光合作用产物的生产性得以提高的藻类、及其利用

摘要

本发明提供一种光合作用产物的生产性得以提高了的藻类、及其利用。在本发明的藻类中，叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加。另外，本发明的生物量制造方法使用本发明的藻类、或经本发明的藻类制造方法而制得的藻类，来制造生物量。

说明书

技术领域

本发明涉及光合作用产物的生产性得以了提高的藻类、及其利用。具体涉及 光合作用产物的生产性得以了提高的藻类、该藻类的制造方法、以及运用该藻 类的生物量(biomass)制造方法。

背景技术

人们一直期望来自生物量的燃料即生物燃料(例如生物乙醇、生物柴油)能 成为一种可取代化石燃料的燃料。

糖类(例如淀粉)及油脂等是生物燃料的原料，它们通过植物的光合作用而 产生。因此，具有能活跃进行光合作用从而在细胞内积存糖类及油脂等的能力 的植物，就能够用在生物量的生产手法中。目前，在生物量的生产中，主要运 用的是玉米以及大豆。然而玉米以及大豆也被用作食料和饲料。因此人们一直 将生物燃料大量增产所致的食料及饲料的物价高涨，视为一个问题。

对此，作为一种可取代玉米及大豆的生物量生产手法，利用藻类的生物量生 产技术在本领域中受到了关注(例如可参考专利文献1和专利文献2)。利用藻 类的生物量生产技术的利点在于不会与食料及饲料发生竞合，能进行大量增殖 等。

例如藻类中的衣藻，已知其有细胞壁经缺损的变异体、或细胞壁变薄的变异 体(cw15、cw92等)。这些变异体具有易于将DNA从外部导入细胞内的性质， 因此被广泛用于基因导入实验。此外，由于它们的细胞壁易破坏，因此易于收 取细胞内容物。从这一观点看，其能提高生物量的生产性。目前已报告有利用 这些变异体的生物量生产技术。例如在专利文献3中，揭示了一种利用细胞壁 缺损后的衣藻变异体来生产油脂的技术。另外，非专利文献1报告了：细胞壁 经变异(cw15)且淀粉合成基因有缺失的衣藻会向细胞外释放出包含油脂的油 滴。而非专利文献2还作出了以下报告：通过破坏衣藻的细胞壁变异体(cw15) 的淀粉合成基因，便能提高其油脂生产性。此外还有非专利文献3，其就衣藻细 胞壁的变异而作了研究报告。

另外还有一种以藻类中的小球藻作材料，使小球藻生产的淀粉释放至细胞 外，然后用该淀粉进行乙醇发酵的技术(专利文献4)。

[现有技术文献]

专利文献1：日本国专利申请公开“特开平11-196885号公报”；1999年07 月27日公开。

专利文献2：日本国专利申请公开“特开2003-310288号公报”；2003年11 月05日公开。

专利文献3：国际公开第2009/153439号册子；2009年12月23日公开。

专利文献4：日本国专利申请公开“特开2010-88334号公报”；2010年04 月22日公开。

非专利文献1：Zi Teng Wang，Nico Ullrich，Sunjoo Joo，Sabine Waffenschmidt， and Ursula Goodenough(2009)Eukaryotic Cell Vol.8(12)：1856-1868.Algal Lipid  Bodies：Stress Induction，Purification，and Biochemical Characterization in  Wild-Type and Starchless Chlamydomonas reinhardtii.

非专利文献2：Yantao Li，Danxiang Han，Guongrong Hu，David Dauvillee， Milton Sommerfeld，Steven Ball and Qiang Hu(2010)Metabolic Engineering Vol.12 (4)：387-391.Chlamydomonas starchless mutant defective in ADP-glucose  pyrophosphorylase hyper-accumulates triacylglycerol.

非专利文献3：Hyams，J.，Davies，D.R.(1972)Mutation Research 14(4)： 381-389.The induction and characterisation of cell wall mutants of Chlamydomonas  reinhardi.

发明内容

[本发明所要解决的课题]

然而上述使用藻类的生物量生产技术在生产性方面存在问题。例如，在异养 条件下用乙酸等碳源培养藻类来生产生物量时，为了诱发藻类生产/积存生物量， 需要通过营养限制步骤来使其处于氮贫乏状态等。由于藻类通常是用含氮的培 养液来培养增殖的，因此为了使其处于氮贫乏状态，就得换用不含氮的培养液。 因此有工序变复杂、生产性下降、成本升高的问题。

本发明是就上述现有的问题而研发的，目的在于提供一种能在不进行营养限 制步骤的情况下提高生物量生产性的藻类、及其利用。

[用以解决课题的技术方案]

本发明的发明者们以解决上述课题为主要目的，进行了各种研究。结果发现， 通过人工地使藻类增加其叶绿体内的谷胱甘肽浓度，即使不进行氮贫乏状态等 的营养限制步骤，也能提高藻类细胞内的生物量生产性。由此，完成了本发明。

即，本发明的藻类的特征在于：叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加。

本发明的藻类的制造方法用以制造上述藻类，其特征在于包含：使藻类叶绿 体内的谷胱甘肽浓度增加的谷胱甘肽浓度增加步骤。

本发明的生物量制造方法的特征在于：使用本发明的藻类、或经本发明的藻 类的制造方法而制得的藻类。

本发明的生物量制造方法的特征在于包含：在用来增加藻类叶绿体内谷胱甘 肽浓度的物质的存在下，培养该藻类的步骤。

[发明效果]

由于本发明的藻类的叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加，因而即使不使其处 于氮贫乏状态，也能提高藻类细胞内的光合作用产物的生产性。因此，若使用 本发明的藻类，便不需要通过将培养液换成不含氮的培养液来引发光合作用产 物的积存。也就是说，通过本发明，能容易且有效地引发光合作用产物的积存。 因此相比于现有技术，本发明的生物量制造方法能廉价且高效地用藻类来制造 生物量。

本发明的其他目的、特征和优越点在以下的记述中将会十分明了。另外，本 发明的益处将通过以下的说明和附图而变得明确。

附图说明

图1表示实施例1中制成的GSH1过剩表达株的增殖能力及淀粉生产能力的 调查结果，(a)是表示GSH1过剩表达株的增殖能力的图表，(b)是表示培养 开始309小时后的培养液状态的图，(c)是表示试料4的淀粉遇碘反应结果的 图。

图2表示母株(野生型株)的增殖能力及淀粉生产能力的调查结果，(a)是 表示母株(野生型株)的增殖能力的图表，(b)是表示培养开始215小时后的 培养液状态的图。

图3表示试料8的母株(野生型株)状态的调查结果，(a)是试料8的母株 (野生型株)中的发出叶绿素荧光的细胞(颗粒)的直方图，(b)试料8的母 株(野生型株)培养物中的浮游颗粒的大小、与颗粒内部复杂度之间的相关图。

图4表示试料4的GSH1过剩表达株的状态的调查结果，(a)是试料4的 GSH1过剩表达株中的发出叶绿素荧光的细胞(颗粒)的直方图，(b)是试料4 的GSH1过剩表达株培养物中的浮游颗粒的大小、与颗粒内部复杂度之间的相 关图。

图5的(a)是试料9和试料10中的发出叶绿素荧光的颗粒(即细胞)的密 度、和不发出叶绿素荧光的颗粒(即淀粉颗粒)的密度在时间上变化的图表，(b) 是试料9和试料10的每份培养液中的淀粉量在时间上变化的图表，(c)是试料 9和试料10中每单个细胞的换算淀粉量在时间上变化的图表；(b)及(c)的凡 例中的“TAP通常”、“TAP N-free”分别代表“含氮源的TAP培养基”、“不含 氮源的TAP培养基”的意思。

图6的(a)是试料11和试料12中的发出叶绿素荧光的颗粒(即细胞)的 密度、和不发出叶绿素荧光的颗粒(即淀粉颗粒)的密度在时间上变化的图表， (b)是试料11和试料12的每份培养液中的淀粉量在时间上变化的图表，(c) 是试料11和试料12中每单个细胞的换算淀粉量在时间上变化的图表；(b)及 (c)的凡例中的“TAP通常”、“TAP N-free”分别代表“含氮源的TAP培养基”、 “不含氮源的TAP培养基”的意思。

图7的(a)是GSH1过剩表达株和母株(野生型株)中发出叶绿素荧光的 颗粒的密度、和不发出叶绿素荧光的颗粒的密度在时间上变化的图表，(b)是 每份培养液中的淀粉量在时间上变化的图表。

