一种维持类囊体膜稳定的植物耐热相关蛋白及其应用

摘要

本发明涉及一种维持类囊体膜稳定的植物耐热相关蛋白及其应用。具体地，经过对植物基因的大量筛选，本发明人意外地获得一个与维持类囊体膜稳定性相关的植物耐热基因，所述基因为植物热激转录因子A2(HfA2)，本发明的基因及蛋白能够有效维持类囊体膜的热稳定性，提高植物在热胁迫下的生存能力及光合效率，提高作物产量，避免或减少高温对植物产生的不利影响。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术与植物学领域，具体地，本发明涉及一种维持类囊体膜稳定的植物耐热相关蛋白及其应用。

背景技术

由于二氧化碳排放量的增加，地球温室效应不断加剧，导致全球性气候变暖。自然环境下生长的植物对温度的升高十分敏感，易出现生长障碍，特别是一些大春作物(如水稻、玉米等)在抽穗、灌浆期间，很容易受到高温天气的影响，造成农作物的减产。国际水稻研究所的数据表明，1998-2003年，气温每升高1℃，全球农作物减产10％。据专家预测，未来100年全球气温可能上升5-6℃，我国到了2050年，全国平均气温将上升2.2℃。

另一方面，根据国际粮农组织(FAO)的分析数据，到2050年，世界人口将突破100亿。随着人口的进一步增加，农业面临的压力进一步增加，世界范围内的粮食短缺状况将长期存在，并持续恶化。受到全球气候变暖的影响，大量的植物会出现生长障碍、甚至死亡，不仅生态平衡遭到破坏，粮食安全也受到威胁。

类囊体膜是植物光合作用的场所，也是逆境因子作用的敏感位点。光系统II(PS II)是植物对热最敏感的膜蛋白复合体之一，热胁迫会在极短的时间内导致类囊体膜的结构发生改变，从而对光合作用和植物的其他生理过程产生影响。深入理解类囊体膜稳定性的机制，有助于提高在逆境环境，尤其是高温胁迫的条件下植株的光合效率。

迄今为止，本领域还未发现能维持类囊体膜的稳定性的耐热蛋白。因此本领域迫切需要大量筛选并开发与植物耐热和类囊体膜稳定相关的基因及蛋白，以准确有效地改变植物农艺性状，实现植物的品系改良，更好地调控植物的生长发育。

发明内容

本发明的目的就是提供一种维持类囊体膜稳定的植物耐热相关蛋白。

本发明的另一目的就是所述蛋白的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的HsfA2多肽或其编码基因的用途，所述用途是选自下组的一种或多种用途：

(1)所述多肽或其编码基因用于维持植物类囊体膜的热稳定性；

(2)所述多肽或其编码基因用于提高植物抵抗高温胁迫的能力；

(3)所述多肽或其编码基因用于提高植物高温下的光合效率。

在另一优选例中，所述的HsfA2多肽任选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.：6所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.：6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、具有维持植物类囊体膜的热稳定性功能的由(i)衍生的多肽；或

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.：6所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)、具有维持植物类囊体膜的热稳定性功能的多肽。

在另一优选例中，所述的HsfA2多肽的编码基因选自下组：

(A)编码如SEQ ID NO.：6所示多肽的多核苷酸；

(B)序列如SEQ ID NO.：1所示的多核苷酸；

(C)核苷酸序列与SEQ ID NO.：1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；

(D)如SEQ ID NO.：1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(E)与(A)-(D)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的编码基因编码上述选自(i)、(ii)或(iii)的HsfA2多肽。

在另一优选例中，所述的HsfA2多肽或其编码基因来源于十字花科植物。

在另一优选例中，所述的HsfA2多肽或其编码基因来源于拟南芥(如Col-O生态型拟南芥)或其变体。

在本发明的第二方面，提供了一种提高植物抵抗高温胁迫能力的方法，包括步骤：提高所述植物中HsfA2多肽的表达或活性。

在本发明的第三方面，提供了一种提高植物类囊体膜热稳定性的方法，包括步骤：提高所述植物中HsfA2多肽的表达或活性。

在本发明的第四方面，提供了一种提高植物高温下的光合效率的方法，包括步骤：提高所述植物中HsfA2多肽的表达或活性。

在另一优选例中，适用于上述方法的所述植物包括(但并不限于)：水稻、小麦、玉米、大豆、高粱、棉花、蔬菜、或十字花科植物(如拟南芥)。

在另一优选例中，本发明的第二-第四任一方面所述的方法包括步骤：

(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有HsfA2多肽的编码序列；

(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使HsfA2多肽的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(c)选择已转入HsfA2多肽编码序列的植物细胞、或组织、或器官；

