高效广谱抗菌肽产生菌的筛选及发酵条件的研究

摘要

本研究的主要目的是筛选和鉴定产抗菌肽菌株、优化发酵条件以提高抗菌肽的活性并探讨粗抗菌肽的生物学特性。
　　 从不同地区采集的156个土壤样品中进行筛选，最终筛选得到一高产菌株S62-9。在排除有机酸和有机碱对指示菌的抑制作用后，通过盐析、透析和蛋白酶作用试验，初步鉴定S62-9所产抑菌物质为多肽类物质，即抗菌肽。对菌株对菌株S62-9进行鉴定，根据形态特征观察，常规生理生化鉴定及16SrDNA序列的分析，将此菌株初步鉴定为侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）。
　　 本研究探讨了营养要素(包括培养基组成)和环境要素(包括起始pH值、培养温度、装液量和接种量)对抗菌肽产生的影响，以求得产生抗菌肽的最佳发酵条件。正交试验得出S62-9产抗菌肽的最佳营养要素和环境要素为：糊精1％、蛋白胨2％、CaCl2 0.15％、Tween-20 1.5％。培养起始pH值为7.0，装液量为40 mL/300 mL，以3％的接种量于37℃,250 rpm摇床培养22h。在此条件下培养所产抗菌肽与优化前相比提高了59.9％。
　　 粗抗菌肽的生物学特性研究表明，S62-9产抗菌肽具有良好的pH值稳定性和热稳定性，在pH3～12的范围内的抗菌活性变化不大，100℃ 30min活性仅降低12％，当在121℃ 30 min的高温处理后仍能保持77％的活性，该抗菌肽对蛋白酶K和胃蛋白酶具有一定抗性，对蛋白酶K不敏感，在胃蛋白酶作用下，活性只下降28.9％。
　　 S62-9菌株产生的抗菌肽抑菌谱较广，对金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、蜡样芽孢杆菌、植物乳杆菌、乳酸链球菌、容杆菌、大肠杆菌、变形肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌等典型的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有不同程度的抑菌作用，此外该抑菌肽对克鲁维酵母菌、白色念珠菌、黑曲霉和青霉等真菌也表现出了抑菌活性。
　　 发酵液经 60％饱和度硫酸铵盐析,80℃热处理和 Sephacryl S-100 柱层析，可将有效物质与其他组分进行粗分离。层析结果发现分离出两条具有抗菌活性的蛋白峰，这表明S62-9产生的抗菌肽至少是由两种不同分子量的蛋白质组成的，通过SDS-PAGE检测，只能检测到一条分子量相对较大的抗菌肽，分子量<14.4 kD，另一蛋白由于分子量太小(<8 kD)未能检测到。

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1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

5 结论

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