图8是GSH1过剩表达株和母株(野生型株)的淀粉遇碘反应结果的图。

图9是GSH1过剩表达株的增殖能力的调查结果图。

图10表示的是进行各后代接续时的GSH1过剩表达株状态的调查结果，(a) 是实施了图9所示“后代接续1”时的GSH1过剩表达株的细胞大小与细胞内部 复杂度之间的相关关系图，(b)是实施了图9所示“后代接续2”时的GSH1过 剩表达株的细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图，(c)是实施了图9 所示“后代接续3”时的GSH1过剩表达株的细胞大小与细胞内部复杂度之间的 相关关系图。

图11是GSH1过剩表达株释放到其细胞外的淀粉颗粒的形状的观察结果图， (a)是用扫描电子显微镜观察淀粉颗粒的结果图，(b)是GSH1过剩表达株释 放到其细胞外的淀粉颗粒的遇碘反应结果图，(c)表示了培养基中添入的GSH 合成酶抑制剂BSO的最终浓度达到8mM时的、GSH1过剩表达株的淀粉生产能 力。

图12表示GSH1过剩表达株的油脂产生能力的调查结果，(a)是母株(野 生型株)中发出尼罗红(nile-red)所致荧光的细胞的直方图，(b)是GSH1过 剩表达株中发出尼罗红所致荧光的细胞的直方图，(c)是用共焦激光显微镜观 察经尼罗红染色的母株(野生型株)的观察结果图，(d)是用共焦激光显微镜 观察经尼罗红染色的GSH1过剩表达株的观察结果图。

图13表示GSH1过剩表达株的状态调查结果，(a)是GSH1过剩表达株的 细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图，(b)是GSH1过剩表达株的细 胞大小与尼罗红所致荧光的强度之间的相关关系图，(c)是(b)的方框区域中 的、细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图，(d)是母株(野生型株) 的细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图。

图14是气相色谱质量分析的结果图。

图15表示GSH1过剩表达株(sta6^-背景)和其母株(sta6^-)的状态的调查 结果，(a)是母株(sta6^-)的细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图，(b) 是GSH1过剩表达株(sta6^-背景)的细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关 系图。

图16表示预培养后、以及培养基交换后第3天的GSH1过剩表达株(sta6^-背景)和其母株(sta6^-)的油脂生产能力的调查结果，(a)是预培养后的GSH1 过剩表达株(sta6^-背景)和其母株(sta6^-)中发出尼罗红所致荧光的细胞的直 方图，(b)是培养基交换后第3天的GSH1过剩表达株(sta6^-背景)和其母株 (sta6^-株)中发出尼罗红所致荧光的细胞的直方图。

图17是实施例1中制备的GSH1过剩表达株的叶绿素量的调查结果图。

图18表示从蓝藻性状转换体即E.c.gshA阳株及E.c.gshA阴株中提取出的色 素类的吸收光谱的调查结果，(a)表示E.c.gshA阳株的吸收光谱，(b)表示 E.c.gshA阴株的吸收光谱，(c)表示从E.c.gshA阳株的吸收光谱中减去E.c.gshA 阴株的吸收光谱后的光谱图。

图19的(a)是试料9和试料10中发出叶绿素所致荧光的颗粒(即细胞) 的密度、以及不发出叶绿素所致荧光的颗粒(即淀粉颗粒)的密度在时间上的 变化的图表，(b)是试料9和试料10的单份培养液中的淀粉量在时间上的变化 的图表，(c)是试料9和试料10中每单个细胞的换算淀粉量在时间上的变化的 图表。(b)及(c)的凡例中的“TAP通常”、“TAP N-free”分别代表“含氮源 的TAP培养基”、“不含氮源的TAP培养基”的意思。

图20的(a)是试料11和试料12中发出叶绿素所致荧光的颗粒(即细胞) 的密度、以及不发出叶绿素所致荧光的颗粒(即淀粉颗粒)的密度在时间上的 变化的图表，(b)是试料11和试料12的单份培养液中的淀粉量在时间上的变 化的图表，(c)是试料11和试料12中每单个细胞的换算淀粉量在时间上的变化 的图表。(b)及(c)的凡例中的“TAP通常”、“TAP N-free”分别代表“含氮 源的TAP培养基”、“不含氮源的TAP培养基”的意思。

具体实施方式

以下详细说明本发明的实施方式。但本发明并不限于以下的实施方式，也能 实现在记述范围内添加了各种变形后的实施方式。另外，本说明书中记载的学 术文献以及专利文献均是在本说明书中作为参考而引用的。此外，本说明书中 除特别讲明的情况以外，“A～B”这一数值范围表达方式均指“A以上且B以 下”的意思。

〔1.本发明的藻类〕

本发明的藻类只要是叶绿体内的谷胱甘肽浓度得到了增加的藻类即可，其他 结构并无限定。但本发明优选是光合作用产物的生产性得到了提高的藻类。

在此，本发明中所谓的“叶绿体内的谷胱甘肽浓度得到了增加”是指：与同 种野生型藻类的叶绿体内的谷胱甘肽浓度相比，叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所 增加的意思。作为优选，在与经同等条件栽培的同种野生型藻类叶绿体内的谷 胱甘肽浓度进行了比较后，若结果为叶绿体内谷胱甘肽浓度达到1.1倍以上，则 判断为叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加。更优选的，若在t测定中获得了5％ 级别的有意义差，则判断为叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加。另外，优选以 同一方法，同时地测定野生型藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度。但也可以使用至 今所积累的背景数据。

可以运用使roGFP2存在于叶绿体内的这一方法，来直接测定藻类叶绿体内 的谷胱甘肽浓度(例如可参照以下文献：MeyerAJ，et al.(2007)Plant Journal 52： 973-986.Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for  the redox potential of the cellular glutathione redox buffer；以及，Gutscher M，et al. (2008)Nat Methods 5：553-559.Real-time imaging of the intracellular glutathione  redox potential.)。在此，roGFP2是一种以色调变化来反映氧化还原状态的分子 探针(probe)。此外，还可以把与谷胱甘肽的生物合成体系相关的蛋白质的表达 量、或编码该蛋白质的多核苷酸的表达量作为一种指标，当这些指标有所增加 时，便可间接地测出谷胱甘肽浓度的增加。关于蛋白质以及多核苷酸的表达量 的测定方法，可以利用现有公知的技术手法。

上述“谷胱甘肽”包括还原型谷胱甘肽(以下简称“GSH”)以及氧化型谷 胱甘肽(以下简称“GSSG”)。在本发明的方法中，只要使GSH和GSSG的其 中某一种谷胱甘肽浓度有所增加即可，但也可使GSH和GSSG这两方的浓度有 所增加。

另外，所谓“光合作用产物的生产性得到提高”，是指与同种野生型藻类的 光合作用产物的生产性相比，光合作用产物的生产性有所提高的意思。作为优 选，与经同等条件栽培的同种野生型藻类的光合作用产物的生产性进行了比较 后，若结果是叶光合作用产物的生产性达到1.1倍以上，则判断为光合作用产物 的生产性有所提高。更优选的，若在t测定中获得了5％级别的有意义差，则判 断为光合作用产物的生产性有所提高。关于生产性，例如可从以下等各种方面 来进行评价：光照条件(光量、强度、时间等)、投予的营养素、是否需要进行 在每一单位时间内令其处于氮贫乏的步骤、培养温度。

本说明书中，上述“光合作用产物(photosynthate)”是指藻类通过光合作 用下的碳固定而产生的物质。具体例如指糖类(例如淀粉)、油脂等这些生物量 及其派生物(代谢产物等)。此处所谓的“光合作用下的碳固定”，是指利用源 自光能的化学能来进行的各种碳化合物代谢。因此，进入代谢体系内的碳的来 源不仅包括二氧化碳等无机化合物，还包括乙酸等有机化合物。