(d)将步骤(c)中的植物细胞、或组织、或器官再生为植株。

在另一优选例中，所述的编码基因编码上述选自(i)、(ii)或(iii)的HsfA2多肽。

在本发明的第五方面，提供了一种改造植物的方法，包括步骤：

(a1)提高所述植物中HsfA2多肽的表达水平或活性；或

(a2)降低所述植物中HsfA2多肽的表达水平或活性。

在另一优选例中，所述方法(a1)用于提高植物抵抗高温胁迫，提高植物类囊体膜热稳定性，和/或提高植物高温下光合效率。

在另一优选例中，所述方法(a2)用于降低植物抵抗高温胁迫，降低植物类囊体膜热稳定性，和/或降低植物高温下光合效率。

在另一优选例中，在(a2)中降低所述植物中HsfA2多肽的表达水平或活性包括步骤：特异性敲除或干扰HsfA2多肽的编码基因的表达。

在另一优选例中，所述植物选自下组：水稻、小麦、玉米、大豆、高粱、棉花、蔬菜、或十字花科植物(如拟南芥)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示RT-PCR法对WT、rps1突变体和35S:HsfA2rps1三种基因型植株的HsfA2基因的表达水平测定结果，在WT和rps1突变体中，HsfA2基因的表达水平较低，而在35S:HsfA2rps1株系中，HsfA2基因的表达水平获得极大地提高，由于35S启动子的存在，HsfA2基因是组成型表达的。

图2显示了对WT、rps1突变体和35S:HsfA2rps1三种基因型植株幼苗的耐热性表观分析，组成型表达HsfA2的35S:HsfA2rps1基因型植株幼苗将rps1突变体的耐热性回复至近野生型的水平。

图3显示了对WT、rps1突变体和35S:HsfA2rps1三种基因型成年植株的耐热性表观分析，组成型表达HsfA2的35S:HsfA2rps1基因型植株幼苗将rps1突变体的耐热性回复至近野生型的水平。

图4显示了成年离体叶片经38℃不同时间(0h，1h，4h)热处理，透射电镜分析叶绿体超微结构变化结果，离体叶片材料取自WT，rps1和35S:HsfA2rps1植株(21d)完全展开的莲座叶叶片，棒状基线(bar)＝1μm；38℃热处理1h，rps1突变体的叶绿体类囊体膜结构出现不规则的扭曲；到了4h时，rps1突变体类囊体膜结构开始解体；而WT的类囊体系统，包括基粒和基质膜结构仍维持在近初始状态的构象；在rps1突变体中过表达HsfA2(35S:HsfA2rps1植株)足以回复突变体的类囊体稳定性至近野生型状态。

图5为用原子力显微镜(AFM)成像法，显示去膜叶绿体类囊体基粒表面形貌，棒状基线(bar)＝2μm；结果显示，热胁迫导致rps1突变体去膜叶绿体中的类囊体基粒结构大幅减少(去膜叶绿体的体积明显变小)，但WT和35S:HsfA2rps1的去膜叶绿体的体积变化较小。

图6显示光化学效率分析结果，分别取WT，rps1和35S:HsfA2rps1植株(21d)莲座叶第五位叶片用于热处理(38℃)，在不同的时间点(0h，1h，2h，4h)，用通用的方法测定叶片PSII光化学效率(Fv/Fm)。误差棒表示标准偏差(n＝6)；过表达HsfA2能回复由于热胁迫导致的rps1突变体Fv/Fm值显著降低的现象，在35S:HsfA2rps1植株中类囊体的稳定性得到极大改善。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量筛选植物基因及其相关元件，意外地获得一个与维持类囊体膜稳定性相关的植物耐热基因。具体地，所述基因为植物热激转录因子A2基因(HsfA2)，本发明的基因及蛋白能够有效维持类囊体膜的热稳定性，提高植物在热胁迫下的生存能力及光合效率，提高作物产量，避免或有效减少高温对植物产生的不利影响。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“本发明基因”、“HsfA2基因”、“本发明的维持类囊体膜稳定基因”、“本发明的耐热相关基因”可以互换使用，都是指来源于植物(较佳地来自拟南芥或类似植物)的热激转录因子A2基因及其变体。本发明基因的一种典型核苷酸序列如SEQ ID NO.：1所示。

