一株产生广谱高效抗菌肽的枯草芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一株产生广谱高效抗菌肽的枯草芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域，所述菌株具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRT39，保藏号为CGMCC NO.5702。所述BRT39菌株其代谢产物中抗菌肽有较强抑菌作用，其发酵液不仅可以抑制革兰氏阳性细菌，同时对多种革兰氏阴性细菌及真菌均具有较强的抑制作用，发酵液中的抗菌肽酸碱稳定性强、热稳定性较好、光稳定性强、耐有机溶剂强。本发明菌株所产抗菌肽属于天然抗菌剂，无毒副作用，可以用作食品防腐剂、饲料添加剂、农用生物防治剂和动物防病剂，具有无毒、无残留、不产生耐药性、安全性高的优点。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体是一株产生广谱高效抗菌肽的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

在环境条件适宜的情况下，食品中的微生物大量繁殖，导致食品腐败变质。食品加工的 关键问题之一是防腐保鲜。而要想达到延长保藏期，使食品流通并具有商品价值的重要措施之 一是在食品加工过程中添加适量的食品防腐保鲜剂。化学防腐剂如苯甲酸、山梨酸及其盐类、 对羟基苯甲酸酯类等是使用最广泛的食品防腐剂，可以起到抑制或杀灭微生物，阻止、延缓 食品的腐败变质。与工业用防腐剂不同，食品防腐剂的安全卫生条件日益受到人们关注，消费 者对添加化学防腐剂的食品心存顾忌。因此，寻求广谱、高效、低毒、天然食品防腐保鲜剂 是目前食品科学研究中的热点之一。化学防腐剂潜在的安全隐患不容忽视，寻找一种新的代 用品以减少化学防腐剂所造成的潜在危害已为各国科研工作者所瞩目。因此，研究开发高效、 安全、无毒的食品防腐剂成为食品防腐剂的发展方向。天然食品防腐剂作为一类新型安全高 效的防腐剂，已成为食品科学研究的热点之一，目前抗菌肽国内外的研究工作主要集中于医 药、农业、畜牧业等行业方面的应用，而在食品防腐方面的研究甚少；而且抗菌肽多从植物、 昆虫等材料中提取，因提取原料受限和提取工艺复杂、成本较高，难以形成产业化。通过微 生物发酵，获取高活性的抗菌肽是具有重要前景的生产技术。目前，已有许多天然抗菌肽被 研究和发现，但在食品中应用研究较多的细菌素只有尼辛(Nisin)和纳他霉素(Natamycin)， 其他抗菌肽的应用研究较少。

发明内容

本发明的目的是提供一株产生广谱高效抗菌肽的枯草芽孢杆菌及其应用。

本发明提供的具有抗菌作用的菌株具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRT39， 该菌株已于2012年1月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101)，保藏号为CGMCC NO.5702。

所述BRT39菌株在LB固体培养基上37℃培养24h，菌落呈圆形，污白色，边缘不整齐， 不透明，表面褶皱不光滑，边缘不规则扩展。周生鞭毛，能运动，无荚膜，有芽孢，菌体大 小为(0.7～0.9)μm×(3～3.5)μm，芽孢(0.6～0.9)μm×(1.0～1.5)μm，椭圆状，位 于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。液体培养基中生长时，形成皱醭。酪蛋白水解 实验、淀粉水解实验、明胶液化实验、硝酸盐还原实验均为阳性；菌体能够利用葡萄糖、果 糖、蔗糖，不能利用乳糖以及甘露醇；H₂S、接触酶实验、吲哚试验实验均为阴性。

所述BRT39菌株16sRNA基因进行测序。将所得到的序列用Blast软件和Genbank中已 有的16SrDNA序列进行同源性比较，利用软件MEGA4.0构建进化树，结果显示本发明菌株与 枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis(GQ36007543578)聚为一支，序列相似性均为98％，结果 见图1。综合BRT39菌株的形态学特征、生理生化特征及16S rDNA核苷酸序列同源性分析结 果，将菌株BRT39鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)。

