新型脱碳木脂素类化合物合成方法与肿瘤抑活性研究

摘要

木脂素是一种具有抗病毒、抗肿瘤、延缓衰老、调节免疫等生物活性的天然产物，在植物的根、茎、叶和果实中都有发现，其基本骨架结构为苯丙素单元。研究发现，带有此类结构单元的化合物可能具有与木脂素相似的生物活性，因此对此类化合物的合成方法也成为了化学家的研究热点之一。
　　 本论文研究了一系列带有脱碳木脂素（两分子苯丙素单元在生物合成的过程中可能通过脱去羰基失去一个碳原子而生成）基本骨架结构的1，3-二芳基丁烯类化合物的合成方法及其生物活性的检测。多年来，此类化合物的合成已经有相当多的文献报道，主要通过布氏酸或者过渡金属Pd、Ni、Co、Ru等催化芳基烯烃进行二聚反应合成。但是以布氏酸为催化剂的二聚反应，二聚产物收率较低，且其空间构型不具备选择性，同时生成二氢化茚类等多种副产物，因此该催化方法并不值得推广。而应用过渡金属催化的方法，虽然能够控制产物的空间选择性，但过渡金属价格昂贵、反应条件苛刻、对环境污染较大，难以满足进一步工业化生产的要求。
　　 基于以上原因，本论文旨在开发芳基烯烃二聚反应的新型催化体系，为合成脱碳木脂素类化合物提供更多的研究方法。首先，在查阅大量参考文献和结合本实验室研究工作的基础上，以带有苯丙素单元的化合物α-细辛脑为原料，探索了二聚反应的新型催化体系(Mn(Ⅱ)/Co(Ⅱ)/PhP(O)HOR/O2）用于合成脱碳木脂素类化合物，考察了反应的影响因素，优化了反应条件，同时在该催化体系作用下，本反应能够实现产物的空间选择性且反应产物为反式结构。另外，在此基础上借鉴了布氏酸催化二聚反应的机理，进一步开发了新的催化体系(H+/PhP(O)HOR)，该体系不但能够实现反应产物的空间选择性，同时也大大提高了反应的收率，所研究的催化体系易于制备，实验方法简便、可行，为进一步开展工业化生产奠定基础。本论文应用1H NMR，13C NMR，HPLC-MS以及元素分析等方法对合成的脱碳木脂素类化合物进行表征，同时考察了它们对人肝癌细胞Bel-7402、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549和人宫颈癌细胞Hela的体外抗癌效果。主要研究内容如下:
　　 1.Mn(Ⅱ)/Co(Ⅱ)/PhP(O)HOR/O2催化芳基烯烃类化合物的二聚反应研究
　　 在新催化体系确立的基础上，本论文通过逐一考察单个组分对反应的影响，探索发生该反应的必要条件。结果表明，Mn(Ⅱ)、Co(Ⅱ)、O2在反应中都缺一不可，同时PhP(O)HOR也作为催化剂与Mn(Ⅱ)/Co(Ⅱ)/O2共同作用，促进反应的发生。接着，作者进一步优化反应条件，经实验证明最佳反应条件为:以乙酸为溶剂，底物与PhP(O)HOR摩尔比为1∶3，Mn(Ⅱ)/Co(Ⅱ)为原料摩尔量的5％，在持续通入氧气的条件下90℃反应24 h，其中3a最高收率达76％。
　　 基于以上研究结果，本论文考察了反应的适用范围，并对可能的反应机理进行了初步的推导。通过以带有不同取代基的芳基烯烃类化合物为原料进行反应，表明芳基烯烃类化合物带有供电基团更有利于反应的发生。在结合相关文献和实验数据的基础上，作者提出了该反应可能是以自由基的加成-消除反应机理进行的。
　　 总之，本论文开发出了用于合成脱碳木脂素类化合物芳基烯烃二聚反应的新的催化体系，该体系相比较文献报道的方法，过渡金属用量更少，能够降低成本、减少污染，反应条件也更为温和。另外，与经典Mn(Ⅱ)/Co(Ⅱ)/O2体系催化合成有机膦化合物反应中PhP(O)HOR作为反应物相比，在该反应中PhP(O)HOR与Mn(Ⅱ)/Co(Ⅱ)/O2共同形成催化体系促进反应的完成。