本说明书中，上述“藻类”只要具有光合作用能力且能生成光合作用产物， 则无特别限定。关于上述藻类，例如有归类于绿藻植物门绿藻纲的微藻。具体 例如有：属于绿藻纲衣藻属的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、m-衣藻 (Chlamydomonas moewusii)、衣滴虫(Chlamydomonas eugametos)、s-衣藻 (Chlamydomonas segnis)等；属于绿藻纲杜氏藻属的杜氏盐藻(Dunaliella  salina)、t-杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)、p-杜氏藻(Dunaliella primolecta)；属 于绿藻纲小球藻属的小球藻(Chlorella vulgaris)、蛋白核小球藻(Chlorella  pyrenoidosa)等；属于绿藻纲红球藻属的雨生红球藻(Haematococcus pluvialis) 等；属于绿藻纲绿球藻属的绿球藻(Chlorococcum littorale)等；属于绿藻纲或 黄绿藻纲葡萄属的布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)等；属于绿藻纲绿囊藻 (Choricystis)属的小绿囊藻(Choricystis minor)等；属于绿藻纲微细绿藻属的 微细绿藻(Pseudochoricystis ellipsoidea)等；属于硅藻纲双眉藻属的双眉藻 (Amphora sp.)等；属于硅藻纲菱形藻属的菱形藻(Nitzschia alba)、新月菱形 藻(Nitzschia closterium)、菱形滑藻(Nitzschia laevis)等；属于涡鞭毛藻纲隐 甲藻属的寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)等；属于裸藻纲眼虫属的眼虫 (Euglena gracilis)、近轴眼虫(Euglena proxima)等；属于纤毛虫门草履虫属的 绿草履虫(Paramecium bursaria)等；属于蓝藻门蓝菌属的蓝细菌(Synechococcus  aquatilis)、细长聚球藻(Synechococcus elongatus)等；属于蓝藻门螺旋藻属的 钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)、盐泽螺旋藻(Spirulina subsalsa)等；属于蓝 藻门原绿球藻属的海洋原绿球藻(Prochlorococcus marinus)等；属于蓝藻门卵 囊藻属的多形卵胞藻(Oocystis polymorpha)等。

关于叶绿体内谷胱甘肽浓度有所增加的藻类的获取方法，并无特别限定。其 获取方法将在后文栏目“2.本发明的藻类的制造方法”中具体说明。

在本发明的藻类的叶绿体中，优选从γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(以下也称 “GSH1”)、谷胱甘肽合成酶(以下也称“GSH2”)、ATP硫酸化酶、腺苷5′-磷 酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半胱氨酸合成酶、以及丝氨酸乙酰转移酶所 组成的群族中选择的至少一类蛋白质的表达量及/或活性得到了增加。这些蛋白 质是与叶绿体内的谷胱甘肽合成体系相关的酶，因此只要这些酶的表达量有所 增加，便能掌握叶绿体内的谷胱甘肽浓度的增加。

另外，本发明的藻类中也可以导入：编码从GSH1、GSH2、ATP硫酸化酶、 腺苷5′-磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半胱氨酸合成酶、以及丝氨酸乙酰 转移酶所组成的群族中选择的至少一类蛋白质的多核苷酸。对于导入有该外源 性多核苷酸且有(过剩)表达的藻类，可以说其是叶绿体内谷胱甘肽浓度得到 了增加的藻类。

也可以说，本发明提供一种性状转换藻类，该性状转换藻类中导入有编码从 GSH1、GSH2、ATP硫酸化酶、腺苷5′-磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半 胱氨酸合成酶、以及丝氨酸乙酰转移酶所组成的群族中选择的至少一类蛋白质 的多核苷酸，且该性状转换藻类的叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加。当然， 该性状转换藻类还是光合作用产物的生产性有所提高的藻类。

另外，在本发明的藻类中，编码上述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸可 以选自由以下多核苷酸(a)～(d)所组成的群族。

多核苷酸(a)，其编码：含有序列编号1所示氨基酸序列的多肽；

多核苷酸(b)，其含有序列编号1所示氨基酸序列经过了1个或多个氨基酸 的缺失、取代、或附加后的氨基酸序列，且编码具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 活性的多肽；

多核苷酸(c)，其含有序列编号2所示的碱基序列；

多核苷酸(d)，其具有在严格条件下和含有与上述多核苷酸(a)～(c)中 任意方互补的碱基序列的多核苷酸进行了杂交的能力，且编码具有γ-谷氨酰半 胱氨酸合成酶活性的多肽。

上述多核苷酸(a)～(d)将在后文中详述。

对于本发明的藻类，可以通过现有公知的PCR法、萨瑟恩印迹杂交法 (southern hybridization)、诺森印迹杂交法(northern hybridization)等来确认上 述多核苷酸已被导入细胞内。另外，还能通过现有公知的免疫学手法，对上述 多核苷酸编码的蛋白质的表达进行测定和确认。此外，还能通过现有公知的生 化学手法，对上述多核苷酸编码的蛋白质所表现出的酶活性进行测定和确认。

由于本发明的藻类的叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加，因此即使不在氮贫 乏状态下，也能引发在藻类细胞内生产及/或积存光合作用产物。因此，若使用 本发明的藻类，就无需换用不含氮的培养液来引发光合作用产物的积存。

以下，通过与野生型藻类作对比，来说明本发明的作用效果。首先，在异养 条件(在有乙酸等碳源的情况下)下使藻类处于氮贫乏状态，此时的野生型藻 类在其增殖期会在细胞内积存稍许的光合作用产物，另外，在其稳定期虽然会 积存光合作用产物，但其细胞外几乎检测不到光合作用产物。与此相比，本发 明的藻类无论在其增殖期(对数增殖期)还是在其稳定期均生产/积存光合作用 产物，且在其细胞外检测到了多量的光合作用产物。另外，在异养条件下使藻 类处于非氮贫乏状态时，野生型藻类在其增殖期于细胞内仅积存极少的光合作 用产物，而其稳定期的光合作用产物积存量会进而下降，且细胞外几乎检测不 到光合作用产物。另一方面，本发明的藻类无论在其增殖期还是在其稳定期均 生产/积存光合作用产物，且在其细胞外检测到了多量的光合作用产物。

其次，在自养条件(依靠光合作用下的二氧化碳固定来进行增殖)下时，为 了引发野生型藻类在氮贫乏状态下积存光合作用产物，其所需光量一般要高于 异养条件下时的所需光量。与此相比，本发明的藻类无需特意增大光强度，便 能连续产生光合作用产物。当然，照射的光越强，本发明的藻类的光合作用产 物生产性也就越高。例如将衣藻用于本发明中，从衣藻的特性来看，照射越强 的光则越利于光合作用产物的生产。但本发明的藻类的特点在于：相比于野生 型藻类，光量对光合作用产物积存的限制是极小的。

此外，本发明的藻类具有能维持低密度栽培的特征。因此本发明的藻类的光 利用率较高。所以与同种野生型藻类相比，在同等光量(亮度)下，本发明的 藻类能生产/积存更多的光合作用产物。通常，当细胞密度处在适当级别(例如 细胞密度被维持得低于野生型藻类)时，从光利用效率的观点看，该细胞还是 有用的。也就是说，随着细胞密度的上升，位于培养槽表面的细胞会导致“日 阴效应”，而这会减弱到达培养槽深处的光，因此有光合作用产物的生产能力达 到尽头的问题。而本发明的藻类，由于其培养密度可维持得低于野生型藻类， 因此能避免上述的问题。

再之，本发明的藻类能随着培养时间的增加而线性增加其淀粉颗粒的积存 量。因此，通过补充水或添加培养基来维持上述培养状态，也就是通过连续培 养，便能连续地生产光合作用产物(例如连续生产出淀粉的颗粒等)。

相比于野生型藻类，本发明的藻类留有供增加培养密度的较大空间余地。通 过人工操作(例如经过滤步骤等，来降低细胞分散介质(例如水)的含量)，能 将本发明的藻类的培养密度提高到光合作用产物的饱和生产上限，由此能有效 地生产光合作用产物。

另外，本发明的藻类中休止细胞很少。因此，若用本发明的藻类来制造生物 量，便有良好的收率，且能节约培养液。另外，由于废弃物较少，所以能降低 废弃物的处理费(脱水、焚烧、地埋)，因此尤其利于批次培养。此外，废弃物 少，就意味着有助于收率的增加。具体比如说葡萄酒的酿造，其发酵后废弃物 中的固体几乎都是细胞，而本发明的藻类在释放淀粉颗粒的同时，其细胞破裂 而自我分解，因此死细胞的分解物可成为其他细胞的养分，所以收率可得到提 高。

此外，本发明的藻类能将其细胞内积存的光合作用产物排出到细胞外，因此 能容易地收取光合作用产物。例如，当光合作用产物为淀粉时，能够在不挤碎 藻类细胞的情况下，使经光合作用而积存的淀粉以颗粒的方式排出到细胞外。 因此，若用本发明的藻类来制造生物量，便能相对容易地进行淀粉提纯。