如本文所用，术语“本发明多肽”、“HsfA2多肽”、“本发明的维持类囊体膜稳定多肽”、“本发明的耐热相关多肽”可以互换使用，都是指来源于植物(较佳地来自拟南芥或类似植物)的热激转录因子A2蛋白及其变体。本发明多肽的一种典型的氨基酸序列如SEQ ID NO.：6所示。

如本文所用，术语“植物”没有特别的限制，包括(但不限于)：花卉植物、水果植物、林业植物、蔬菜、农作物等，例如水稻、小麦、玉米、大豆、高粱等。

水果植物包括(但不限于)：柑橘科、蔷薇科、葫芦科、芭蕉科的植物等。

蔬菜植物包括(但不限于)：菊科、茄科、唇形科、伞形科、十字花科的植物。

农作物例如但不限于：禾本科、石蒜科的植物等。

在本发明的一个优选例中，所述植物选自十字花科，更佳地为拟南芥属植物。

本发明提供了一种维持类囊体膜稳定性相关的植物耐热基因，所述基因为来源于植物(较佳地来源于野生型拟南芥或其变体拟南芥)的HsfA2基因。HsfA2基因也称为热激转录因子A2基因。所述基因一种优选的核苷酸序列如SEQ IDNO.：1所示。本发明的基因可以有效地维持类囊体膜的热稳定性，提高植物在热胁迫下的生存能力及光合效率，提高作物产量，避免或有效减少高温对植物产生的不利影响。因此本发明的基因可以用于特异性改善植物的耐热性能。

本发明的基因序列还包括与SEQ ID NO.：1具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的核酸，所述核酸序列也能有效维持类囊体膜的热稳定性，提高植物在热胁迫下的生存能力及光合效率。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。

在本发明中，所述基因的变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

在本发明中，SEQ ID NO.：1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，生成SEQ ID NO.：1的衍生序列。由于密码子的简井性，即使与SEQ IDNO.：1的同源性较低，也能基本编码出SEQ ID NO.：1所编码的氨基酸序列。另外，“在SEQ ID NO.：1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸，生成SEQ ID NO.：1的衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.：1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。这些变异形式包括(但并小限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

应理解，尽管本发明的实例中提供的来源于拟南芥，但是来源于其它类似的植物(尤其是与拟南芥属于同一科或属的植物)的、与本发明的基因序列(优选地，序列如SEQ ID NO.：1所示)具有一定同源性的HsfA2基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该序列。

本发明还提供了一种维持类囊体膜稳定性相关的植物耐热多肽及其变体，在本发明的一个优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.：6所示。本发明的多肽能够有效地维持类囊体膜的热稳定性，提高植物在热胁迫下的生存能力及光合效率，提高作物产量，避免或有效减少高温对植物产生的不利影响。

本发明还包括与本发明的SEQ ID NO.：6序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽。

所述“相同或相似功能”是指：“维持类囊体膜的热稳定性、抗热胁迫”。

本发明中，所述的多肽变体是如SEQ ID NO.：6所示的氨基酸序列，经过若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变多肽的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。

表1

本发明还包括所要求保护的多肽类似物。这些类似物与天然多肽(或蛋白质)(如SEQ ID NO.：6)差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

本发明还提供了一种包括本发明基因的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明的目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。

作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。在本发明的实例中，所述的重组载体是双元载体pBI101.1。

本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用。

包括本发明基因、表达盒或的载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

作为本发明的一种优选方式，制备转基因植物的方法是：将携带启动子和目的基因(两者可操作地连接)的载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是拟南芥、烟草、果树等。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明的主要优点：

(1)本发明的基因及多肽能够有效维持类囊体膜的热稳定性；

(2)本发明的基因及多肽可以提高植物在热胁迫下的生存能力及光合效率，提高作物产量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

构建p35S:HsfA2载体

利用RT-PCR的方法扩增HsfA2的cDNA编码区序列。具体步骤如下：

使用RNeasy Plant Mini kit(购于Qiagen公司)，按照说明书的方法分离col-O型拟南芥的总RNA，分离到的总RNA使用M-MLV逆转录酶(购于TOYOBO公司)进行反转录，获得cDNA。