　　 2.H+/PhP(O)HOR催化合成脱碳木脂素类化合物(3a-3g、3i、3j)方法研究在结合文献报道应用布氏酸能够催化芳基烯烃类化合物的二聚反应，以及制备PhP(O)HOR过程中，同时也会产生布氏酸(HCl)，因此作者以α-细辛脑为原料通过应用未纯化的PhP(O)HOR为催化剂，开展二聚反应合成脱碳木脂素类化合物，经多种表征方法证实为目标产物，同时产物为反式构型，且最高产率达到95％。至此，本论文建立了H十/PhP(O)HOR催化芳基烯烃二聚反应的体系。
　　 根据以上结果，作者通过逐一考察单个组分对反应的影响，探索发生该反应的必要催化条件。结果表明，单一酸催化虽然能够引发反应，但存在反应收率低、目标产物空间构型不具备选择性、副产物多等问题，而PhP(O)HOR的参与能够大大提高反应的收率、抑制副反应的发生、并对产物起到空间控制的作用。接着，作者进一步优化反应条件表明，本反应在室温和无溶剂的条件下同样能够得到高收率产物，经实验探索的最佳反应条件为:未纯化的PhP(O)HOR与α-细辛脑摩尔比为1∶2，在室温无溶剂条件下反应2h。
　　 基于以上研究结果，作者考察了反应的适用范围，并对可能的反应机理进行了初步的推导。通过以带有不同取代基的芳基烯烃类化合物为原料进行反应，表明芳基烯烃类化合物带有供电基团更有利于反应的发生。在结合相关文献和实验数据的基础上，作者提出了该反应可能是以酸催化形成碳正离子和PhP(O)HOR促进叔氢质子消去两个过程进行的。
　　 总之，作者提出了H+/PhP(O)HOR的催化体系应用于合成脱碳木脂素类化合物，相比较传统布氏酸催化芳基烯烃二聚反应，该体系克服了单独酸催化条件下存在的问题，具有收率高、无副产物并且产物构型具有空间选择性等优点，同时基于PhP(O)HOR的合成特点，该催化体系易于制备，反应条件温和，实验方法简便、可行，并能避免应用过渡金属带来的毒性问题，为进一步工业化生产奠定了基础。
　　 3.所合成脱碳木脂素类化合物(3a-3g)肿瘤抑制活性测定及作用机制分析
　　 首先，本论文通过MTT法考察了所合成化合物对人肺癌细胞A549、人肝癌细胞Bel-7402、人宫颈癌细胞Hela和人乳腺癌细胞MCF-7的抗癌活性，检测表明，所合成脱碳木脂素类化合物对这些肿瘤细胞都具有一定的抑制作用，其中对人肝癌细胞Bel-7402的抑制效果最好，并且化合物3b的半数抑制浓度(IC50)为18.9μg/mL，低于相同条件下的对照组紫杉醇的半数抑制浓度(28.0μg/mL)，说明针对Bel-7402细胞化合物3b表现出比紫杉醇更好的抑制作用。另外，我们以作用于Bel-7402细胞的IC50值分析了化合物结构与活性的关系，初步分析得出了该类化合物具备更高抗癌活性的基本骨架结构，即3f结构。
　　 其次，作者以Bel-7402细胞为研究对象，应用Hoechst-PI双染色法和流式细胞仪法对化合物的抗癌作用机制进行了分析。化合物3a、3b、3c和3f作用Bel-7402细胞后，通过荧光显微镜可明显观察到凋亡细胞增多，核仁收缩，染色质浓缩呈肾形或新月型，并伴有凋亡小体的出现，而其它三种化合物细胞形态变化并没有上述四种明显，这也与它们对应的IC50值结果相吻合。这些结果从细胞形态学角度表明这些化合物对Bel-7402细胞的抑制可能是通过凋亡机制进行的。利用流式细胞仪对化合物作用后的细胞周期分析发现，这些脱碳木脂素类化合物表现出与紫杉醇相似的抑制作用，即将细胞周期阻断于G2期和M期而导致癌细胞死亡。
　　 总之，本论文从化合物的抗癌活性、化合物作用后的细胞形态、细胞周期等对这些脱碳木脂素类化合物的生物活性和抗癌作用机制进行了初步分析。结果证实，这些脱碳木脂素类化合物对肿瘤细胞均有一定抑制作用，并可能通过凋亡机制杀死癌细胞，表现出与紫杉醇类似的抑制作用。另外，研究表明，3f的结构为该类化合物具备更高抗癌活性的基本骨架。值得注意的是，针对Bel-7402细胞化合物3b表现出比紫杉醇更好的抑制效果，因此3b具有较为广阔的研究应用价值。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 引言

