一种去甲木脂素类化合物及其从多枝雾水葛中分离鉴定的方法

摘要

本发明公开一种去甲木脂素类化合物及其从多枝雾水葛中分离和鉴定的方法。所述去甲木脂素类化合物具有如式（Ⅰ）所示结构，所述去甲木脂素类化合物可以从多枝雾水葛中分离得到，具有一定的抑菌性，可以应用于制备抑菌药物。（Ⅰ）

说明书

技术领域

本发明属于天然产物活性成分提取领域，具体公开一种去甲木脂素类化合物及其从多枝雾水葛中分离和鉴定方法。

背景技术

多枝雾水葛Pouzolzia zeylanica (L.) Benn. Var. microphylla (Wedd.)W.T.Wang.又名石珠，石珠仔，生于潮湿的山地、沟边和路旁或低山灌丛中或疏林中，主要分布于我国江西、福建、台湾、广东、广西、云南等地，是雾水葛属药用植物中在中国分布较广，使用较多的一种。其主要功效为解毒消肿，接骨，用于痈肿，梅毒，肺结核，骨折。有“啜脓膏”、“脓见消”、“拔脓草”等俗称。

国内外对雾水葛属植物的研究报道不多，主要是关于其抗菌、驱虫、抗肿瘤和降血糖应用的零星报道。化学成分研究方面，国外文献报道了雾水葛含有槲皮素（quercetin），牡荆素(vitexin)，异牡荆素（isovitexin），phylanthin ，甲基-硬脂酸酯(metyl-stearate)、β-胡萝卜苷以及两个去甲木脂素化合物，分别命名为pouzoligan A和pouzoligan B，其结构为2-羟基-4-[羟基苯基-（4-羟基-3-甲氧基苄基）]-3-（3,5-二羟基苯基）四氢呋喃和1,4- 二羟基-3-[4-羟基苯基- (4-羟基- 3-甲氧基苄基)] -2- (3,5 –二羟基苯基)丁烷。国内仅见多枝雾水葛总黄酮、总生物碱提取工艺专利，未见其他关于多枝雾水葛木脂素类化合物的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种由多枝雾水葛提取的新型去甲木脂素类化合物，其具有一定的抑菌和肿瘤抑制活性。

本发明的另一目在于提供由多枝雾水葛中分离出所述新型去甲木脂素类化合物的方法。

本发明同时还有一目的在于提供该新化合物的鉴定方法。

本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：

一种去甲木脂素类化合物，所述去甲木脂素类化合物具有如式（Ⅰ）所示结构：

（Ⅰ）。

式（Ⅰ）所示化合物的英文命名为：2,5-bis(4-methoxy-3-epoxylphenyl)-3,4-bis(3,5-dihydroxyphenyl)-tetrahydrofuran，其结构通过波谱解释确定。

所述化合物从多枝雾水葛中分离的方法，包括如下步骤：

S1.将多枝雾水葛粉碎，加入乙醇，回流提取，合并提取液，浓缩成浸膏液，备用；

S2.将S1.得到的浸膏液依次采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液并浓缩，得到乙酸乙酯萃取物；

S3.将乙酸乙酯萃取物进行柱层析，以二氯甲烷和甲醇的混合液梯度洗脱，二氯甲烷与甲醇的体积比依次为：80:1，40:1，20:1，10:1，5:1，1:1，0:1；每500mL收集一份洗脱液，洗脱液经薄层色谱法检识，主斑点颜色变淡即更换洗脱液的浓度，合并第60~80份流出液；

S4.对S3.所合并的流出液用尺寸为1cm×150cm的葡聚糖凝胶柱层析进行分离，以氯仿和甲醇体积比为1:1的混合液洗脱，5mL收集一份洗脱液，经薄层色谱法检识显色，收集第35~45份流出液，记为Fr.4；