本发明的藻类所生成的淀粉颗粒的特征在于很细小。用例如玉米、马铃薯、 小麦等制成的一般淀粉颗粒的平均粒径为10μm～50μm。与此相比，本发明的藻 类所生成的淀粉颗粒的尺寸均匀且细小，其平均粒径为：长径1.3μm(标准差为 0.181)，短径1.0μm(标准差为0.204)。稻子以及南美藜麦等虽然会生成平均粒 径2～3μm的细小淀粉颗粒，但它们也与玉米、马铃薯、小麦等中生成的淀粉颗 粒同样，是通过汇集而形成组织化胚乳的。因此，在将玉米、马铃薯、小麦、 稻子、南美藜麦用作原料时，需要通过细磨等这些费成本的处理来将其制备成 呈颗颗散开状态的细小淀粉颗粒。这些细小淀粉颗粒有助于医药品的制造。也 就是说，若使用本发明的藻类，便能大量生产细小且尺寸均匀的淀粉颗粒，且 由于淀粉颗粒被排出藻类细胞外，所以能相对容易地进行提纯。而且这些淀粉 颗粒不用进行磨碎等处理，便已是颗颗散开的状态。

如上所述，与玉米、马铃薯、小麦等所生成的一般淀粉颗粒相比，GSH1过 剩表达株所生成的淀粉颗粒较细小。这些细小的淀粉颗粒对于医药品的制造是 很有用的。具体为，由于该细小的淀粉颗粒小于肺的细支气管的内径，因此能 期待将其用作将肺疾患治疗药输送到细支气管的载体(治疗药与淀粉细小颗粒 组合而成的干粉吸入剂)。

另外，通过在淀粉颗粒的表面上提呈肽性抗原，便能期待将其运用在所谓的 “口服疫苗”中(例如在Dauville′e et al.2010，PLos One 5卷12号，e15424中， 以及在日本特表2003-500060号公报(日本专利申请特愿2000-620111号)中揭 示了在衣藻产生的淀粉颗粒的表面上提呈疟疾抗原的技术。)。

谷胱甘肽是用来调节细胞内的氧化还原状态的物质，已知其能作为细胞或器 官的分化调节剂而发挥功能(参照国际公开第01/080638号册子)，还知其能作 为植物生长调整助剂而发挥功能(参照日本国专利申请公开公报“特开 2004-352679号公报”)。

然而仅凭谷胱甘肽的上述现有公知功能，并不能预测到本发明的以下效果 等：在增加了藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度的情况下，即便不使藻类处于氮贫 乏状态，也能引发藻类在其细胞内积存光合作用产物，且能使藻类细胞内积存 的光合作用产物排出到细胞外。

相比于现有技术，通过使用本发明的藻类，便不仅能简单且高效地引发光合 作用产物的积存，还能简单且高效地收取光合作用产物。因此，通过将本发明 的藻类用在后述的生物量制造方法中，便能比现有技术廉价且高效地用藻类来 制造生物量。

〔2.本发明的藻类的制造方法〕

本发明的藻类制造方法(以下称“本发明的藻类的制造方法”)用以制造叶 绿体内谷胱甘肽浓度、及光合作用产物生产性相比于野生型藻类有所提高的上 述藻类(本发明的藻类)。本方法至少包含使藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加 的谷胱甘肽浓度增加步骤即可。其他条件、步骤等的技术方案并无特别限定。

以下具体说明本发明的藻类的制造方法。

(1.谷胱甘肽浓度增加步骤)

谷胱甘肽浓度增加步骤，是使藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加的步骤。

在此，上述“使藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加”是指：相比于同种野生 型藻类，叶绿体内的谷胱甘体浓度有所增加的意思。换而言之，经谷胱甘肽浓 度增加步骤后的藻类相比于同种的野生型藻类，具有高谷胱甘肽浓度。可根据 〔1.本发明的藻类〕栏目中叙述的方法，来判断得知藻类叶绿体内的谷胱甘肽 浓度相比于同种野生型藻类株有所增加。

只要谷胱甘肽浓度增加步骤的结果是使叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加， 则不对谷胱甘肽浓度增加步骤中的、使藻类叶绿体内谷胱甘肽浓度增加的方法 加以特别限定。例如能通过以下方法等来获得上述结果：方法(i)，运用公知的 变异诱发法，诱发目标藻类的随机变异；方法(ii)，向细胞内导入(视情况不 同，也会向藻类的基因组内导入)使叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加的物质。

以下具体说明上述方法(i)和方法(ii)。

(i)诱发藻类的随机变异的方法

诱发藻类的随机变异的方法并无特别限定，可适当地选择运用公知的方法。 具体例如有以下的方法等：用化学物质(例如EMS、NTG等)对藻类进行处理； 利用放射线来诱发变异；利用转位子来诱发变异；利用T-DNA来诱发变异；利 用原核细胞与真核细胞的结合来诱发变异；物理性地用基因枪来诱发变异。例 如，对于GSH1、GSH2、ATP硫酸化酶、腺苷5′-磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还 原酶、半胱氨酸合成酶、丝氨酸乙酰转移酶等这些与叶绿体内的谷胱甘肽合成 体系相关的蛋白质，可以通过上述的方法来诱发编码这些蛋白质的多核苷酸发 生变异，以提高这些蛋白质的表达量及/或活性，其结果是绿体内的谷胱甘肽浓 度有所增加，然后收取叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加的藻类即可。

关于发生了期望变异的藻类的筛选方法，可利用公知手法，其并无特别限定。 例如有以下的方法等：通过可直接测定上述叶绿体内谷胱甘肽浓度的方法，来 收取谷胱甘肽浓度有所增加的变异藻类；GSH1、GSH2、ATP硫酸化酶、腺苷 5′-磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半胱氨酸合成酶、丝氨酸乙酰转移酶等 这些蛋白质的表达量及/或活性得以了增加的变异藻类的取得方法。

(ii)向细胞内导入使叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加的物质的方法

作为上述“使叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加的物质”，例如可以采用：编码 用以使藻类叶绿体内谷胱甘肽浓度增加的蛋白质的多核苷酸(A)；针对导致藻 类叶绿体内谷胱甘肽浓度下降的蛋白质，而具有降低该蛋白质表达量的功能的 多核苷酸(B)。通过导入该多核苷酸(A)、多核苷酸(B)，便能获取叶绿体内 谷胱甘肽浓度得到了增加的藻类。上述多核苷酸(A)或(B)可单独使用，也 可以并用。

本说明中所用的术语“多肽”，能和“肽”或“蛋白质”换用。另外，本说 明书中所用的术语“多核苷酸”，能和“基因”、“核酸”或“核酸分子”换用， 其意思是指核苷酸的聚合物。

所谓“导入多核苷酸”，只要作为导入对象的多核苷酸存在于藻类细胞内即 可。另外，所谓“导入多核苷酸”，也包括以下情况：作为导入对象的多核苷酸 被插入(导入)在藻类基因组中。可以通过现有公知的PCR法、萨瑟恩印迹杂 交法、诺森印迹杂交法等来确认多核苷酸已导入在藻类细胞内。

通过在藻类细胞内导入上述多核苷酸(A)的至少1种，便能使用以增加叶 绿体内谷胱甘肽浓度的蛋白质的表达量得到增加，其结果是能使叶绿体内的谷 胱甘肽浓度增加。

作为此类多核苷酸，可优选例如：编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸 (以下有时也称“GSH1基因”)、编码谷胱甘肽合成酶的多核苷酸(以下有时也 称“GSH2基因”)、编码ATP硫酸化酶的多核苷酸、编码腺苷5′-磷酸硫酸酯还 原酶的多核苷酸、编码亚硫酸还原酶的多核苷酸、编码半胱氨酸合成酶的多核 苷酸、编码丝氨酸乙酰转移酶的多核苷酸等。这些多核苷酸优选是来源于植物 的多核苷酸，更优选是宿主藻类自己所拥有的多核苷酸。但也能较好地采用来 源于宿主藻类以外的藻类的多核苷酸、或来源于其他高等植物的多核苷酸。

上述“γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH1)”是指：使谷氨酸在γ位上与半胱 氨酸发生酰胺缩合，以合成γ-谷氨酰半胱氨酸的酶。另外，上述“谷胱甘肽合 成酶(GSH2)”是指：使甘氨酸附加到γ-谷氨酰半胱氨酸上，以合成谷胱甘肽 的酶。

上述“GSH1基因”并无特别的具体限定例。作为本发明中优选的GSH1基 因的一种，例如有本发明的发明人在实施例中使用的衣藻的GSH1基因 (CHLREDRAFT_181975)。该衣藻的GSH1包含序列编号1所示的氨基酸序列， 编码该GSH1的基因(全长cDNA)包含序列编号3所示的碱基序列。在序列编 号3所示的碱基序列中，第134位～第136位为起始密码子，第1571位～1573 位为终止密码子。即，衣藻GSH1基因拥有：占据序列编号3所示碱基序列中 第134位～第1573位的开放阅读框(ORF)。序列编号2所示的碱基序列是衣 藻GSH1基因中的ORF的碱基序列。衣藻GSH1基因的翻译产物在其N末端区 域具有叶绿体跨膜转移信号肽。因此，衣藻GSH1基因的翻译产物，也就是衣 藻的GSH1，一般存在于叶绿体中。