以cDNA做为模板，使用Primer star DNA聚合酶(购于Takara公司)进行PCR反应，扩增HsfA2的cDNA编码区序列。所用引物如下：

上游121A2-F  -UP 5′-AATCTAGACTCTGAGCTTATGGATTTGAG-3′(SEQ ID NO.：2)，其中下划线部分(TCTAGA)部分为酶切位点XbaI；

下游12lA2-R  -DO 5′-AAGAGCTCGACCGCAACAAGTAGATGTG-3′(SEQ ID NO.：3)，其中下划线部分(GAGCTC)部分为酶切位点SacI。

将得到的DNA扩增产物，连接到市售的pMDl9-T载体上，并进行测序。测序结果表明，本实施例扩增获得的HsfA2序列与GenBank序列完全符合。

HsfA2全序列如下：

ctctgagctt atggatttga gataaacaac gaaaatggaa gaactgaaag tggaaatgga     60

ggaagaaacg gtgacgttta ctggttctgt agcggcttct tcatctgtag gatcctcttc    120

ctctcctaga ccaatggaag ggcttaacga aacagggcca ccaccgtttc tgactaagac    180

ttacgaaatg gtggaagatc cggcgacgga cacggtggtt tcttggagta atggtcgtaa    240

cagctttgtg gtgtgggatt ctcataagtt ctcaacaact ctccttccac gttacttcaa    300

gcatagcaat ttctcaagtt ttattcgtca gctcaatact tatggattca gaaagattga    360

tccagataga tgggaatttg caaatgaagg gtttttagca ggacaaaagc atctcttgaa    420

gaacatcaaa agaaggagga acatgggttt gcagaatgtg aatcagcaag gatctgggat    480

gtcatgtgtt gaggttgggc aatacggttt cgacggggag gttgagaggt tgaagaggga    540

tcatggtgtg cttgtagctg aggtagttag gttgaggcaa cagcaacaca gctccaagag    600

tcaagttgca gctatggagc aacggttgct tgttactgag aagagacagc agcagatgat    660

gacgttcctt gccaaggcgt tgaacaatcc gaactttgtt cagcagtttg cggttatgag    720

taaagagaag aagagtttgt ttggtttgga tgtggggagg aaacggaggc ttacttctac    780

tccaagcttg gggactatgg aggagaattt gttacatgat caagagtttg atagaatgaa    840

ggatgatatg gaaatgttgt tcgctgcagc aatcgatgat gaggcgaata attcgatgcc    900

tactaaggag gaacaatgtt tggaggctat gaatgtgatg atgagagatg gtaatttgga    960

agcagcgttg gatgtgaaag tggaagattt ggttggttcg cctttggatt gggacagcca   1020

agatctacat gacatggttg atcaaatggg ttttcttggt tcggaacctt aactatacgg   1080

tattaacaca tctacttgtt gcggtc                                        1106

(SEQ ID NO.：1)

2.测序后，用Xba I/Sac I切下HsfA2的cDNA部分，连入经XbaI/SacI双酶切的市售双元表达载体pBI121中，转入大肠杆菌DH5α。

3.提质粒，酶切鉴定正确的质粒转入市售的农杆菌Gv3101。从农杆菌中提取质粒再转入DH5α中，提取质粒并且酶切验证，确定正确的质粒已经转入农杆菌中。

实施例2

获得转基因植物

将实施例1获得农杆菌采用喷洒法转化野生型拟南芥col-O型，使之产生转基因植株。结果获得35个转基因株系，这些株系在含有卡那霉素的PNS培养基上均能正常生长。

通过RT-PCR的方法对HsfA2的过表达株系进行筛选，使用的引物如下：

HsfA2+5′-ATGGAAGAACTGAAAGTGGAAATG-3′(SEQ ID NO.：4)；

HsfA2-5′-GATCAATCTTTCTGAATCCATAAG-3′(SEQ ID NO.：5)。

结果表明，筛选获得的株系均为HsfA2转基因植株。

实施例3

构建组成型表达HsfA2基因的rps1转基因植株(35S:HsfA2rps1)

将实施例1获得农杆菌转化rps1突变体(购于salk)，获得组成型表达HsfA2的rps1转基因植株(35S:HsfA2rps1)。将Kan抗性分离比为3∶1的T2代纯合转基因植株种子用于之后的实验。