S5.对S4.所得Fr.4进行柱层析，用氯仿和甲醇的混合液进行洗脱，经薄层色谱法检识，合并显色组分；

S6.对S5.所得显色组分进行ODS柱层析，用30体积%的甲醇洗脱，洗脱液经薄层色谱法检识，合并显色组分，浓缩得到式（Ⅰ）所示化合物；

所述薄层色谱检识以5%硫酸香草醛溶液作为显色剂。

优选地，S1.中，所用乙醇为75%的乙醇水溶液。

优选地，S1中，所述提取的温度在70℃以下进行。

优选地，S1.中，所用乙醇的用量为多支雾水葛的10~20倍。

优选地，S1.中，回流提取的次数为3次，每次2小时。

优选地，S5.为采用氯仿和甲醇体积比为13:1的混合溶液进行洗脱。

优选地，S5.为采用氯仿和甲醇体积比为13:1的混合溶液进行洗脱时，每50mL收集一份洗脱液，经薄层色谱法检识，第6~10份显色，收集该组分。

优选地，S6.中，每10mL收集一份洗脱液，经薄层色谱法检识，第8~11份显色，收集该组分。

优选地，S3.和S5.中所述柱层析为硅胶柱层析。 

优选地，S3.中的硅胶为100~200目；S5.中的硅胶为300~400目。

所得到的式（Ⅰ）所示化合物，用二氯甲烷:甲醇=12:1，上行展开，紫外灯下（254nm）观察为一灰色斑点，5%硫酸香草醛溶液显色为单一蓝紫色斑点。在二氯甲烷:甲醇=12:1系统中Rf=0.53，在氯仿:丙酮=1:1系统中Rf=0.41，在石油醚:乙酸乙酯=1:2中Rf=0.28。

经活性实验证实，式（Ⅰ）所示化合物有一定的抑菌性，可以应用于制备抑菌药物。

式（Ⅰ）所示化合物对癌细胞有一定的抑制作用，有望应用于制备抗癌药物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明公开一种新的去甲木脂素类化合物，其可以从多枝雾水葛中分离得到，具有一定的抑菌性，可以应用于制备抑菌药物，其对癌细胞有一定的抑制作用，有望应用于制备抗癌药物。

附图说明

图1为式（Ⅰ）所示化合物的¹H-NMR图；

图2为式（Ⅰ）所示化合物的¹³C-NMR图；

图3为式（Ⅰ）所示化合物的¹³C-DEPT-NMR图；

图4为式（Ⅰ）所示化合物的HMBC谱图；

图5为式（Ⅰ）所示化合物的HMQC谱图；

图6为式（Ⅰ）所示化合物的EI-MS谱图；

图7为式（Ⅰ）所示化合物的HR-EI-MS谱图；

图8为式（Ⅰ）所示化合物的IR谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。

实施例1

从多枝雾水葛中分离式（Ⅰ）所示化合物的方法：

（1）提取：称取多枝雾水葛10kg，剪碎，放入提取罐中，加入15倍体积75%的乙醇，回流提取三次，每次两个小时，提取液合并浓缩得精粗提物，备用。

（2）液液萃取分离：将浸膏液用适量水分散，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取至各萃取液色浅，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩至流浸膏。

（3）硅胶柱色谱分离：将乙酸乙酯萃取物21g进行硅胶柱（100~200目，1500g）色谱分离，用二氯甲烷和甲醇进行梯度洗脱，二氯甲烷与甲醇的体积比依次为：80:1，40:1，20:1，10:1，5:1，1:1，0:1。每500mL收集一份洗脱液，洗脱液经薄层色谱法检识，主斑点变淡即更换洗脱液的梯度，合并第60~80份流出液； 

（4）葡聚糖凝胶色谱分离：对步骤（3）得到的第60~80份流出液进行葡聚糖凝胶（Sephadex^TMLH-20）柱色谱分离（1cm×150cm），以氯仿和甲醇体积比为1:1的混合液洗脱，5mL收集一份洗脱液，经薄层色谱法检识显色，收集第35~45份流出液，记为Fr.4；

（5）硅胶柱色谱分离：0.5g Fr.4进行硅胶柱（300~400目，50g）分离，氯仿与甲醇体积比为13:1的混合液洗脱，每50mL收集一份，经TLC检测，5%硫酸香草醛显色，合并第5~10组分，得到Fr.A。

（6）C18反相硅胶柱纯化：将Fr.A经过C18反相硅胶柱（20g），30%甲醇洗脱，每10mL收集一份，经TLC检测，5%硫酸香草醛显色，合并第8~11组份，浓缩，放置析出棕色结晶，氯仿-甲醇（1:1）重结晶纯化，真空干燥后得到式（Ⅰ）所示化合物（75mg）。

