一种夏鲆冻精与牙鲆种间杂交人工授精的方法

摘要

本发明属海洋生物技术领域，具体的说是一种牙鲆卵子与冷冻保存的夏鲆精子的种间杂交人工授精的方法。将长期超低温冷冻保存的夏鲆精子经二步水浴解，溶解后夏鲆冻精中加入其3倍体积的稀释液，混合后离心5min，然后去掉上清液，获得与稀释前同样体积的冻精悬液，冻精与自然海水按体积比为1:40的比例混匀进行激活，激活后注入牙鲆卵子中，轻轻混匀，使牙鲆卵子与夏鲆冻精充分接触，静置5-10min，洗卵获得受精卵进行孵化。本发明建立了夏鲆精子冷冻保存技术及牙鲆卵子种间杂交人工授精方法，克服了夏鲆与牙鲆亲鱼发育不同步的困难，为海水鱼类杂交育种提供了新方法和新思路。

说明书

技术领域

本发明属海洋生物技术领域，具体的说是一种牙鲆卵子与冷冻保存的夏鲆精 子的种间杂交人工授精的方法。

背景技术

杂交育种是比较容易实施也容易见效的一种育种方法，它利用现有的品种或 物种进行杂交，从其后代选育出符合人们需要的基因组合。选择地理远缘的物种 作为杂交亲本，可以增加杂交子代的多态性，易于从它们的杂交后代出现多种多 样类型，比较容易从中获得符合要求的新类型。牙鲆(Paralichthys olivaceus) 和夏鲆（Paralichthys dentatus）是重要的海水养殖鱼种，分别分布于太平洋和 大西洋沿岸，虽然属同一属，但地理分布距离较远。牙鲆（♀）与夏鲆（♂）作 为亲本，通过人工授精方法，获得发育、生长正常的杂交子代。杂交子代继承了 其亲本肉质细腻鲜美，营养丰富，食用价值高等特性，同时在人工养殖过程中表 现出生长快、温度适应范围广，特别是耐高温等优点。但是牙鲆与夏鲆具有不同 的生物学特性往往在人工培育过程中性腺发育不同步，同时牙鲆与夏鲆也常养殖 于不同的地域这都造成种间杂交精子、卵子难于同步获得的难题。

发明内容

本发明目的在于提供一种夏鲆冻精与牙鲆种间杂交人工授精的方法。

为实现上述目的本发明采用的技术方案为：

一种夏鲆冻精与牙鲆种间杂交人工授精的方法，将长期超低温冷冻保存的夏 鲆精子经二步水浴解冻，溶解后夏鲆冻精中加入其3倍体积的稀释液，离心收集 沉淀，而后与牙鲆卵子进行人工授精；其中，稀释液为NaCl，KH2PO4和水组成。

进一步的说，采集繁殖期精活力85%以上的夏鲆精子将其与抗冻液按体积比 为1:3的比例在碎冰中轻轻震荡、充分混匀平衡5-6min；而后以-10℃/min的降 温速率降温至-150℃，置于液氮中进行长期超低温冷冻保存，得到长期超低温冷 冻保存的夏鲆精子。

所述抗冻液由抗冻剂、抗冻剂和稀释液组成；其中抗冻剂为13%的丙二醇 （PG）、抗冻剂为浓度为30g/L的蔗糖。

所述二步水浴解是将冻精先置于37℃水浴锅中轻轻摇动90s，然后置于18℃ 水浴中轻轻摇动30s，进行二步水浴解，融解后置于0-4℃的冰盒中保存。

将所述经二步水浴解冻后夏鲆冻精与稀释液按体积比1:3的比例混合，混合后以 800g的离心力离心5min，然后去掉上清液，获得与稀释前同样体积的冻精悬液， 放置于0-4℃冰盒，待用。

将所述二步水溶解冻后夏鲆冻精与自然海水按体积比为1:40的比例混匀进 行激活，激活后注入牙鲆卵子中，轻轻混匀，使牙鲆卵子与夏鲆冻精充分接触， 静置5-10min；然后洗卵，用筛绢网过滤，将收集的受精卵放置于新鲜的海水中 冲洗3～5次,冲洗后静置,取上浮卵进行孵化。

本发明所具有如下优点：

1.本发明采集性成熟夏鲆雄鱼优质精子经过超低温冷冻保存，然后获得与其 同步的牙鲆卵子进行种间杂交进而实现人工授精。其中，夏鲆精子的超低温冷冻 保存技术可以长期保存夏鲆冻精，随时、随地可以解冻应用。