在本发明中，被导入藻类的核苷酸优选例如是以下的多核苷酸(a)～(d)。

多核苷酸(a)，其编码：含有序列编号1所示氨基酸序列的多肽；

多核苷酸(b)，其含有序列编号1所示氨基酸序列经过了1个或多个氨基酸 的缺失、取代、或附加后的氨基酸序列，且编码具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 活性的多肽；

多核苷酸(c)，其含有序列编号2所示的碱基序列；

多核苷酸(d)，其具有在严格条件下和含有与上述多核苷酸(a)～(c)中 任意方互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交的能力，且编码具有γ-谷氨酰半胱 氨酸合成酶活性的多肽。

序列编号2表示的是：一例编码含有序列编号1所示氨基酸序列的多肽的碱 基序列。

在此，上述“经过了1个或多个氨基酸的缺失、取代、或附加后”是指：局 部特异性突变诱发法等这些公知的变异肽制备法所可能实现的缺失数量、取代 数量或附加数量(该数量优选是10个以下，更优选是7个以下，尤其优选是5 个以下)的氨基酸发生缺失、取代或附加的意思。此类变异蛋白质并不限于是 经公知的变异肽制备法而人工引发有变异的蛋白质，也可以是天然的蛋白质经 分离纯化后的产物。

蛋白质的氨基酸序列中的一部分氨基酸，能在实质不影响该蛋白质的构造或 功能的情况下容易地进行改变。这在本领域中是周知的。此外，不光是经人工 改变的蛋白质变异体，天然蛋白质中也存在不会实质改变该蛋白质的构造或功 能的变异体。这在本领域中也是周知的。

所优选的变异体是，经过了保留性或非保留性的氨基酸取代、氨基酸缺失、 或氨基酸添加后的产物。优选经过了同义取代、添加、以及缺失，尤其优选经 过了保留性的取代。这些变异体不会改变本发明的多肽的活性。

具代表性的保留性取代，例如有以下情形：脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu、 以及Ile这些中的某1类氨基酸被其他氨基酸取代；羟基残基Ser与Thr互换； 酸性残基Asp与Glu互换；在酰胺残基Asn与Gln间的区间进行取代；碱性残 基Lys与Arg互换；在芳香族残基Phe与Tyr间的区间进行取代。

本说明书，上述“严格条件”是指，仅在序列间具有至少90％的一致度时， 优选仅在具有至少95％的一致度时，更优选仅在具有至少97％的一致度时，才 发生杂交。具体例如是指以下条件：以42℃，在杂交溶液(含50％甲酰胺、5 ×SSC(150mM的Nacl、15mM的柠檬酸三钠)、50mM的磷酸钠(pH7.6)、5 ×邓哈特溶液、10％硫酸葡萄糖、以及20μg/mL的剪断改性的鲑鱼精子DNA) 中培养(incubation)一晚后，在0.1×SSC中以65℃来清洗滤膜。

关于杂交，可以运用Sambrook等人的Molecular Cloning，A Laboratory  Manual，3rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)中记载的周知方法来进行。 一般而言，温度越高或盐浓度越低，严格度就越高(杂交越困难)，但能获得相 同性较高的多核苷酸。

关于氨基酸序列以及碱基序列的一致度，可利用Karlin和Altschul提出的 BLAST算法(Karlin S，Altschul SF，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：2264-2268 (1990)；Karlin S，Altschul SF，Proc.Natl.Acad Sci.USA，90：5873-5877(1993)) 来决定。针对BLAST算法，目前已开发出了称为BLASTN、BLASTX的运算 程序(Altschul SF，et al.，J.Mol.Biol.，215：403(1990))。

在本发明中，上述“γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性”是指，帮助谷氨酸在γ 位上与半胱氨酸发生酰胺缩合反应的催化活性。“γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活 性”例如可根据以下方法来确定：对溶液实施氮取代等来防止氧化，然后对挤 碎了的藻类进行离心分离而获得上清质，将该上清质作为试料而对其添加含有 半胱氨酸、谷氨酸以及ATP的反应液，然后求取在给定时间内合成出的“γ-谷 氨酰半胱氨酸”的量。另外，也可以对该合成反应中附随生成的磷酸进行定量， 由此换算出“γ-谷氨酰半胱氨酸”的量。

关于来自衣藻以外的植物的GSH1基因，已知的例如有：阿拉伯芥(TAIR  Accession Gene：2127172、Name AT4G23100.1)、百日草(Genbank accession： AB158510)、稻子(Genbank accession：AJ508915)、烟草(Genbank accession： DQ444219)等的GSH1基因。这些GSH1基因也能较好用在本发明中。另外这 些基因的翻译产物也与衣藻同样，在N末端区域具有叶绿体跨膜转移信号肽。

另外，通过将上述多核苷酸(B)导入藻类细胞内，便能降低导致叶绿体内 谷胱甘肽浓度下降的蛋白质的表达量。其结果是能使叶绿体内的谷胱甘肽浓度 得到增加。关于此类多核苷酸，例如有用在现有公知的RNA干扰(RNA  interference；RNAi)法中的双链RNA(dsRNA)、siRNA(short interfering RNA)、 这些RNA的模板DNA等。

关于上述“导致藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度下降的蛋白质”，例如可例举 CLT1等。上述“CLT1”是将谷胱甘肽从叶绿体输送到细胞质的运载体，其最初 发现于阿拉伯芥中，因而得名为CLT1(参照Proc Natl Acad Sci USA(2010)第 107期(5)的2331～2336页)。也就是说，作为上述多核苷酸(B)的一例，例 如有能使CTL1等谷胱甘肽运载体的表达量减少的多核苷酸。

本发明的藻类的制造方法中所用的“多核苷酸”可以来源于基因组DNA， 也可以来源于cDNA，也可以是化学合成出的DNA，还可以是RNA。其可以视 目的而适当选择。

关于本发明的藻类的制造方法中所用的多核苷酸的获取方法，例如若要获取 GSH1基因，则可用公知技术对编码GSH1的DNA片段进行分离，然后进行克 隆。还可以制备出用以与编码衣藻GSH1的DNA的部分碱基序列进行特异杂交 的探针，然后用该探针来筛选基因组DNA文库以及cDNA文库。

另外，作为本发明的藻类的制造方法中所用的多核苷酸的获取方法，例如有 利用PCR等扩增手法来获取该多核苷酸的方法。例如，若要获取GSH1基因， 则可以先针对编码衣藻GSH1的cDNA，根据其5′侧序列和3′侧序列(或这些序 列的互补序列)来分别制备引物，然后以基因组DNA(或cDNA)为模板，用 这些引物来进行PCR等，以扩增夹在两引物间的DNA区域。这样，便能大量 获取编码本发明中所用GSH1的DNA片段(GSH1基因)。至于GSH2基因、 ATP硫酸化酶基因、腺苷5′-磷酸硫酸酯还原酶基因、亚硫酸还原酶基因、半胱 氨酸合成酶基因、丝氨酸乙酰转移酶基因以及CLT1基因，也能用同样的方法来 获取。

本发明中，能以所期望的藻类为提供源，来获取本藻类制造方法中所用的多 核苷酸。

在本发明的藻类的制造方法中，将多核苷酸导入藻类的方法并无特别限定。 例如，可以导入具有该多核苷酸的表达载体，由此将该多核苷酸导入藻类细胞 内。另外，关于表达载体的制作方法，可以运用现有公知的方法，其并无特别 限定。例如可以依照日本国专利申请公开公报“特开2007-43926号公报”以及 日本国专利申请公开公报“特开平10-0570868号公报”中揭示的表达载体制造 法和藻类性状转换法，在被导入体即多核苷酸的上游区，连接针对藻类细胞发 挥功能的启动子，且在该多核苷酸的下游区，连接针对藻类细胞发挥功能中止 子，由此制出重组表达载体，然后将该重组表达载体导入藻类。

作为上述“启动子”，例如可较好地采用PsaD启动子。相比于GSH1基因 的内源性启动子，PsaD启动子的启动活性更强。因此，通过使用PsaD启动子， 便能使γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶更强地表达。另外，由于PsaD基因是与光合作 用相关的基因，因此若使用PsaD启动子来获得表达载体并将该表达载体导入藻 类细胞内，便能通过光照强度来对被导入体，即基因的表达量加以调整。