实施例4

HsfA2基因表达分析

用RT-PCR法分别对WT、rps1突变体和35S:HsfA2rps1三种基因型植株的HsfA2基因的表达水平进行测定。

结果(图1)表明，在WT和rps1突变体中，HsfA2基因的表达水平较低，而在35S:HsfA2rps1株系中，HsfA2基因的表达水平获得极大的提高，且由于35S启动子的存在，HsfA2基因是组成型表达的。

实施例5

植株耐热性的表观分析

分别对拟南芥幼苗和成年植株进行热处理。方法如下：

拟南芥幼苗获得性耐热分析：1/2MS培养基培养至2.5d的幼苗，经38℃热驯化1h，22℃光下恢复2h，45℃热处理3h，之后转到正常生长条件下恢复7d，拍照，并统计存活率。

拟南芥成年植株持续耐热性分析：种于营养土中长至21d的成年植株经38℃热处理9h，之后在正常生长条件下恢复3d，拍照。

耐热性分析结果显示，在幼苗(图2)和成年植株(图3)两个层面，组成型表达HsfA2都能将rps1突变体的耐热性回复至近野生型的水平。野生型存活率大于90％，rps1突变体，35S:HsfA2rps1恢复至近野生型的水平。

实施例6

透射电镜分析类囊体膜系统的稳定性

作为叶绿体内对热胁迫损伤最敏感的组分之一，类囊体膜系统在热胁迫条件时极易变得不稳定，而热休克蛋白能以分子伴侣的形式维持类囊体膜的稳定性。本实施例用透射电镜分别观察了WT，rps1和35S:HsfA2rps1植株在连续热胁迫条件下不同时间点(0h，1h，4h)的叶绿体超微结构的变化。

拟南芥成年植株离体叶片持续耐热性分析方法：取21d成年植株完全伸展的3、4、5叶位叶片，置于含20ml dH₂O和三层滤纸的9cm培养皿中，38℃热处理6h，之后在正常生长条件下恢复3d。

图4显示了成年离体叶片经38℃不同时间(0h，1h，4h)热处理，透射电镜分析叶绿体超微结构变化结果，离体叶片材料取自WT，rps1和35S:HsfA2rps1植株(21d)完全展开的莲座叶叶片，棒状基线(bar)＝1μm。

结果表明，38℃热处理1h，rps1突变体的叶绿体类囊体膜结构出现不规则的扭曲；到了4h时，rps1突变体类囊体膜结构开始解体；而WT的类囊体系统，包括基粒和基质膜结构仍维持在近初始状态的构象；在rps1突变体中过表达HsfA2(35S:HsfA2rps1植株)足以回复突变体的类囊体稳定性至近野生型状态。

实施例7

原子力显微镜分析类囊体膜系统的稳定性

为了进一步确认实施例6中TEM实验观察到的结果，发明人利用原子力显微镜(AFM)观察这三种基因型植株去膜叶绿体(类囊体表面形貌)在热胁迫过程中的变化。提取去膜叶绿体所用材料和处理方式同实施例6。

AFM样品制作方法如下：

向包被好的盖玻片中央滴加100ul去被膜的叶绿体溶液，1000g离心5min，吸取残液，用含2％戊二醛和3％多聚甲醛的RB缓冲液，4℃过夜(大于2h小于3d)固定盖玻片上的样品，RB缓冲液漂洗3-4次，每次2min，dd H₂O₂淋洗1次，空气干燥保存；AFM观察。

图5为原子力显微镜(AFM)成像，显示去膜叶绿体的类囊体基粒表面形貌。棒状基线(bar)＝2μm。AFM成像结果显示，热胁迫导致rps1突变体去膜叶绿体中的类囊体基粒结构大幅减少(去膜叶绿体的体积明显变小)，但WT和35S.HsfA2rps1的去膜叶绿体的体积变化较小。

实施例8

光化学效率分析

分别取WT，rps1和35S:HsfA2rps1植株(21d)莲座叶第五位叶片用于热处理(38℃)，在不同的时间点(0h，1h，2h，4h)，用通用的方法测定叶片PSII光化学效率(Fv/Fm)。误差棒表示标准偏差(n＝6)。

结果(图6)表明，过表达HsfA2能回复由于热胁迫导致的rps1突变体Fv/Fm值显著降低的现象，在35S:HsfA2rps1植株中类囊体的稳定性得到极大改善。因此组成型表达HsfA2可以提高热敏突变体类囊体膜的热稳定性。

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