所述BRT39菌株其代谢产物中抗菌肽有较强抑菌作用，其发酵液不仅可以抑制革兰氏阳 性细菌，同时对多种革兰氏阴性细菌及真菌均具有较强的抑制作用：对金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureaus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus  cereus)、沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等细菌表现了较强的抑制作用；对黑曲霉(Aspergillus  niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、绿色木霉(Trichoderma viride)、总状毛霉(Mucor  racemosus)等丝状真菌有较强抑制作用。

所述BRT39菌株其代谢产物中抗菌肽酸碱稳定性强，在pH212的环境下，作用1h后， 抗菌活性几乎不变；抗菌肽光稳定性强，紫外线照射5h，抗菌活性不变；热稳定性较好，80℃ 处理1h，抑菌活性不改变；有机溶剂如丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醚处理30min后， 抑菌物质活性保持不变。抗菌肽对蛋白酶较敏感，分别用木瓜蛋白酶、植物蛋白酶、酸性蛋 白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶处理代谢产物中抗菌肽后，抑菌活性下降。

有益效果

1、本发明的菌株BRT39属于国际上公认的食品安全菌种，是1989年美国FDA发布的42 种安全有效的有益菌种之一，同时是我国农业部1996年公布的食品中允许使用的12种益生 菌之一。本发明菌株所产抗菌肽属于天然抗菌剂，无毒副作用，可以用作食品防腐剂、饲料 添加剂、农用生物防治剂和动物防病剂，具有无毒、无残留、不产生耐药性的优点。符合当 今绿色安全食品生产及对环境友好的要求。因此，在实际使用中具有极高的安全性。

2、本发明菌株BRT39所产抗菌肽抗菌谱广，对食品中常见的致病菌如金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌等细菌表现了较强的抑制作用；对黑曲 霉、米曲霉、绿色木霉、总状毛霉等丝状真菌也可有效抑制。故可以在食品中安全应用。

3、本发明菌株BRT39所产抗菌肽稳定性强。其适用范围较现使用的抗菌肽广。在pH2-12 的环境下，作用1h后，抗菌活性几乎不变；100℃条件下加热30min抑菌活性不改变，显示 了在食品及饲料高温加工过程中，抑菌活性不丧失的优越性。有机溶剂如丙酮、氯仿、乙酸 乙酯、甲醇、乙醚处理30min后，抑菌物质活性保持不变。

4、本发明采用枯草芽孢杆菌生产抗菌肽，不受原料限制，生产周期短，成本低，可大规 模工业化生产，且不受季节和气候变化等外在环境的影响，相对于动植物来源的抗菌肽具有 明显优势。

附图说明

图1菌株BRT39系统发育进化树

图2菌株BRT39产抗菌肽牛奶防腐试验效果图

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本 领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围， 本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实 质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发 明的保护范围。

实施例1：BRT39菌株的筛选

(1)从有机质含量丰富的菜园取2g土样，加到含有50mL冷却无菌水的小三角瓶中，摇 床200r/min，摇动20min，然后放在80℃水浴锅中，水浴10min，不断摇动三角瓶混匀土 样，静置5min吸取上清液100μL，依次梯度稀释到10^-1～10^-9浓度，选取10^-3，10^-4，10^-5， 10^-6浓度涂布牛肉膏蛋白胨平板，37℃培养24h，继续30℃培养24h。

(2)根据微生物菌落的形状、大小、表面结构、边缘结构、质地、光泽、透明度、颜色和 产生的可溶色素等方面的特征，用接种环将孤立的单个菌落挑出，移到筛选培养基平板上， 并编号，34℃培养48h。

所述筛选培养基组成为：牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白陈10g，琼脂粉15g，蒸馏水 1000mL，pH7.2，121℃灭菌20min。

(3)待菌株在平板上培养48h后，在培养皿盖上加入少量氯仿，反扣重熏50min，充分 吹去残存氯仿后，加入稀释2～3倍的指示菌液，培养皿半开，直至平板表面干后于37℃培养 16h。挑选抑菌圈较大的菌株划线分离单菌落后，保藏以供复筛使用。

