实施例1样本使用延伸引物混合液E1得到的结果：从左至右分别为KRAS_34、 EGFR_2235、EGFR_2369、NRAS_37、NRAS_181和PIK3CA_1633六个位点的毛细管电泳 图，结果分别为C、G、G、G、C、G，均为野生型；横坐标表示延伸产物大小，纵坐标表示 荧光强度。

图2为实施例1样本使用延伸引物混合液E2得到的结果图：从左至右分别为 EGFR_2235R、NRAS_38、BRAF_1799、NRAS_182和MEK1_199五个位点的毛细管电泳图， 结果分别为G、C、T、A、C；横坐标表示延伸产物大小，纵坐标表示荧光强度。

图3为实施例1样本使用延伸引物混合液E3得到的结果图：从左至右分别为KRAS_35、 EGFR_2236R、EGFR_2573、BRAF_1798、PIK3CA_1624、PIK3CA_1637和NRAS_35七个 位点的毛细管电泳图，结果分别为G、G、T/G、G、C、A、G；结果提示EGFR核苷酸2369 位点发生T>G突变，氨基酸发生L858R突变；横坐标表示延伸产物大小、纵坐标表示荧光 强度。

图4为实施例1样本使用延伸引物混合液E4得到的结果图：从左至右分别为 MEK1_171、PIK3CA_3140、EGFR_2236R、PTEN_517、EGFR_2156和PIK3CA3139六个位 点的毛细管电泳图，结果分别为C、T、T、C、G、G；横坐标表示延伸产物大小，纵坐标表 示荧光强度。

图5为实施例1样本使用延伸引物混合液E5得到的结果图：从左至右分别为 EGFR_2582、KRAS_37、MEK1_167、EGFR_2155、BRAF_1406、PIK3CA_3145、NRAS_183 和BRAF_1789八个位点的毛细管电泳图，结果分别为A、G、A、G、G、C、T、C，均为 野生型；横坐标表示延伸产物大小，纵坐标表示荧光强度。

图6为实施例1样本使用延伸引物混合液E6得到的结果图：从左至右分别为NRAS_34、 KRAS_38、PTEN_388、PTEN_697、PTEN_800、PIK3CA_1636和BRAF_1397七个位点的 毛细管电泳图，结果分别为C、G、C、G、A、C、G；横坐标表示延伸产物大小，纵坐标 表示荧光强度。

图7为对比例1样本使用引物浓度优化前的延伸引物混合液E2得到的结果图：从左至 右分别为EGFR_2235R、NRAS_38、BRAF_1799、NRAS_182和MEK1_199五个位点的毛 细管电泳图，结果分别为G、C、T、/、C；其中BRAF_1799电泳峰偏低，NRAS_182不出 峰；横坐标表示延伸产物大小，纵坐标表示荧光强度。

图8为对比例2中样本使用引物组合优化前的延伸引物混合液E6得到的结果图：从左 至右分别为NRAS_34、KRAS_35、PTEN_388、PTEN_697、PIK3CA_1636和BRAF_1397 六个位点的毛细管电泳图，结果分别为C、G、C、G、C、G；结果提示，KRAS核苷酸35 位点碱基为G，野生型；横坐标表示延伸产物大小，纵坐标表示荧光强度。

图9为对比例2样本使用引物组合优化后延伸引物混合液E3得到的结果图：从左至右 分别为KRAS_35、EGFR_2236R、EGFR_2573、BRAF_1798、PIK3CA_1624、PIK3CA_1637 和NRAS_35七个位点的毛细管电泳图，结果分别为G/A、G、T、G、C、A、G；结果提示 KRAS核苷酸35位点发生G>A突变；横坐标表示延伸产物大小、纵坐标表示荧光强度。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

（一）引物设计

（1）设计扩增非小细胞肺癌七个驱动基因外显子区段的扩增引物

用引物对非小细胞肺癌七个驱动基因BRAF、EGFR、PIK3CA、PTEN、MEK1、KRAS 和NRAS中包含热点突变位点的外显子DNA区段进行扩增，其中，BRAF的外显子区段为 BRAF_EX11、BRAF_EX15；EGFR的外显子区段为EGFR_EX18、EGFR_EX19、EGFR_EX20、 EGFR_EX21；KRAS的外显子区段为KRAS_EX2；NRAS的外显子区段为NRAS_EX2、 NRAS_EX3；PIK3CA的外显子区段为PIK3CA_EX9、PIK3CA_EX20；PTEN的外显子区 段为PTEN_EX5、PTEN_EX6、PTEN_EX7；MEK1的外显子区段为MEK1_EX2。

所设计的扩增非小细胞肺癌七个驱动基因外显子区段的扩增引物如表6所示：

表6各相关基因外显子区段的扩增引物（5'-3'）

（2）设计延伸引物：针对表1中所述的非小细胞肺癌驱动基因的热点突变设计用于单 碱基延伸方法的延伸引物，七个非小细胞肺癌驱动基因的39条用于检测热点突变位点的延 伸引物序列如表7。

表7用于检测热点突变位点的延伸引物（5'-3'）

（3）PCR引物混合液的配制：按表8将PCR扩增引物配制成混合液，分别为P1、P2、 P3、P4、P5、P6共6个组别，如表8所示。

表8七个驱动基因外显子区段的扩增引物混合液的配制

（4）延伸引物混合液的配制：按表9将延伸引物配制成混合液，分别为E1、E2、E3、 E4、E5、E6等6组，分别对应于上述的P1、P2、P3、P4、P5、P6组合，如表9所示。