(2.其他步骤)

本发明的藻类的制造方法中，不仅包含上述“谷胱甘肽浓度增加步骤”，还 可以包含对叶绿体内谷胱甘肽浓度有所增加的藻类进行筛选的筛选步骤。

例如，能以卡那霉素抗性及潮霉素抗性等这些药剂抗性标志物的表达为指 标，通过现有公知的药剂选择法，来选出导入有目标基因的性状转换藻类；然 后，通过PCR法、萨瑟恩印迹杂交法、诺森印迹杂交法等来确认目标基因是否 已导入藻类。例如，可以从性状转换藻类中提取出DNA，然后针对此导入的DNA 来设计特异性引物，并进行PCR，之后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙 烯酰胺凝胶电泳、或毛细管电泳等，并用溴化乙锭等来染色，最后对目标扩增 产物进行检测。如此便能得知藻类已发生了性状转换。

至于叶绿体内谷胱甘肽浓度有所增加的藻细胞个体，可以通过叶绿体内谷胱 甘肽浓度的上述测定方法等来将其筛选出。

叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加后，其结果是光合作用产物的生产性得到提 高。因此能容易地理解到：叶绿体内谷胱甘肽浓度有所增加的藻类，就是光合 作用产物的生产性得以提高了的藻类。至于筛选出的藻细胞个体的光合作用产 物的生产性是否有所提高，可以通过光合作用产物生产性的前述测定方法来进 行确认。

〔3.本发明的生物量的制造方法〕

本发明的生物量的制造方法(以下称“本发明的生物量制造方法”)是：用 叶绿体内谷胱甘肽浓度比野生型藻类有所增加的藻类(本发明的藻类)、或经本 发明的藻类制造方法而制得的藻类，来制造生物量的方法。

关于本发明的藻类，已在“1.本发明的藻类”栏目中作了说明。另外，关 于本发明的藻类的制造方法，已在“2.本发明的藻类的制造方法”栏目中作了 说明。因此在此省略它们的说明。

本说明书中，上述“生物量”是指，藻类经光合作用下的碳固定而产生的物 质。例如指糖类(如淀粉)、油脂等。其也可以换说成“光合作用产物”。

在本发明的生物量制造方法中，引发在藻类细胞内生产或积存光合作用产物 的方法并无特别限定。例如，本发明的生物量制造方法中可以包含：通过向藻 类照射光来引发在藻类细胞内生产或积存光合作用产物的光照射步骤。

在现有方法中，为了引发藻类在其细胞内积存光合作用产物，不仅需要使细 胞处于氮贫乏条件，而且为了促进光合作用产物的显著积存，还需要照射 200μE/m²/秒以上光量的光。然而在本发明的生物量制造方法中，无需特意调节 光量，便能引发光合作用产物的积存。但优选对藻类照射1000μE/m²/秒以下光 量的光，更优选照射500μE/m²/秒以下光量的光，进而逐次优选照射400μE/m²/ 秒以下、300μE/m²/秒以下、200μE/m²/秒以下、150μE/m²/秒以下、100μE/m²/秒 以下、80μE/m²/秒以下光量的光。照射的光量越低，能量利用效率就越高，生产 性也越高。相比于现有的野生型藻类，本发明的藻类的优点是，在低光量下就 能在其细胞内及细胞外产生光合作用产物。照射的光量并无特别的下限，但从 现实性观点看，例如可以将光量设定在40μE/m²/秒以上。

并非需要特别的光照装置来照射落入上述光量范围内的光。例如可以利用： 阳光；经反射镜、光纤、滤光器、光栅等而被调节了性质或物理量的阳光；白 灼灯、荧光灯、水银灯、发光二极管等的人造光。另外，所照射的光可以是适 于一般藻类进行光合作用的波长域下的光，例如优选波长400nm～700nm的光。

另外，本发明的生物量制造方法中，无需在氮贫乏条件下培养藻类来引发在 藻类细胞内生成或积存光合作用产物。因此，上述光照射步骤可以在非氮贫乏 条件下进行。在此，上述“非氮贫乏条件”是指在含有藻类生育上所需的量的 无机态氮的培养液中，进行培养。在此，藻类生育上所需的量是指：以氮原子 来换算时，培养液中的无机态氮占0.001重量％～0.1重量％，优选占0.005重 量％～0.05重量％。上述“无机态氮”是指，例如以氨的形态存在的氮、以亚 硝酸的形态存在的氮、以硝酸的形态存在的氮等。另外，在后述实施例所用的 TAP培养基中，培养液内所含的无机态氮以氮原子来换算时，其约占0.01重 量％。

关于含有藻类生育上所需的量的无机态氮的培养液，可以采用供培养藻类的 一般培养液，其并无特别限定。作为此类培养液，例如有以往所周知的TAP培 养基、HSM培养基、ATCC897培养基等。

在本发明的一实施方式中，通过一边照射45μE/m²/秒的光，一边用TAP培 养基来培养本发明的藻类，便能引发在细胞内积存淀粉。而在另一实施方式中， 通过一边照射80μE/m²/秒的光，一边用TAP培养基来培养本发明的藻类，便能 引发在细胞内积存淀粉。

上述光照射步骤也可以在氮贫乏条件下进行。上述“氮贫乏条件”是指：在 无机态氮的氮原子换算含量为0.001重量％以下的培养液中，进行培养。当在氮 贫乏条件下进行光照射步骤时，例如可以较好地将TAP N-free培养基用作不含 氮的培养液。但培养基并无特别限定。在本发明的一实施方式中，通过一边照 射80μE/m²/秒的光，一边在氮贫乏条件(用TAP N-free培养基)下培养本发明 的藻类，能引发在细胞内积存淀粉。

如上所述，本发明的藻类的特征例如在于：在使藻类产生光合作用产物时， 无需实施氮贫乏状态等这类营养限制步骤。也就是说，在本发明的生物量制造 方法中，实质上能够不进行氮贫乏状态等这类营养限制步骤(实质上不包含氮 贫乏状态等这类营养限制步骤)。由于本发明的藻类具有该特征，因此能简化步 骤，提高光合作用产物的生产性。

另外，光照射步骤也可以在自养条件下进行。在此，上述“自养条件”是指： 除二氧化碳以外，不提供其他碳源来进行培养。具体例如可以一边提供空气， 一边照射光来在HSM培养液中培养本发明的藻类，也就是可以在自养条件下进 行光照射步骤。二氧化碳的提供源并不限于是空气，也可以利用火力发电厂、 炼钢厂等烟道中的二氧化碳。通过向培养基送入浓度高于空气内二氧化碳的二 氧化碳，便能提高生产性。

在自养条件下，可以从培养容器的底部附近送入(通入)二氧化碳或含二氧 化碳的气体。相比于空气而言，二氧化碳在水中的扩散速度极慢，因此需要搅 拌培养基。而通过搅拌培养基，还能使藻类均匀地得到光照。二氧化氮在水中 时为阴离子，因此培养基的缓冲能力若较低，那么培养基会因二氧化碳气体的 导入而偏向酸性侧，于是二氧化碳的溶解度会下降，而导致难以进行光合作用。 所以，培养基优选具有能将自身pH值维持在中性附近或碱性侧的缓冲能力。关 于此类培养基，较好的例如有以往公知的HSM培养基等。

(2.其他步骤)

在本发明的生物量制造方法中，除上述“光照射步骤”以外，还可以包含收 取光合作用产物的步骤。

例如，若光合作用产物是淀粉，那么通过本发明的生物量制造方法，能使细 胞内积存的淀粉以淀粉颗粒的方式排出到细胞外，而且通过收取光合作用产物 的步骤，能将排出在细胞外的淀粉颗粒与藻类分离，之后收取分离出的淀粉颗 粒即可。关于将排出在细胞外的淀粉颗粒与藻类分离的方法，并无特别限定。 例如可以根据淀粉颗粒和藻类细胞的粒径及/或形状等这些物理性质，运用静置 自然沉淀、离心分离、过筛等分离手法来实现分离。

在本发明的生物量制造方法中，可以使用叶绿体内的谷胱甘肽浓度得以增加 了的藻类。至于谷胱甘肽浓度，可以使用能以接触藻类的方式使藻类吸收的物 质来增加谷胱甘肽浓度。也就是说，包含以下步骤的生物量制造方法也属于本 发明的范围，该步骤为：在用以增加藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度的物质的存 在下，培养藻类的步骤。