(4)保藏的菌株接到斜面活化2次后，将活化好的菌种接入种子培养基，180r/min，37℃， 培养18h。再按5％的接种量接种到发酵培养基，200r/min，28℃，发酵48h。将所得发酵 液10000r/min离心去菌体，发酵液上清液进行抑菌实验。

所述种子发酵培养基组成为：葡萄糖2g，蛋白胨1g，NaH₂PO₄·2H₂O0.2g，Na₂HPO₄·2H₂O 0.4g，MgSO₄·7H₂O0.05g，蒸馏水100ml，pH7.4，121℃灭菌20min。

所述发酵培养基组成为：葡萄糖2g，蛋白胨2g，NaH₂PO₄·2H₂O0.02g，Na₂HPO₄·2H₂O 0.04g，MgSO₄·7H₂O0.01g，CaCl₂0.01g，MnSO₄0.002g，蒸馏水100mL pH7.4，121℃ 灭菌20min。

(5)在牛肉膏蛋白胨平板上加入指示菌培养液(OD600＝1.6)，晾干后用孔径6.0mm打孔 器打孔，每孔分别加入不同菌种发酵液上清液约100μL，37℃培养16h，测量抑菌圈大小。 检测霉菌抑菌活性时，在PDA培养基平板中央点上霉菌指示菌，28℃培养至菌落直径2cm 左右，在其周围0.5cm处打孔，加入发酵液上清液，28℃培养，测量抑菌圈大小。

(6)挑选抑菌活性强、抗菌广谱的菌株进行甘油保存。

实施例2：菌株鉴定

菌株生理生化鉴定：按照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)方法进行碳源利用试验、过氧 化氢酶试验、硫化氢试验、吲哚试验、硝酸盐和亚硝酸盐还原试验等试验；形态学鉴定：将 待鉴定的菌株分别点种于牛肉膏蛋白胨培养基固体平板上，37℃培养2d，描述并记录菌落培 养特征以及菌体形态特征。生理生化鉴定特征如表1所示。表中结果对照《伯杰氏细菌鉴定手 册》与枯草芽孢杆菌种属特征相符。分子生物学鉴定：细菌基因组DNA的提取参照《分子克隆 实验指南》(第3版)的方法。依据细菌16S rDNA中最保守的序列设计引物。引物F：5’-AGA GTT TGA TCM TGGCTC AG-3’；引物R：5’-AAG GAG GTG WTCCAR CC-3’由上海生工生物工程有 限公司合成。PCR反应条件：94℃5min，94℃30s，55℃40s，72℃2min，30个循环， 72℃终延伸10min。PCR扩增产物送到北京三博远志生物技术有限公司测序。测序结果进行 双向拼接后，将得到的16S rDNA序列提交到NCBI核酸数据库中进行BLAST在线分析。之后 从NCBI的GenBank核酸数据库中随机选取报道中的部分芽孢杆菌16S rDNA序列，应用 Clustal X1.81和Phylodraw082软件构建系统进化树并分析，系统发育树如图1所示。结 合菌株的形态和生理生化特征，初步鉴定将BRT39菌株暂定为枯草芽孢杆菌。

表1 菌株BRT39形态学及生理生化特性

注：结果“+”表示阳性；“-”表示阴性。

实施例3：菌株发酵液抗菌谱活性测定

(1)菌株BRT39的发酵培养液，经10000r/min离心5min，得到上清液经0.22μm微孔 滤膜过滤后，用于抗菌活性测定。

(2)采用营养琼脂培养基培养指示菌，用打孔法直接测定摇瓶发酵液抗菌活性。营养琼脂 培养基平板涂布培养好的100μL指示菌菌悬浮液(1×10⁸cfu/ml)，用直径6mm打孔器均匀 打孔，每孔加制备好的发酵液100μL，用无菌水做对照。37℃培养16h，记录抑菌圈大小。 选大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球(Staphylococcus aureaus)、蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门氏菌(Salmonella  enteritidis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等细菌作为受试菌株。做霉菌抑菌实验 时，在PDA培养基平板中间接种霉菌，培养1-2d后，在离菌落2cm处打孔，每孔加入制备好 的发酵液100μL，用无菌水做对照。28℃培养3-4d，记录抑菌情况。