式（Ⅰ）所示化合物的外观为棕色片状晶体（氯仿-甲醇），mp.170~173 ,旋光度 +3.0。，UV:280nm，用二氯甲烷:甲醇=12:1,上行展开，紫外灯下（254nm）观察为一灰色斑点，5%硫酸香草醛溶液显色为单一蓝紫色斑点。在二氯甲烷:甲醇=12:1系统中Rf=0.53，在氯仿:丙酮=1:1系统中Rf=0.41，在石油醚:乙酸乙酯=1:2中Rf=0.28。

其红外数据：IR（溴化钾压片,νcm-1): 3351（强，宽），1605,1516（强）,说明分子中含有羟基和苯基。

其质谱数据：HR-EI-MS中分子离子峰 m/z 514.1608 , TOF-ESI-MS中准分子离子峰为m/z 515.1694 [M+H]⁺,确定其分子式为C₃₀H₂₆O₈（calcd.514.1628）； 

其核磁数据：¹³CNMR谱中共出现15个碳信号，包括10个芳碳，提示存在对称取代的苯环，高场区除了δ55.8处的甲氧基碳以外，还有两个饱和次甲基碳δ:88.6，63.3，DEPT实验证明没有亚甲基CH₂。由分子量可知，该化合物分子结构具有高度对称性，NMR图谱中仅出现一半的信号。¹HNMR谱中芳香区域出现两组苯环质子峰，δ6.85（1H,d，J=1.8Hz），δ6.82（1H,dd，J=1.8，8.2Hz），δ6.76（1H,d，J=8.1Hz）为一个ABX系统；δ6.12 (1H,s), δ6.11 (1H,m)和δ6.09(1H,t,J=2.1Hz)为另一个苯环上的A₂X系统，相应的碳信号出现在δ:141.1，107.3（x2）,101.8，158.9（x2），说明为3，5-二羟基苯基；δ3.44（1H,dd，J=2.85，6.4Hz）和δ5.22（1H,dd，J=2.85，6.4Hz）的出现，提示为四氢呋喃类化合物，相应的碳原子信号分别出现在δ63.3（CH）和δ88.6(CH)；δ3.8（3H,s）说明有一个甲氧基。在HMBC谱中，δ3.44（H-3）与δ88.6（C-2）、δ141.1（C-1''），δ133.9（C-1'）,δ107.3（C-2'',6''）有远程相关；δ5.22（H-2）与δ63.3（C-3）、δ141.1（C-1''），δ110.4（C-2'),δ119.4（C-6'）,δ107.3（C-2'',6''）有远程相关。以上数据说明四氢呋喃环2位与ABX系统苯环连接，3位与3，5-二羟基苯基连接。综合以上数据，确定化合物结构为: 2,5-bis(4-methoxy-3-epoxylphenyl)-3,4-bis(3,5-dihydroxyphenyl)-tetrahydrofuran

详细波谱数据如下：

UVλmax(MeOH)：280nm

IR（溴化钾压片,νcm^-1): 3351,2938 ,2844,2158,1605,1516,1459,1435,1347,

1273,1238,1209,1156,1124,1031,1001,947,921,842,820,775,755,728,694,636,554,521,456。

¹H-NMR (CD₃OD, 500MHz)δ(ppm): 3.8(3H,s), 3.44(1H,dd,J = 2.85, 6.4 Hz), 5.22(1H,dd,J = 2.85, 6.4 Hz),6.09(1H,t,J = 2.1 Hz),6.11 (1H, m),6.12 (1H, s), 6.76(1H,d,J = 8.1 Hz),6.82(1H,dd, J = 1.8, 8.2 Hz),6.85(1H,d,J= 1.8 Hz);

¹³C-NMR(CD₃OD,125MHz)δ(ppm):55.8(OCH₃),63.3(C-3,4),88.6(C-2.5),101.8(C-4''),107.3(C-2'',6''),110.4(C-2'),115.5(C-5'),119.4(C-6'),133.9(C-1'),141.1(C-1''),146.6(C-3'),148.3(C-4'),158.9(C-3'',5'')。

 