作为能以接触藻类的方式使藻类吸收且使藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度增 加的物质，具体例如有：谷胱甘肽、谷胱甘肽结合体、活性氧(例如过氧化氢 等)、活性氮、聚胺、氧化钛、茉莉酮酸、水杨酸、半胱氨酸、胱氨酸、重金属 鎘、铁离子。在此，聚胺可以成为过氧化氢的原料。氧化钛可通过光而产生活 性氧。半胱氨酸和胱氨酸是谷胱甘肽的前驱物。重金属鎘、铁离子优选过剩投 予。考虑到成本，尤其优选采用过氧化氢。

关于能以接触藻类的方式使藻类吸收且使藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度增 加的物质，例如可以使藻类进行光合作用时所用的培养液含有该物质，由此便 能使藻类接触并吸收该物质。

在本发明的生物量制造方法中，由于是使用本发明的藻类或经本发明的藻类 制造方法而制得的藻类来制造生物量，因此如后述实施例那样，即使在不照射 强光、不调整成氮贫乏状态的条件下培养藻类，也能引发在藻类细胞内积存光 合作用产物。另外，通过使叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加，便使藻类将其细胞 将内积存的光合作用产物排出到细胞外，因此能容易地收取光合作用产物。也 就是说，相比于现有技术，通过本发明的生物量制造方法，能够容易且有效地 引发光合作用产物的积存并收取光合作用产物。因此，通过本发明的生物量制 造方法，能比现有技术更廉价、高效地用藻类来制造生物量。

在本发明的藻类的叶绿体中，从γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、 ATP硫酸化酶、腺苷5′-磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半胱氨酸合成酶、 以及丝氨酸乙酰转移酶所组成的群族中选择的至少一类蛋白质的表达量及/或活 性也可以有所增加。

本发明的藻类中可以导入有：编码从上述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘 肽合成酶、ATP硫酸化酶、腺苷5′-磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半胱氨 酸合成酶、以及丝氨酸乙酰转移酶所组成的群族中选择的至少一类蛋白质的外 源性多核苷酸。

在本发明的藻类中，编码上述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸可以选自 由以下多核苷酸(a)～(d)所组成的群族：

多核苷酸(a)，其编码：含序列编号1所示氨基酸序列的多肽；

多核苷酸(b)，其含有序列编号1所示氨基酸序列经过了1个或多个氨基酸 的缺失、取代、或附加后的氨基酸序列，且编码具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 活性的多肽；

多核苷酸(c)，其含序列编号2所示的碱基序列；

多核苷酸(d)，其具有在严格条件下和含有与上述多核苷酸(a)～(c)中 任意方互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交的能力，且编码具有γ-谷氨酰半胱 氨酸合成酶活性的多肽。

在本发明的藻类制造方法中，上述谷胱甘肽浓度增加步骤可以是如下步骤： 将编码从γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、ATP硫酸化酶、腺苷5′- 磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半胱氨酸合成酶、以及丝氨酸乙酰转移酶 所组成的群族中选择的至少一类蛋白质的外源性多核苷酸，导入藻类。

本发明的生物量制造方法还可以包含向上述藻类照射光的光照射步骤。

在本发明的生物量制造方法中，上述光照射步骤可以在实质上的非氮贫乏条 件下进行。

本发明并不限于上述各实施方式，可以根据权利要求所示的范围进行各种变 更，适当地组合不同实施方式中记述的技术方案而得到的实施方式也包含在本 发明的技术范围内。

[实施例]

以下具体说明本发明的实施例，但本发明并不限于这些实施例。

〔实施例1〕

<GSH1过剩表达株的制备>

将编码来源于衣藻的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(序列编号1所示)的GSH1 基因(序列编号2所示)，连接至PsaD基因的启动子(PsaD启动子)的下游区， 由此制备了质粒。

具体为，同时使用限制性内切酶EcoR Ⅰ及EcoRⅤ来进行处理，以使衣藻用 载体即环状DNA pSP124S(参照了Plant Journal(1998)Vol.14(4)：441～447页) 开环，然后连接上序列编号4所示的多核苷酸(约3130对碱基)，并使之再次 成环。通过公知的方法，利用大肠杆菌来扩增该环状DNA，然后从大肠杆菌中 提取、纯化了该环状DNA。

序列编号4所示的多核苷酸是通过以下方法制得的。

(1)：用TAP培养基，在24℃、50μE/m²/秒的光照条件下，培养莱茵衣藻 CC503株(美国DuKe大学衣藻中心出让的衣藻)4天。以从该培养物中收集的 细胞为原料，用cDNA合成试剂盒(日本TAKARA BIO株式会社制造的“Solid  phase cDNA synthesis kit”)而调配出了cDNA混合物。以该cDNA混合物为模 板，使用序列编号5及6所示的寡核苷酸，通过公知的方法进行了PCR反应(退 火温度为58℃)，由此收得了作为衣藻GSH1基因的多核苷酸，该多核苷酸包含 开放阅读框(ORF)、以及占据了连在该开放阅读框后的3′UTR区域的、约2270 个连续碱基对。进而，用限制性内切酶EcoR Ⅰ对该多核苷酸的末端构造进行了 加工。

(2)：与上述(1)同样地进行了培养，并以收集的CC503的细胞为原料， 用DNA提取试剂盒(日本GENE株式会社制造的“Isoplant”)而调配出了基因 组DNA。以该基因组DNA为模板，使用序列编号7以及8所示的寡核苷酸， 通过公知的方法进行了PCR反应(退火温度为56℃)，由此收取了作为衣藻PsaD 基因中启动子区域的、约含860个碱基对的多核苷酸。此外，还用限制性内切 酶Hpa Ⅰ对该多核苷酸的末端构造进行了加工。

(3)：使用DNA连接酶(日本东洋纺株式会社制造的“Ligation High”)， 用公知方法来连接了上述方法(1)和(2)中制备的两种多核苷酸。通过以上 的实验操作，制备出了PsaD启动子-GSH1基因的多核苷酸片段。该PsaD启动 子-GSH1基因的多核苷酸片段的一端为平滑末端(blunt end)，另一端为由EcoR Ⅰ剪断出的粘性末端(sticky end)。序列编号4所示的碱基序列中，第853位～ 第855位为起始密码子，第2294位～第2296位为终止密码子。也就是说，衣 藻GSH1基因拥有：占据序列编号3所示碱基序列第853位～第2296位的开放 阅读框(ORF)。

·5’GCTCTCGCCTCAGGCGTT 3’(序列编号5)

·5’GGGGAATTCCTGAGCGAGGGCCTTACAAG 3’(序列编号6)

·5’ATCAGCACACACAGCAGGCTCAC 3’(序列编号7)

·5’TGTTAACCATTTTGGCTTGTTGTGAGTAGC 3′(序列编号8)

用限制性内切酶EcoR Ⅰ，将含有上述所制备的PsaD启动子-GSH1基因的 多核苷酸的质体断开成线状，然后通过电穿孔法(参照Funct.Plant Biol.(2002)， Vol29：231～241页)，将该线状的质体导入了莱茵衣藻(Chlamydomonas  reinhardtii)CC503株(以下简称“衣藻”)。以CC503株是否获得了博莱霉素抗 性为指标而选拔出了：经细胞复制后，子代的基因组DNA内插有该多核苷酸， 且稳定继承了该多核苷酸的性状转换株(以下称“GSH1过剩表达株”)。通过 PCR法，确认到含该多核苷酸的质体DNA已插入在基因组DNA中。

PsaD基因是与光合作用相关的基因。因此，通过改变光照强度来调节PsaD 启动子的活性，便能调节GSH1基因的表达量。也就是说，若对GSH1过剩表 达株照射强光，GSH1过剩表达株中的外源性GSH1的表达量就增加，若照射弱 光，GSH1过剩表达株中的外源性GSH1的表达量就减少。

〔实施例2〕

使用pH7的三-乙酸-磷酸(TAP)培养基(参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，54， 1665～1669页)，在半异养条件下培养了实施例1中制备的GSH1过剩表达株， 然后评价了其增殖能力及淀粉产生能力。作为对照(control)，使用了野生型衣 藻株、即CC503株(以下称“母株(野生型株)”)。各试料的培养条件示于表1 及表2中。

[表1]

[表2]

试料2及试料6的TAP培养基中添加的L-Buthionine-sulfoximine(简称BSO (SIGMA-ALDRICH株式会社制造；型号B2515))是GSH合成酶的抑制剂。