2.本发明超低温冷冻保存夏鲆精子时以13%丙二醇（PG）为渗透性抗冻剂， 蔗糖30g/L作为费渗透性抗冻剂，增加对冻精的保护效果且有效的降低毒性。

3.本发明超低温冷冻保存夏鲆精子解冻过程中采用37℃和18℃二步水浴解 冻，避免了冻存管周围温度过高对冻精造成的损伤。

4.本发明冻精在用于人工授精前采用3倍体积稀释液稀释，800g的离心力离 心洗脱，减少抗冻剂的毒性对冻精质量的影响同时不破坏精子的结构。

5.本发明人工授精过程中首先采用一定量海水将冻精激活然后倒入卵子中， 海水在激活冻精的同时又可进一步洗脱抗冻剂对精子活力的影响；

6.本发明人工授精的重复性稳定性好，好冻精解冻后复苏率高，激活后运动 率60-70%，受精率在50-70%，孵化率60-70%。

具体实施方式

实施例1

采集正值夏鲆生殖盛期的精子，即于烟台东方海洋亲鱼培育车间采集夏鲆精 子，并存于干净的离心管中，显微镜检测活力高于90%，置于碎冰上带回实验室 进行冷冻保存；

将上述采集的新鲜精子经过按1:3的体积比例与抗冻液混合在碎冰中（0℃） 轻轻震荡、充分混匀3min，并分装到2ml冻存管中，然后置于降温仪中0℃平衡 5min；再以-10℃/min的降温速率降温至-150℃，分装到冻存盒，置于液氮容器 中，进行长期超低温冷冻保存，保存冻精65管；

其中，抗冻液由抗冻剂、抗冻剂和稀释液组成；稀释液为质量浓度8g/L NaCl、 1.5g/L KH₂PO₄和水；抗冻剂为13%的丙二醇（PG），抗冻剂为浓度为30g/L的蔗 糖，即抗冻液为每升水中NaCl8g，KH₂PO₄1.5g，蔗糖30g，13mL PG（V/V）。

首先用蒸馏水配置稀释液，秤取NaCl8g和KH₂PO₄1.5g然后定容至1L备用； 采用已配置的稀释液作为基础液配置抗冻液，其中含13%DMSO（V:V）（即100mL 抗冻液含13mL PG）；然后将已配置好的抗冻液作为基础液，加入蔗糖3.42g,定容 至100mL。

将上述冷冻保存的夏鲆冻精解冻采用37℃水浴解冻，将冻存管盒从液氮罐的 层架中取出，放置于存有液氮的保温盒中，从冻存盒中用镊子快速取出冻存管置 于37℃水浴锅中轻轻摇动约90s，然后将冻存管置于18℃水浴中轻轻摇动约30s， 然后置于0-4℃的冰盒中存放；

解冻后的冻精人工受精前再以1:3的体积比与稀释液混合于10ml离心管中， 以800g的离心力离心5min进行洗脱，然后去掉上清液，获得与稀释前同样体积 的冻精悬液，放置于0-4℃冰盒中随时准备进行人工授精；

烧杯中加入100ml自然海水，然后加入2.5ml冻精，混匀，迅速倒入1kg优 质牙鲆卵子中，轻轻混匀，静置静置5min；然后洗卵，用筛绢网过滤，将收集的 受精卵放置于新鲜的海水中冲洗3～5次,将受精卵放入2000ml量筒静置,取上浮 卵进行孵化，孵化率60-70%，苗种（变态伏底后）存活率高于80%。

实施例2

2010年5月，2011年3月，2012年12月，于烟台东方海洋亲鱼培育车间采 集夏鲆精子，显微镜检测活力高于90%。将鲜精置于碎冰上带回实验室进行冷冻 保存或者将上述采集的新鲜精子直接在现场进行冷冻保存。

鲜精经过按1:3的体积比例与抗冻液混合在碎冰中（0℃）轻轻震荡、充分混 匀3min，并分装到2ml冻存管中，然后置于降温仪中0℃平衡5min；再以-10℃ /min的降温速率降温至-150℃，分装到冻存盒，置于液氮容器中，进行长期超低 温冷冻保存，保存冻精65管；

其中，抗冻液由抗冻剂、抗冻剂和稀释液组成；稀释液为质量浓度8g/L NaCl、 1.5g/L KH₂PO₄和水；抗冻剂为13%的丙二醇（PG），抗冻剂为浓度为30g/L的蔗 糖，即抗冻液为每升水中含NaCl8g，KH₂PO₄1.5g，蔗糖30g，13mL PG（V/V）。

将保存在液氮罐中的不同年份个保存的冻精运送到烟台天源水产公司，将上 述冷冻保存的夏鲆冻精解冻采用37℃水浴解冻，将冻存管盒从液氮罐的层架中取 出，放置于存有液氮的保温盒中，从冻存盒中用镊子快速取出冻存管置于37℃水 浴锅中轻轻摇动约90s，然后将冻存管置于18℃水浴中轻轻摇动约30s，然后置 于0-4℃的冰盒中存放；

解冻后的冻精人工受精前再以1:3的体积比与稀释液混合于10ml离心管中， 以800g的离心力离心5min进行洗脱，然后去掉上清液，获得与稀释前同样体积 的冻精悬液，放置于0-4℃冰盒中随时准备进行人工授精；

采集获得优质牙鲆卵子，将100ml的的烧杯中加入约1ml海水，然后加入5 μL冻精同时加入1-2mL卵子，轻轻混匀；轻轻混匀，静置静置5min；然后洗卵， 用筛绢网过滤，将收集的受精卵放置于新鲜的海水中冲洗3～5次,将受精卵放入 2000ml量筒静置,取上浮卵进行孵化，每个年份的冻精同时做三个平行样。实验 结果显示连续保存的三年的冻精受精率60-90%，孵化率80-90%。