一种杜仲籽粕蛋白酶解制备ACE抑制肽的方法

摘要

本发明公开了一种杜仲籽粕蛋白酶解制备ACE抑制肽的方法，该方法步骤如下：杜仲籽粕蛋白粉溶解于去离子水，配置成蛋白液；蛋白液置于恒温水浴锅中，对蛋白质进行热变性处理；变性处理后溶液冷却至室温，用1mol/L NaOH调节pH值；加入碱性蛋白酶，溶解并混合均匀；加酶后蛋白液置于恒温水浴锅中，酶解；酶解完成后升高水浴温度，酶解液加热，使蛋白酶变性失活，终止酶解反应；酶解液冷却至室温，于台式高速离心机离心，倾取上清液；上清液经超滤，滤过液经真空冷冻干燥即得ACE抑制肽粉末产品。本发明操作方法简单，将杜仲翅果蛋白转变为分子质量更小的功能肽。此外，本发明方法制备的ACE抑制肽对高血压患者有降压作用，而对血压正常者无影响，具有良好的发展前景。

说明书

技术领域

本发明属于ACE抑制肽制备领域，尤其涉及一种杜仲籽粕蛋白酶解制备 ACE抑制肽的方法。

背景技术

杜仲(EucomMol/Lia Ulmoides Oliv)是我国特有的名贵中药材和经济树种， 主要分布在湖南、湖北、陕西、四川、重庆、贵州等西部省市，武陵山区建有 规模化的杜仲商品生产基地，仅湖南西部地区就有杜仲40万亩，成片20余万 亩，开发应用前景十分广阔。长期以来，对杜仲的利用仅仅限于杜仲皮，杜仲 果实为翅果，扁平，蛋白质含量约15％，含有18种氨基酸，其中人体必需氨 基酸齐全且占总氨基酸含量的32.3％，谷氨酸含量最高。

心脑血管疾病已成为危害人类健康的头号杀手，而高血压是最常见的心血 管疾病之一。中国是高血压病高发的国家之一，2012年我国成人高血压患病率 为18.6％，患者数量达1.6亿，且每年近100万患者因此病而死亡。高血压成 为继肿瘤之后的第二个威胁人类健康的慢性疾病，如何预防和治疗高血压己成 为全社会共同关注的焦点。

目前，对于高血压病多是采用合成的ACE抑制剂作为主要的治疗药物，但 存在副作用明显、长期服药导致依赖性等不安全因素。因此，寻找安全性高、 降血压效果好的ACE抑制剂已成为国内外研究者所关注的重要课题。

食物蛋白质是人体新陈代谢过程中极为重要的营养物质，具有提供构成机 体所需氨基酸和能量供应等功能。有关研究表明，以数个氨基酸结合而成的功 能肽具有比游离氨基酸更好的消化吸收性能；功能肽还有原蛋白质或其组成氨 基酸所没有的广泛的生理调节功能，如促进钙吸收、降血压、降低胆固醇、免 疫调节等，特别是具有降血压活性的ACE抑制肽成为生物活性肽研究领域的热 点之一。

血管紧张素转化酶(Angioensin Converting Enzyme，ACE，EC3.4.15.1)是 一种含锌的二肽羧酶，能被氯离子激活并具有较宽的底物特异性。ACE广泛分 布于哺乳动物的组织中，尤其在血管内皮细胞、上皮吸收细胞、神经上皮细胞 及雄性生殖细胞中，ACE以膜结合的胞外酶形式存在。在肾素-血管紧张素系 统(RAS)和激肽释放酶-激肽系统(KKS)中，ACE对机体血压和心血管功能 起着重要的调节作用。在RAS中，ACE处于核心地位，起限速酶的作用。ACE 催化不具有活性的血管紧张素I(十肽)转化为具有强烈收缩血管作用的血管 紧张素II(八肽)，同时，血管紧张素II也能刺激促进醛固酮的分泌进而促进肾 脏对水、Na⁺、K⁺的重吸收，引起钠贮量和血容量的增加，使血压升高。在KKS 中，ACE能催化舒缓激肽的降解。另外，ACE还能催化与心血管系统具有相互 作用的神经肽、脑啡肽等的降解。因此，抑制ACE活性被认为是治疗高血压重 要而有效的方法，在研发治疗高血压药物过程中，ACE的抑制成为重要的靶标。 目前，高效、特异的ACE抑制剂在治疗高血压病和充血性心力衰竭中发挥着重 要作用。

