一种原位交联I型胶原电纺纤维膜敷料及其制备方法

摘要

本发明公开了一种制备原位交联I型电纺纤维膜敷料的制备方法，系以一种新型的过程友好型溶剂体系（1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐与锂盐的复合体系）溶解I型胶原，最大程度地保留了I型胶原的三股螺旋结构，并采用一种生物相容性良好的天然交联剂（氧化海藻酸钠）参与胶原的静电纺丝过程，并在I型胶原原位发生交联作用。接着，经过简单的水洗除去盐分，经冷冻干燥、灭菌处理封装即得到原位交联I型胶原电纺纤维膜敷料。该方法简便快捷，易于实现工业化生产，并有效地规避了目前普遍采用的戊二醛交联所带来的潜在生物毒性的风险。采用本发明制备的原位交联I型胶原电纺纤维膜敷料，其生物相容性良好，无细胞毒性，生物活性高。

说明书

技术领域

本发明涉及生物材料领域，特别是一种原位交联I型胶原电纺纤维膜敷料的制备方法。

背景技术

20世纪以来，纳米技术与材料逐渐家喻户晓。目前，纳米材料已经越来越广泛地出现在人们实际工作和生活中，给人们的生活带来了日新月异的变化。静电纺丝技术作为一种快速制备纳米纤维材料的方法引起了广大科研工作者的广泛关注。尤其是在生物敷料领域，电纺纤维轻薄柔软且布满纳米孔隙，能与创面充分弥合，一方面可减轻外界对创面组织的刺激，保护创口体液不至于在空气中蒸发散失，同时保证创面能接触到新鲜空气，利于细胞的生长修复；另一方面，在气溶胶微粒捕捉机制的作用下，电纺丝纳米纤维可以滤去空气中的几乎所有细菌和微尘，避免伤口感染。

胶原，作为哺乳动物中最重要的一类结构蛋白，是构成细胞外基质，胶原在细胞外基质中形成半晶体的纤维，给细胞提供抗张力，并在细胞的迁移和发育中起重要作用。正因为如此，胶原作为一类天然生物高分子在生物敷料领域扮演着举足轻重的角色。大量文献报道，保留了I型胶原特有的三股螺旋结构的胶原材料能够明显地促进细胞的生长、增殖和迁移，而其降解产物则不具备该功效。因此，胶原的物理结构是否在工艺过程中得到最大程度的保留，是最终胶原材料能否发挥胶原自身优势的关键 (Li G.Y., Fukunaga S., Takenouchi, K. etal, Comparative study of the physiological properties of collagen, gelatin and collagen hydrolysate as cosmetic materials[J]. International journal of cosmetic science, 2005(27):101-106)。

中国发明专利CN103046225A公开了纳米胶原蛋白膜的制备方法，其步骤是取胶原蛋白溶于六氟异丙醇中，得到80～120mg/mL的胶原蛋白溶液，在电压为15～19kv，接收距离为12.5～15cm，推进速度为0.5～1.2mL/h，挥去六氟异丙醇，即得到纳米胶原蛋白膜。尽管该发明制得的胶原纳米纤维膜无细胞毒性，溶血性和抗原性低，但是由于所制备的纳米胶原纤维膜未经过相应的物理或化学交联改性处理，其耐酶解性能和降解性能值得商榷，而且专利里也未曾提及该方面的相应处理办法，值得进一步探讨。

王培伟等（静电纺壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维的细胞相容性，中国组织工程研究与临床康复，2008,12（1）：5-9）报道了一种制备电纺壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维的方法，以六氟异丙醇/三氟乙酸为混合溶剂，配制质量分数为0.06%的壳聚糖和质量分数为0.08%的胶原蛋白溶液，并按一定比例互配进行电纺。制备好的支架材料在室温下经25%戊二醛蒸气交联12h后真空干燥，即得到该电纺纤维。崔新爱等（静电纺胶原/丝素复合微纳米纤维的制备及细胞相容性研究，中国生物医学工程学报，2012,31（2）：0291-0298）报道了一种胶原/丝素复合微纳纤维的制备方法，其要点为：以六氟异丙醇为溶剂，将胶原和丝素按一定质量比共混电纺，然后经戊二醛蒸汽交联12h后得到了相应的支架材料。该类方法虽然意识到对所得到的胶原/壳聚糖或胶原/丝素电纺纤维进行相应的化学改性，以达到电纺纤维合适的物理化学性能，但是仍然存在一定的局限性。其一，所用的交联剂为戊二醛，该交联剂在大量的文献报道中已经被证实具有一定的生物毒副作用，尤其是随着经过戊二醛交联的生物制品在使用的过程中有从制品中析出进而导致组织钙化的风险；其二，该方法需要经过两个独立的步骤，首先是静电纺，其次是化学交联，未能将两者有效地结合在一起；再者，所使用的电纺溶剂为强刺激性、强毒副作用的氟代醇系列，过程不友好。