(3)菌株BRT39发酵培养液中抑菌物质抑菌活性见表2，显示发酵液对并对大肠杆菌 (Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureaus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus  cereus)、沙门氏菌(Salmonella enteritidis)和枯草芽孢杆菌(Pseudomonas aeruginosa) 等原核微生物具有很好的抑制作用。对丝状真菌黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉 (Aspergillus oryzae)、绿色木霉(Trichoderma viride)、总状毛霉(Mucor racemosus) 也具有显著的抑制作用。

表2 菌株BRT39发酵培养液抑菌活性结果

抑制菌株 抑菌圈直径(mm) 大肠杆菌(Escherichia coli) 21 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureaus) 24 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) 20 沙门氏菌(Salmonella enteritidis) 23 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 16 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 20 黑曲霉(Aspergillus niger) 17 米曲霉(Aspergillus oryzae) 18 绿色木霉(Trichoderma viride) 17 总状毛霉(Mucor racemosus) 21

实施例4：抗菌肽的确定

采用国际公认的“蛋白酶敏感法”确定抗菌物质为抗菌肽。将实施例3获得的发酵液 12000r/min离心10min，保留上清液，并通过0.22μm滤膜过滤除去菌体。将发酵上清液pH 值调为7.5左右，排除菌株在发酵过程中产生有机酸或碱对抑菌效果的影响。将蛋白酶K、 胃蛋白酶、蛋白酶E、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶分别配成10mg/ml的溶液，分别取1mL于离心 管中，再加入处理好的发酵上清液1ml，使酶的终浓度为5mg/mL，同时以1mL双蒸水加入1mL 发酵液作为对照，37℃温育4小时，孵育结束后100℃沸水浴中煮沸灭酶5min，接着用琼脂 扩散法测定抑菌圈直径，并同空白对照进行比较。观察抑菌活性的变化。结果如表3所示。 该抑菌物质对蛋白酶E、木瓜蛋白酶不十分敏感，但对胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶特别敏 感，活性几乎完全丧失。由以上试验结果综合分析，判定该抑菌物质为抗菌肽。

表3 不同蛋白酶处理对抗菌物质的影响

实施例5：菌株发酵液不同处理的抑菌活性

(1)菌株BRT39发酵液抗菌肽热稳定性测定于40℃，60℃，80℃，100℃条件下对抗菌肽 发酵液分别处理1h，120℃条件下保温20min。以金黄色葡萄球菌为指示菌株，通过平板打孔 法测定抑菌活性，每孔加抗菌肽发酵液60μl，以未经热处理的抗菌肽发酵液做空白对照。结 果显示，抗菌肽发酵液经过40℃、60℃、80℃、100℃下处理1h时，抗菌肽发酵液抑菌活性同 未经热处理的对照显示抑菌活性保持在95％以上，120℃作用20min后，抑菌活性下降至7080％。 这表明抗菌肽发酵液有较强的热稳定性。

(2)菌株BRT39发酵液抗菌肽酸碱稳定性测定将抗菌肽发酵液用酸碱将pH分别调至2.0、 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，然后4℃处理16h，再分别 用酸碱将抗菌肽发酵液调回pH7.0，以金黄色葡萄球菌为指示菌株，平板打孔法检测抗菌肽发 酵液抑菌活性，每孔加抗菌肽发酵液60μl。结果显示，pH4.0-9.0之间，抑菌活性几乎保持 不变，在pH2.0-4.0之间，抑菌活性降低至50-80％，pH10.0-13.0抑菌活性保持在60-90％。故 菌株BRT39发酵液抗菌肽酸碱稳定性范围较宽。