酶解法是目前制备ACE抑制肽应用最多的方法，其原理是植物性或动物性 原料经预处理后得到含量较高的蛋白质，然后加入特异性蛋白酶水解一定时间， 分离获得具ACE抑制活性的多肽产物。Yun HG和Kim SK(2001)以鳍鱼皮 为原料提取鱼皮凝胶，然后以碱性蛋白酶、链霉蛋白酶、胶原酶顺序进行分步 水解，纯化获得两种三肽GPL和GPM。Qian zJ(2007)分别使用碱性蛋白酶、 中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、a-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶水解牛蛙肌 肉蛋白，其中碱性蛋白酶水解物显示最高的ACE抑制活性，对其纯化后获得 ACE抑制活性较高的十二肽(GAAELPCSADWW)。王毅梅(2011)以草鱼肉 为原料，通过碱性蛋白酶水解制备ACE抑制三肽(LPM)，IC₅₀值达0.00534 mg/mL。

自发现食源性ACE抑制肽以来，因其安全性高、无副作用、人体吸收快等 优点而备受科研工作者关注。随着对其制备方法、作用机理等研究的深入，ACE 抑制肽在开发降血压功能的保健食品中具有极大的应用前景，日本己经进行 ACE抑制肽的规模化生产。然而，我国目前对于食源性ACE抑制肽的研究仍 处于起步阶段，对于原料的来源、制备工艺、产品精制、实验室成果产业化等 方面仍然存在较多的问题。

1977年首个ACE抑制类药物Captopril(卡托普利)由Cushman等成功合 成以来，ACE抑制剂(ACE Inhibitor，ACEI)类药物在高血压临床治疗中的作 用得到了医学界的普遍认可，成为高血压治疗的前线药物。食源性ACE抑制肽 通常是在温和条件下由蛋白酶水解蛋白质而获得，食用安全性高；且共同的突 出优点为对高血压患者具有降压作用，而对血压正常者无影响。酶法条件温和， 氨基酸不被破坏，构型不发生改变，水解杜仲翅果蛋白将其转变为分子质量更 小的肽，可更好地被人体消化吸收。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种杜仲籽粕蛋白酶解制备ACE抑制肽的 方法，旨在解决现有技术提供的制备ACE抑制剂的来源狭窄，制备过程繁琐， ACE抑制剂类药物副作用大的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种杜仲籽粕蛋白酶解制备ACE抑制肽的方 法，该方法步骤如下：

杜仲籽粕蛋白粉溶解于去离子水，配置成蛋白液；

蛋白液置于恒温水浴锅中，对蛋白质进行热变性处理；

变性处理后溶液冷却至室温，用1mol/L NaOH调节pH值；

加入碱性蛋白酶，溶解并混合均匀；

加酶后蛋白液置于恒温水浴锅中，酶解；

酶解完成后升高水浴温度，酶解液加热，使蛋白酶变性失活，终止酶解反 应；

酶解液冷却至室温，于台式高速离心机离心，倾取上清液；

上清液经超滤，滤过液经真空冷冻干燥即得ACE抑制肽粉末产品。

进一步，酶解杜仲籽粕蛋白制备ACE抑制肽采用胃蛋白酶。

进一步，超滤膜截留的分子量为2000。

进一步，蛋白液的质量浓度为5.0％。

进一步，蛋白液置于80-90℃恒温水浴锅中加热10min。

进一步，用1mol/L NaOH调节pH值为9.5-10.5。

进一步，按11000-12000U/g酶用量加入碱性蛋白酶。

进一步，加酶后蛋白液置于45-50℃恒温水浴锅中酶解2.5-3.0h。

进一步，酶解液于90-100℃加热10min。

进一步，高速离心机中4000-4500r/min离心10min，倾取上清液。

本发明提供的杜仲籽粕蛋白酶解制备ACE抑制肽的方法操作方法简单，水 解杜仲翅果蛋白将杜仲翅果蛋白转变为分子质量更小的肽，制备的食源性ACE 抑制肽可更好地被人体消化吸收，在温和条件下由蛋白酶水解蛋白质而获得， 食用安全性高；此外，本发明方法制备的ACE抑制肽对高血压患者具有降压作 用，而对血压正常者无影响。