中国发明专利CN101705580A公开了一种采用无毒副作用的磷酸盐水溶液/无水乙醇溶液为胶原的溶剂进行静电纺丝制备胶原超细纤维膜材料的方法。该方法提到了所配制的胶原溶液中胶原的质量百分浓度为10%～30%，这是一组非常令人鼓舞的数字。但是在其实施例一和二中，其初始胶原原料的重均分子量（Mw）为10万，诚如所知，胶原的种类很多，但就其最具代表性的种类之一的I型胶原，也是含量最为丰富的胶原，其分子量在30万以上，大量文献报道中提到的胶原静电纺丝所指的即为I型胶原，其分子量均在30万以上，只有其降解产物——明胶的分子量才可能为10万左右（Zeugolis, D.I., Khew, S.T., Yew, E.S., etal, Electro-spinning of pure collagen nano-fibres-just an expensive way to make gelatin?[J]. Biomaterials, 2008, 29 (15): 2293-2305; Zhong S.P., Teo W.E., Zhu X. et al, Development of  novel collagen-GAG nanofibrous scaffold via electrospinning[J]. Materials science and engineering C, 2007 (27): 724-734）。因此，我们冒昧地推测，采用该环境友好的溶剂溶解的“胶原”实为明胶，而明胶相比胶原是易溶于水的，因此该发明公开的内容虽然在环境友好溶剂方面有所涉及，但是在胶原的静电纺丝制备方面尚存在一定的误区，并未从结构上对胶原和明胶加以区别，是值得后续科研工作者努力的方向。且对所得到的超细纤维膜仍未突破传统的交联方式和方法，仍是将纺丝与交联独立开来，所采用的交联剂还需经过大量后续工序除去，难免费时费力。

因此，开发一种环境友好，制备工艺简单的I型胶原静电纺丝方法显得尤为必要，且需要较好地满足如下条件：

    1. 所用I型胶原的溶剂满足无毒副作用，环境友好，操作过程友好；

    2. 所采用的交联方式过程简单，交联剂本身无毒副作用；

    3.所制备的胶原电纺纤维膜材料中胶原成分较常规方法得到更大程度的保留，胶原的构象和结构维持完好。

发明内容

本发明及所附权利要求解决了上述问题，所采用的技术方案为：一种原位交联胶原电纺纤维膜敷料的制备方法。具体而言，本发明涉及静电纺丝技术和原位交联技术在制备胶原基电纺纤维膜敷料中的应用。

一种原位交联胶原电纺纤维膜敷料的制备方法，包括：（1）开发合适的I型胶原良溶剂在尽可能保证胶原完整构象的前提下充分溶解胶原，作为静电纺丝组分A液；（2）采用水溶性的具有交联作用的生物相容性良好的交联剂溶液作为交联组分B液；（3）将组分A和B置于静电纺丝装置中的推注器中进行静电纺丝，使组分A和B在静电纺丝的过程中即发生原位交联，无须像传统静电纺丝步骤中，在纺丝结束后才进行交联或不交联；（4）此后经清洗、冷冻干燥、灭菌后即获得原位交联胶原电纺纤维膜敷料。

本发明中所述静电纺丝组分A液中的胶原质量分数为1%～20%，溶液呈透明均一状，无肉眼可见之杂质。

本发明中所述的I型胶原的良溶剂为咪唑基离子液体1-乙基-3-甲基-咪唑醋酸盐（[EMIM][Ac]）及相应锂盐中的一种或几种（LiAc, LiCl, LiBr, LiClO₄和LiNO₃）的互配体系。其中，总的锂盐占[EMIM][Ac]的质量分数为0.1%～1.0%。

本发明中所述的制备静电纺丝组分A液的制备过程中，胶原在[EMIM][Ac]/锂盐中溶解条件为：所选温度范围为4.0℃±1.0℃，时间24h～48h。

本发明中所述的交联组分B液，其构成为不同质量分数（1.0%～15.0%）的氧化海藻酸盐溶液（alginate dialdehyde, AGA），溶液透明，分散均一，溶剂为去离子水，溶解温度为4.0℃±1.0℃，时间24h～48h。