实施例2  抗菌活性实验

1.实验材料

1.1 菌株：金黄色葡萄球菌菌株由广东药学院基础学院微生物与免疫实验准备室分离保存。

1.2 试药：实施例1得到的式（Ⅰ）所示化合物；二甲基亚砜(广州化学试剂厂)；黄连药材（广州致信药业有限公司）；

1.3 培养基 ：营养琼脂细菌干粉培养基，营养肉汤细菌干粉培养基（广东环凯微生物科技有限公司）；

2.方法

2.1 样品的制备

精密称取实施例1制备的式（Ⅰ）所示化合物粉末2mg至于已灭菌的EP管中，加入500μL已灭菌的1%DMSO使其溶解，浓度为4mg/mL。4℃保存备用。

2.2 黄连提取液制备

粉碎黄连，称取1g药粉，至具塞锥形瓶，加蒸馏水25mL，超声20min,过滤，滤渣再加入20mL的蒸馏水超声10min，合并2次滤液，并定容至100mL。制成浓度为含生药0.01g/mL的阳性对照药。121℃高压灭菌20min。4℃保存备用。

2.3  实验菌液的配制

在无菌操作台上，往灭菌试管中加入5mL营养肉汤培养液，加入金黄色葡萄球菌株液0.1mL，于37℃恒温培养12h。将细菌稀释为3×10⁷ 个·mL^-1的备用菌液。

2.4  体外抑菌效果的测定

采用打孔法加以改进。在无菌操作台上将营养琼脂培养基熔融并恒温到58 ℃左右，倒入无菌平皿，每平皿倾入10 mL。充分冷却后待用。

在无菌试管中加入5mL已经熔融并恒温到58℃左右的营养琼脂培养基和0.1mL菌液，快速搓动，使充分混匀，趁热倒入已制备的营养琼脂培养皿中，使其均匀铺开。待凝固后，用6mm玻璃灭菌打孔器于平皿中均匀且垂直打3个孔，挑出琼脂，分别用定量移液器移取25 μL供试液及1%DMSO做阴性对照，每个样品平行做3次。于37℃恒温箱中培养24h，以游标卡尺分别测量每一个抑菌圈两个垂直方向的直径，抑菌环的边缘以肉眼看不到细菌明显生长为限。量完后取其平均值进行统计分析，计算3个孔抑菌圈直径的平均值及标准差。体外抑菌定性结果的判定标准：抑菌圈直径小于7mm为不敏感（—），7～12 mm为低度敏感（+），12～18 mm为中度敏感（++），18 mm以上为高度敏感（+++）。

3.结果

黄连阳性对照组（含生药0.01g/mL）可见明显的抑菌圈，直径约16mm，其抑菌作用为中度敏感。式（Ⅰ）所示化合物周边可见有抑菌圈，直径约7.0mm,其抑菌作用为低度敏感。

 

实施例3  肿瘤活性实验

1.实验材料

1.1 药品：实施例1制备的式（Ⅰ）所示化合物 

1.2 细胞：骨肉瘤细胞株MG-63，乳腺癌细胞株SKBR-3

1.3 试剂：PRMI1640，胎牛血清，胰酶，DMSO，MTT，青霉素，链霉素（Sigma公司）；96孔板（Coring公司）

2.方法

将骨肉瘤MG-63细胞和乳腺癌SKBR-3细胞分开培养于含10%胎牛血清、1×10⁵U/L青霉素、链霉素的PRMI1640培养液中，37℃，5%CO₂培养箱内培养。取对数生长期的细胞，用0.25％的胰酶消化，吹打成为均匀的单细胞悬液，计数细胞，用培养基稀释成5×10⁴ cell／mL接种于96孔板中，每孔200μL，37℃，5％CO₂培养箱内培养24 h。实验组给药量为3.13μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM，空白对照组加入等量培养基，阴性对照组加入等量含1‰的DMSO的培养基，每组3孔。连续孵育24 h后，弃掉培养基，用PBS清洗2次，每孔加入180μL 不含血清培养基和20μL MTT(5 mg/mL)。37℃，5％CO₂培养箱培养4 h后，吸弃上清，每孔加入l50μL DMSO充分溶解细胞沉淀，振荡10min，在l h内用酶标仪在490 nm处测定吸光度值（OD值）。

细胞抑制率（%）=（空白对照组OD值-实验组OD值）/空白对照组OD值 ×100%

3.实验结果（见下表）

式（Ⅰ）所示化合物对MG-63 细胞和SKBR-3细胞的抑制作用

上述实验结果表明：化合物对骨肉瘤MG-63细胞和乳腺癌SKBR-3细胞均有一定的抑制作用。