(3)菌株BRT39发酵液抗菌肽有机溶剂稳定性测定将抗菌肽发酵液与等体积的丙酮、氯仿、 乙醇、甲醛、乙酸乙酯、乙醚混合，充分摇匀作用40min，在55℃水浴中，去除有机溶剂，然 后检测各处理后的抗菌肽抑菌作用。以金黄色葡萄球菌为指示菌株，平板打孔法检测抗菌肽 发酵液抑菌活性，每孔加抗菌肽发酵液60μl。结果显示，经丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、 乙醚处理后的样品与没有处理的样品的抑菌活性没有显著差异，这表明发酵液抗菌肽对这几 种有机溶剂不敏感。

(4)菌株BRT39发酵液抗菌肽紫外线稳定性测定将抗菌肽发酵液置于28W紫外灯下，距离 10cm处分别照射1h、3h、5h、8h、10h、12h，以不进行照射处理的抗菌肽发酵液作对照，检 测其对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。以金黄色葡萄球菌为指示菌株，平板打孔法检测抗菌肽 发酵液抑菌活性，每孔加抗菌肽发酵液60μl。结果显示，不同时间照射过的抗菌肽发酵液同 未经照射的抗菌活性无明显差异，说明菌株BRT39发酵液抗菌肽紫外线稳定性强。

(5)菌株BRT39发酵液抗菌肽蛋白酶稳定性取抗菌肽发酵液分别与木瓜蛋白酶、碱性蛋白 酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、植物蛋白酶、酸性蛋白酶等混合，蛋白酶的终浓度为10μg/ml， 在各自酶的最适作用条件下酶解4h，以未经处理的抗菌肽发酵液为对照。以金黄色葡萄球菌 为指示菌株，平板打孔法检测抗菌抗菌肽抑菌活性，每孔加抗菌肽发酵液60μl。结果表明， 处理的样品抗菌活性与未处理的样品抗菌活性有显著差异，除胰蛋白酶外其它蛋白酶对其都 有抑制作用，故抗菌肽对蛋白酶比较敏感。初步确定抗菌肽为抗菌蛋白。

实施例6：抗菌肽食品防腐实验

将实施例3获得的发酵液，采用超滤浓缩、低温干燥(＜100℃)、超微粉碎等工艺制成抗 菌肽固体粉末，水分＜5％，用于食品防腐试验。

1、牛奶防腐实验

将超市购买的超高温瞬时灭菌牛奶，加入到清洗干净但未灭菌的试管中，每管15mL，试 管编1～7号，在实验组1～7号中按照每100ml牛奶加入抗菌肽固体粉末0.2g、0.4g、0.8g、 1.2g、1.6g、2.0g、2.4g的质量浓度加入到以上试管中，混合均匀。空白对照不添加抗菌肽。 然后置于室温下30d，记录牛奶腐败变质情况。结果如图2所示，30d后，空白组试管内的牛 奶已经明显变质，色泽暗黄，水乳分层，产生絮状沉淀，打开试管塞，也闻到一股异味。1、 2号试管也出现一定程度的腐败现象，而后面的试管随着抗菌肽添加量的增加，腐败现象越 来越不明显，其中7号试管牛奶颜色洁白，无异味，感官良好，几乎无变质现象。故该抗菌 肽可以用于牛奶的防腐中。

2、草莓汁防腐实验

按照每100ml新鲜草莓汁加入抗菌肽固体粉末0.2g、0.4g、0.8g、1.2g、1.6g、2.0g、 2.4g的质量浓度加入到新鲜草莓汁中，混合均匀。空白对照不添加抗菌肽。然后置于室温下 10d，观察草莓汁感官及微生物数目情况。结果如表4所示，随着抗菌肽的添加量增加，草莓 汁出现浑浊和絮状沉淀的腐败现象越来越轻，在添加质量浓度为1.2(g/100ml)以上室温10d， 草莓汁外观无腐败现象，可以接受。从微生物含量来看，添加抗菌肽可以显著抑制杂菌的繁 殖增长，随着抗菌肽的添加，微生物数量越来越少。当抗菌肽添加质量浓度在1.6(g/100ml) 以上时，培养平板中检测不到微生物，故添加质量浓度在1.6(g/100ml)以上时可以达到完 全抑制微生物生长的抑菌效果。

表4 枯草芽孢杆菌BRT39产抗菌肽对草莓汁的防腐效果