1．2 木脂素的定义、分类以及生物活性

1．2．1 木脂素的定义

1．2．2 木脂素的分类

1．2．3 木脂素的生物活性

1．3 木脂素化合物合成研究进展(以脱碳木脂素为例)

1．4 芳基烯烃二聚反应的研究进展

1．4．1 过渡金属催化的芳基烯烃二聚

1．4．2 分子筛催化的芳基烯烃二聚

1．4．3 DDQ催化的芳基烯烃二聚

1．5 本论文的研究目的与内容

第2章 Mn(Ⅱ)／Co(Ⅱ)／PhP(O)HOR／O2体系下芳基烯烃二聚反应研究

2．1 引言

2．2 Mn(Ⅱ)／Co(Ⅱ)／PhP(O)HOR／O2催化体系的建立

2．2．1 Mn(Ⅱ)／Co(Ⅱ)／O2氧化还原体系简介

2．2．2 过渡金属催化的C-P键加成反应

2．2．3 本节小结

2．3 反应条件的探索

2．3．1 催化体系中各组分作用的确定

2．3．2 PhP(O)HOR中烷基对催化体系的影响

2．3．3 PhP(O)HOR用量对催化体系的影响

2．3．4 氧气浓度对反应的影响

2．3．5 溶剂对反应的影响

2．3．6 温度对反应的影响

2．3．7 时间对反应的影响

2．3．8 本节小结

2．4 体系适用范围的探索

2．5 可能反应机理的研究

2．6 实验部分

2．6．1 仪器与试剂

2．6．2 底物的制备方法

2．6．3 化合物的合成

2．7 本章总结

第3章 H+／PhP(O)HOR催化芳基烯烃类化合物的二聚反应研究

3．1 引言

3．2 H+／PhP(O)HOR催化体系的确立

3．2．1 布氏酸催化的芳基烯烃二聚反应

3．2．2 亚膦酸酯参与的化学反应

3．2．3 本节小结

3．3 反应条件的探索

3．3．1 催化体系中各组分作用的确定

3．3．2 溶剂对反应的影响

3．3．3 PhP(O)HOR用量对反应的影响

3．3．4 底物结构、反应温度对反应的影响

3．3．5 本节小结

3．4 可能反应机理的探索

3．5 实验部分

3．5．1 仪器与试剂

3．5．2 H+／PhP(O)HOR体系下二聚化合物的制备

3．6 本章总结

第4章 新型脱碳／木脂素类化合物体外肿瘤细胞生长抑制活性的研究

4．1 引言

4．2 肿瘤细胞生长抑制活性研究方法

4．2．1 细胞的培养方法

4．2．2 化合物细胞活性的测定方法

4．3 实验部分

4．3．1 材料与仪器

4．3．2 MTT法检测化合物的抑制率实验过程(以MCF-7为例)

4．3．3 Hoechst33342-PI双染色法各化合物的染色制片

4．3．4 流式细胞仪法各化合物的细胞悬液配制

4．4 结果与讨论

4．4．1 脱碳木脂素类化合物抗癌抑制活性的评价

4．4．2 脱碳木脂素类化合物对肿瘤细胞作用机制的研究

4．5 本章总结

结论与展望

参考文献

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文

致谢