本发明中组分A和B原位交联的条件为如下方式中一种或结合：（1）分别将组分A与组分B按一定体积比（9：1～1：9）装入静电纺丝装置中的独立推注装置，同时进行静电纺丝，并将所纺纤维在同一接收滚筒上进行接收；（2）将组分A和组分B按一定体积比（9：1～1:9）混合均匀后在同一推注装置中进行静电纺丝。

本发明中所述的静电纺丝条件为：正高压10kv～30kv，负高压-0.5～-1.5kv，纺丝距离为10～30cm，电纺湿度控制在25%～40%，推注速率1～10mL/h。

本发明中所述的水洗方式为采用去离子水浸泡、漂洗，时间为1～3h，由于没有引入戊二醛这类交联剂，只须经过简单的浸泡除去部分盐分即可，大大简化了操作。

本发明中所述的原位交联剂氧化海藻酸盐，购于成都博瑞克生物科技有限公司，为分析纯，其分子量为18000道尔顿左右，使用前经过了透析处理，透析所用透析袋截留分子量为3500～8000道尔顿，透析液为去离子水，透析时间为3～5天，每天换液三次，透析温度为4.0℃±1.0℃。

本发明中所述的I型胶原为市售，可以是从猪皮、牛皮、牛跟腱、鼠尾腱中所提取制备得到的I型胶原，使用前采用电泳装置及圆二色谱对所提胶原的结构进行了鉴定。

本发明中所述的离子液体[EMIM][Ac]、锂盐购于成都科龙化工厂，为分析纯，使用前未经过特殊处理。

本发明中所述的冷冻干燥方式为程序控温冷冻干燥，具体参数如下：第一阶段温度为-34℃，降温速率为1.5℃/min，恒温4h；第二阶段温度为-24℃，升温速率为2℃/min，恒温6h；第三阶段温度为-14℃，升温速率1.5℃/min，恒温6h；第四阶段温度为-4℃，升温速率2℃/min，恒温8h；第五阶段温度为20℃，升温速率为2℃/min，恒温8h。

本发明中所述的灭菌方式为钴-60辐照灭菌，辐照剂量为15-35kGy。

采用上述方法制得的原位交联胶原电纺纤维膜敷料，其主要性能如下：

  (1) 外观：白色或乳白色膜状物，无肉眼可见之杂质；

  (2) 水分含量：≤8%（wt）；

  (3)胶原纤维膜孔径范围：1μm～20μm，纤维直径范围：20～200nm，采用扫描电镜观察，取100处纤维孔径和100根纤维直径的平均值；

  (4)细胞毒性：0级，采用ISO10993-5标准检测。

相比现有技术，本发明具有如下优势：

(1) 采用过程友好的咪唑基离子液体体系[EMIM][Ac]/锂盐体系作为胶原的良溶剂，进行静电纺丝，避免了传统溶剂如六氟异丙醇和三氟乙酸过程不友好的缺陷；

(2) 所采用的溶剂体系相比传统溶剂能够最大程度地保留I型胶原特有的三螺旋结构；

(3) 所采用的交联方式相比传统交联方式，更为便捷，能够将传统的两步法制备合适性能的胶原电纺纤维膜变为一步，且所用交联剂为生物交联剂，交联剂本身无生物毒性，相比传统的戊二醛、碳化二亚胺类交联剂，具有更好的生物相容性。

附图说明

图1 为实施例1中所制备的原位交联胶原电纺纤维膜敷料的表面形貌图；图2为实施例2中胶原经[EMIM][Ac]/LiAc溶剂体系溶解前和溶解后的胶原样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳图（第一条带为Marker，第二条带为溶解前胶原，第三条带为溶解后胶原）；图3为实施例3中所制备的原位交联胶原电纺纤维膜敷料在与成纤维细胞共培养7天以后的表面形貌图。

实施方式

下面结合附图以及适当的数据图表，通过实施例对本发明进行具体描述，但有必要再次指出的是，本实施例只用于对本发明进行进一步说明，而不能理解为对本发明之保护范围的限定，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容做出一些非本质的改进或调整。

实施例1

(1)制备胶原电纺组分A液，首先将LiCl溶于[EMIM][Ac]中，其质量分数为0.1%，然后采用该溶剂体系溶解牛皮I型胶原，其中胶原质量分数为5%，在整个溶解过程中，保持温度为4℃，溶解时间为24h；