表9延伸引物混合液的配制

（二）样本检测

（1）多重PCR扩增

使用组织DNA提取试剂盒（华舜公司）按试剂盒操作说书明对一个肺癌手术切除组织 样本（广东，命名为样本1）提取DNA后，分别用扩增引物混合液P1、P2、P3、P4、P5、 P6进行多重PCR扩增，同时扩增1管正常人血液基因组DNA（按天根公司血液样本DNA 提取试剂盒说明书操作提取DNA）作为正常对照。PCR扩增条件是：95℃5分钟；（95 ℃20秒、58℃30秒、72℃1分钟），40个循环；72℃3分钟。P1管的PCR体系为：5μl Premix Hotstart Taq（Takara）、1μl扩增引物混合液P1、1μl（20ng/μl）DNA、3μl H₂O。 其余P2、P3、P4、P5、P6管PCR反应体系均按此方法配制。

（2）PCR产物消化：将步骤（1）得到的PCR产物进行消化，消化体系为：PCR产 物2μl、核酸外切酶（Takara）0.5μl、碱性磷酸酶（Takara）1μl、H₂O6.5μl；消化条件为37 ℃60分钟，75℃15分钟。分别得到P1、P2、P3、P4、P5、P6消化产物。

（3）延伸反应：E1延伸反应体系：2μl SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix（美国 AB公司）、2μl步骤（2）的P1消化产物、1μl E1延伸引物混合物、5μl H₂O。其余E2、E3、 E4、E5、E6延伸反应体系按此方法配制（即P2对应E2、P3对应E3、P4对应E4、P5 对应E5、P6对应E6）；延伸条件为：96℃30秒；96℃10秒、50℃10秒、60℃30秒， 35个循环。

（4）酶消化：在每管延伸反应产物中加入1μl的碱性磷酸酶（Takara），37℃60分钟 消化，75℃15分钟灭活剩余的酶。

（5）消化后的延伸产物取1μl，加入9μl甲酰胺，0.2μl LIZ120，混匀，在AB3730基 因分析仪上进行电泳。采用GeneMaper4.1分析结果。

（三）检测结果：样本1的检测结果如图1～6所示：图1、2、4、5和6的结果表示所 检测的位点均为野生型，图3的结果表明在E3组合中，EGFR基因核苷酸2369位点发生 T>G突变，氨基酸发生L858R突变，其余基因位点均为野生型。使用直接测序法对样本1 分析，得到的结果和本发明的结果一致。正常人血液基因组得到的结果表示所检测的位点 均为野生型。可见本发明提供的方法和试剂盒能准确、有效地检测非小细胞肺癌驱动基因 突变。

对比例1

操作步骤与条件基本与实施例1一致，区别仅在于：E2组延伸引物的浓度有变化，具 体为BRAF1799_extF由3pmol/L变为2pmol/L，NRAS182_extF由3pmol/L变为1pmol/L， 其他三个延伸引物浓度不变。结果，BRAF1799_extF的电泳峰明显降低，而NRAS182_extF 电泳峰消失，如图7所示。本对比例旨在说明，在其他条件不变的情况下，延伸引物的混 合物中，各个引物成分的浓度比例是实验成败的一个关键因素。

该对比例说明，在进行多重PCR及延伸反应时，引物混合物中，各种引物之间存在着 相互竞争作用，某些引物的反应效率高，产生的峰形较高，但有些引物效率则受到抑制， 所以引物混合中各种引物的浓度和比例对结果影响很大，需要不断调整，获得最佳引物浓 度比例。

对比例2

（一）引物设计

（1）设计扩增非小细胞肺癌七个驱动基因外显子区段的扩增引物：同实施例1。

（2）设计延伸引物：同实施例1。

（3）PCR引物混合液的配制：如表10所示。

表10七个驱动基因外显子区段的扩增引物混合液的配制

（4）延伸引物混合液的配制：KRAS35_extF延伸引物从E3组调整至E6组，如表11 所示。

表11延伸引物混合液的配制

（二）样本检测

样本2：从一个肺癌患者穿刺组织样本（广东）提取的DNA。

按实施例1条件与方法进行DNA提取、PCR扩增、酶消化、延伸反应及结果分析。

结果：

本对比例目的在于说明延伸引物KRAS35位于不同的组别，延伸效率不同，因此，对 于样本2其他基因的检测结果在此不作展示及说明，仅展示及说明KRAS35位点的结果， 见图8：图中第二个峰为KRAS基因核苷酸35位点的碱基峰图，为G峰，即是野生型。

将样本2完全按照实施例1的条件及方法重复实验，结果见图9：图中第一个峰为 KRAS35碱基峰图，结果表明，KRAS基因核苷酸35位点发生G>A突变。结果与直接测法 得到的结果一致。

可见，引物之间存在着相互竞争作用，需要优化各引物的组合，方可得到准确度高的结 果。

效果实施例

按实施例1的操作步骤及条件检测110例肿瘤患者的样本，并与直接测序法比较，本 发明的灵敏度为100%，特异度为98.4%，阳性预测值为97.9%，阴性预测值为100%。参见 表10。

表10灵敏度与特异度

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均 应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。