附图说明

图1是本发明实施例提供的杜仲籽粕蛋白酶解制备ACE抑制肽的方法流程 图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。

图1示出了本发明提供的杜仲籽粕蛋白酶解制备ACE抑制肽方法的流程。 为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。

如图1所示，本发明的实施例提供的一种杜仲籽粕蛋白酶解制备ACE抑制 肽的方法，该方法步骤如下：

本发明的杜仲籽粕蛋白酶解制备ACE抑制肽的方法，该方法步骤如下：

杜仲籽粕蛋白粉溶解于去离子水，配置成蛋白液；

蛋白液置于恒温水浴锅中，对蛋白质进行热变性处理；

变性处理后溶液冷却至室温，用1mol/L NaOH调节pH值；

加入碱性蛋白酶，溶解并混合均匀；

加酶后蛋白液置于恒温水浴锅中，酶解；

酶解完成后升高水浴温度，酶解液加热，使蛋白酶变性失活，终止酶解反 应；

酶解液冷却至室温，于台式高速离心机离心，倾取上清液；

上清液经超滤，滤过液经真空冷冻干燥即得ACE抑制肽粉末产品。

作为本发明实施例的一优化方案，酶解杜仲籽粕蛋白制备ACE抑制肽采用 胃蛋白酶。

作为本发明实施例的一优化方案，超滤膜截留的分子量为2000。

作为本发明实施例的一优化方案，蛋白液的质量浓度为5.0％。

作为本发明实施例的一优化方案，蛋白液置于80-90℃恒温水浴锅中加热 10min。

作为本发明实施例的一优化方案，用1mol/LNaOH调节pH值为9.5-10.5。

作为本发明实施例的一优化方案，按11000-12000U/g酶用量加入碱性蛋白 酶。

作为本发明实施例的一优化方案，加酶后蛋白液置于45-50℃恒温水浴锅 中酶解2.5-3.0h。

作为本发明实施例的一优化方案，酶解液于90-100℃加热10min。

作为本发明实施例的一优化方案，高速离心机中4000-4500r/min离心 10min，倾取上清液。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

如图1所示，本发明实施例的杜仲籽粕蛋白酶解制备ACE抑制肽方法包括 以下步骤：

S101：杜仲籽粕蛋白粉溶解于去离子水，配置成蛋白液；

S102：蛋白液置于恒温水浴锅中，对蛋白质进行热变性处理；

S103：变性处理后溶液冷却至室温，用1mol/L NaOH调节pH值；

S104：加入碱性蛋白酶，溶解并混合均匀；

S105：加酶后蛋白液置于恒温水浴锅中，酶解；

S106：酶解完成后升高水浴温度，酶解液加热，使蛋白酶变性失活，终止 酶解反应；

S107：酶解液冷却至室温，于台式高速离心机离心，倾取上清液；

S108：上清液经超滤，滤过液经真空冷冻干燥即得ACE抑制肽粉末产品。

本发明的具体存在步骤为：

1、杜仲籽粕蛋白粉溶解于去离子水，配置成质量浓度为5.0％的蛋白液；

2、蛋白液置于恒温水浴锅中，于80-90℃加热10min，对蛋白质进行热变 性处理；

3、变性处理后溶液冷却至室温，用1mol/L NaOH调节pH值为9.5-10.5；

4、按11000-12000U/g酶用量加入碱性蛋白酶，溶解并混合均匀；

5、加酶后蛋白液置于恒温水浴锅中，于45-50℃酶解2.5-3.0h；

6、酶解完成后升高水浴温度，酶解液于90-100℃加热10min，使蛋白酶变 性失活，终止酶解反应；

7、酶解液冷却至室温，于台式高速离心机中4000-4500r/min离心10min， 倾取上清液；

8、上清液经20kDa PES膜超滤，滤过液经真空冷冻干燥即得ACE抑制肽粉 末产品。

以杜仲籽粕蛋白为原料，采用胃蛋白酶酶解制备ACE抑制肽，并采用截留 分子量为2000的超滤膜超滤，滤过液冷冻干燥即得产品。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。