(2)制备交联组分B液，首先将市售氧化海藻酸钠行透析处理，透析袋截留分子量为3500道尔顿，透析液为去离子水，透析时间为3天，此后将其溶于去离子水，配制为质量分数为3%的溶液，溶解时间为48h，静置脱泡；

(3)将组分A与组分B按体积比4：6混合均匀，超声脱泡后置于静电纺丝装置中的同一推注装置中进行静电纺丝，正高压为18kv，负高压为-1kv，纺丝距离为10cm，电纺湿度为25%，推注速率为2mL/h，电纺时间为72h；

(4)将电纺所得纤维膜浸泡在去离子水中1h，洗去盐分后进行程序控温冷冻干燥；冻干工艺为：第一阶段温度为-34℃，降温速率为1.5℃/min，恒温4h；第二阶段温度为-24℃，升温速率为2℃/min，恒温6h；第三阶段温度为-14℃，升温速率1.5℃/min，恒温6h；第四阶段温度为-4℃，升温速率2℃/min，恒温8h；第五阶段温度为20℃，升温速率为2℃/min，恒温8h；

(5)将冻干后纤维膜经过钴-60辐照灭菌后密封贮存，辐照剂量为20kGy。

实施例2

(1) 制备胶原电纺组分A液，首先将LiAc溶于[EMIM][Ac]中，其质量分数为0.5%，然后采用该溶剂体系溶解猪皮I型胶原，其中胶原质量分数为9%，在整个溶解过程中，保持温度为4℃，溶解时间为24h，静置脱泡；

(2) 制备交联组分B液，首先将市售氧化海藻酸钠进行透析处理，透析袋截留分子量为5000道尔顿，透析液为去离子水，透析时间为4天，此后将其溶于去离子水，配制为质量分数为6%的溶液，溶解时间为48h，超声脱泡；

(3) 将组分A与组分B按体积比5：5超声脱泡后置于静电纺丝装置中的独立推注装置中进行静电纺丝，正高压为20kv，负高压为-1kv，纺丝距离为20cm，电纺湿度为30%，推注速率为5mL/h，电纺时间为72h；

(4) 将电纺所得纤维膜浸泡在去离子水中2h，洗去盐分后进行程序控温冷冻干燥；冻干工艺为：第一阶段温度为-34℃，降温速率为1.5℃/min，恒温4h；第二阶段温度为-24℃，升温速率为2℃/min，恒温6h；第三阶段温度为-14℃，升温速率1.5℃/min，恒温6h；第四阶段温度为-4℃，升温速率2℃/min，恒温8h；第五阶段温度为20℃，升温速率为2℃/min，恒温8h；

(5) 将冻干后纤维膜经过钴-60辐照灭菌后密封贮存，辐照剂量为25kGy。

实施例3

(1) 制备胶原电纺组分A液，首先将LiClO₄溶于[EMIM][Ac]中，其质量分数为1%，然后采用该溶剂体系溶解牛跟腱I型胶原，其中胶原质量分数为15%，在整个溶解过程中，保持温度为4℃，溶解时间为48h，静置脱泡；

(2) 制备交联组分B液，首先将市售氧化海藻酸钠进行透析处理，透析袋截留分子量为8000道尔顿，透析液为去离子水，透析时间为3天，此后将其溶于去离子水，配制为质量分数为13%的溶液，溶解时间为48h，超声脱泡；

(3) 将组分A与组分B按体积比6：4超声脱泡后置于静电纺丝装置中的独立推注装置中进行静电纺丝，正高压为30kv，负高压为-1.5kv，纺丝距离为25cm，电纺湿度为30%，推注速率为8mL/h，电纺时间为72h；

(4) 将电纺所得纤维膜浸泡在去离子水中3h，洗去盐分后进行程序控温冷冻干燥；冻干工艺为：第一阶段温度为-34℃，降温速率为1.5℃/min，恒温4h；第二阶段温度为-24℃，升温速率为2℃/min，恒温6h；第三阶段温度为-14℃，升温速率1.5℃/min，恒温6h；第四阶段温度为-4℃，升温速率2℃/min，恒温8h；第五阶段温度为20℃，升温速率为2℃/min，恒温8h；

(5)将冻干后纤维膜经过钴-60辐照灭菌后密封贮存，辐照剂量为30kGy。