培养结果示于图1及图2中。图1的(a)是表示GSH1过剩表达株的增殖 能力的图表，(b)是表示培养开始309小时后的培养液状态的图。图2的(a) 是表示母株(parent strain)(野生型株)的增殖能力的图表，(b)是表示培养开 始215小时后的培养液状态的图。图1的(a)及图2的(a)中，图表的纵轴代 表光学性密度(OD)，横轴代表培养时间。纵轴所示的光学性密度，是用根据 红外线(950nm)透射量来测定OD值的装置(日本TIETECH株式会社制造的 ODSensor-S/ODBox-A)来测得的。另外，图表中的箭头表示了流式细胞术(FCM) 的实施时机。

如图1的(a)所示，试料1～4的细胞在半异养条件下均具有增殖能力。各 试料的增殖能力彼此并无大差，因而得知外源性GSH1基因的表达并不会影响 衣藻的增殖能力。此外，如图1的(b)所示，在试料1、试料4的培养液中发 生了白浊。

本实施中所述的“半异养条件”是指：虽以培养基中的乙酸为主碳源来进行 培养，但由于还照射光且培养烧瓶并未密封，因此虽然相比于乙酸而言对成长 的帮助较少，但空气中的二氧化碳也用作碳源。

用微米管收取了发生有白浊的试料4的培养液，并经离心分离而获得白色沉 淀物，然后对该白色沉淀物进行了淀粉遇碘反应。其结果示于图1的(c)中。 如图1的(c)所示，从试料4中收取的白色颗粒经淀粉遇碘反应后，染为蓝紫 色。显然，该白色颗粒是淀粉凝聚体。很明显，培养液发生了白浊的试料1、试 料4产生了淀粉。在此，认为GSH1过剩表达细胞内产生的淀粉以淀粉颗粒的 形态排出到了细胞外。

另一方面，试料2、试料3的培养液未发生白浊。由于试料2中添加有GSH 合成酶的抑止剂BSO，因此认为试料2的GSH1过剩表达株的GSH合成受到了 BSO的抑制，所以没有淀粉排出到细胞外。另外，由于试料3所被照射的光线 低于试料1、试料4，因此GSH1过剩表达株中外源性GSH1的表达量较少，所 以排出到细胞外的淀粉未能达到足以使培养液变白浊的程度。

相比之下，如图2的(a)所示，试料5～8的细胞在半异养条件下均具有增 殖能力。然而如图2的(b)所示，试料5～8的培养液未发生白浊。也就是说， 以80μE/m²/秒以下的光照量，在TAP培养基中培养母株的结果是，细胞外未排 出有淀粉粒。

另外，为了对试料4的GSH1过剩表达株、以及试料8的母株(野生型株) 的状态进行更详细的分析，实施了流式细胞术。具体为，对各试料的细胞照射 波长488nm的激励光，并测定了波长为600nm左右的荧光的强度。该600nm左 右的荧光亦即叶绿素发出的荧光。在测定叶绿素发出的荧光的同时，还使作为 细胞密度测定时的内部基准的荧光性微粒(日本BECKMAN COULTER株式会 社制造；商品名：Flow count)共存于细胞中，并测定了受488nm激励光的激发 而发出的波长525nm～700nm的荧光。另外，通过测定前方散射光及侧方散射 光，测定了细胞(颗粒)的大小、以及细胞(颗粒)内部复杂度。

测定结果示于图3及图4中。图3的(a)是试料8的母株(野生型株)中 发出叶绿素荧光的细胞(颗粒)的直方图，(b)试料8的母株(野生型株)培 养物中的浮游颗粒的大小、与颗粒内部复杂度间的相关图。另外，图4的(a) 是试料4的GSH1过剩表达株中发出叶绿素荧光的细胞(颗粒)的直方图，(b) 是试料4的GSH1过剩表达株培养物中的浮游颗粒的大小、与颗粒内部复杂度 之间的相关图。图3的(a)及图4的(a)中的箭头指的是内部基准的峰。另外， 图3的(b)及图4的(b)中的方框代表活细胞的所在区域。

如图3的(a)和(b)所示，可知试料8的母株(野生型株)中几乎所有细 胞都是拥有叶绿体(叶绿素)的活细胞。

与此相比，如图4的(a)所示，对于试料4的GSH1过剩表达株，几乎未 检测出叶绿素的荧光。另外，如图4的(b)所示，试料4的GSH1过剩表达株 中几乎不存在活细胞。图4的(b)中，方框外区域所示的颗粒是排出到细胞外 的淀粉颗粒。也就是说，GSH1过剩表达株的细胞内产生的淀粉随着该细胞的死 亡而以淀粉颗粒的形态排出到该细胞外。

表3表示了图3的(a)及图4的(a)所涉及的、“叶绿素受激励光(488nm) 照射而发出荧光的颗粒的密度”。表4表示了图3的(a)及图4的(a)所涉及 的、“叶绿素虽受激励光(488nm)照射但未发出荧光的颗粒的密度”。表3及表 4所示的细胞(颗粒)个数为：以内部基准值为基准而算出的1mL培养液中所 含颗粒数的千分之一。

[表3]

[表4]

〔实施例3〕

在氮贫乏条件下，对实施例1中制备的GSH1过剩表达株进行了培养，并评 价了其增殖能力和淀粉颗粒产生能力。具体为，使用与实施例2同样的TAP培 养基，以17μE/m²/秒的光量来连续光照，且于24℃下，在旋转台上对GSH1过 剩表达株进行了8天的振荡培养。其后，为了交换培养液，通过离心分离(在 2000g下离心5分钟)来收取了细胞的沉降物，然后将收取的细胞二等分，使其 中一份细胞重新悬浮在不含氮源的TAP N-free培养基(在Gorman和Levine(参 照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，54，1665～1669页)所考案的TAP培养基成分中， 将氯化铵替换成等量的氯化钾后的培养基)中，而使另一份细胞重新悬浮在含 铵的通常TAP培养基中。重新悬浮时，将细胞密度调整到以TAP培养基完成预 培养时的细胞密度的约1.1倍。即，将预培养基每90mL中所含的细胞，重新悬 浮在新培养基每100mL中。以80μE/m²/秒的光量，在旋转台上进行振荡培养， 每天从培养物中采集一部分来评价增殖能力和淀粉产生能力。作为对照 (control)，使用母株(野生型株即CC503株)进行同样的实验。各试料的培养 条件示于表5及表6中。

[表5]

  试料   细胞的种类   培养液   9   GSH1过剩表达株   TAP培养基(含N)   10   GSH1过剩表达株   TAP N-free培养基   11   母株(野生型株)   TAP培养基(含N)   12   母株(野生型株)   TAP N-free培养基

[表6]

培养结果示于图5及图6中。图5是试料9及试料10中的“发出叶绿素荧 光的细胞(颗粒)的密度”及“不发出叶绿素荧光的细胞(颗粒)的密度”在 时间上变化的图表。图6是试料11及试料12中的“发出叶绿素荧光的细胞(颗 粒)的密度”及“不发出叶绿素荧光的细胞(颗粒)的密度”在时间上变化的 图表。图5及图6的图表中，纵轴代表细胞(颗粒)的密度，横轴代表培养时 间。交换完培养液时的培养时间记为0小时。另外，在图5及图6中，上述“不 发出叶绿素荧光的细胞(颗粒)的密度”相当于“淀粉颗粒的密度”。此外，在 图5及图6的(b)及(c)的凡例中，“TAP通常”、“TAP N-free”分别是“含 氮源的TAP培养基”、“不含氮源的TAP培养基”的意思。

如图5的(a)所示，将GSH1过剩表达株置于含氮源的培养液中时，具有 叶绿体的细胞的密度在培养刚开始后一时性地有所增加，但之后出现了减少倾 向。而置于不含氮源的培养液中时，具有叶绿体的细胞近乎未增殖。另外，淀 粉颗粒的密度不受培养液中氮源有无的影响，而随时间增加。此外，当培养液 中的细胞(具有叶绿体的细胞)的密度减少时，淀粉颗粒的密度就有增加的倾 向。

与此相比，如图6的(a)所示，将母株(野生型株)置于含氮源的培养液 中时，细胞有所增殖。而置于不含氮源的培养液中时，细胞是缓慢地增殖。另 外，采用母株(野生型株)时，无论培养液中有无氮源，淀粉颗粒的密度均未 增加。虽有报告指出母株(野生型株)在氮贫乏条件下会积存淀粉，然而仅凭 通常培养衣藻时的光强度(80μE/m²/秒)条件，即使在氮贫乏条件下也不会有淀 粉颗粒排出到细胞外。虽表中无表示，但即便照射了250μE/m²/秒的光，母株(野 生型株)仍未能将淀粉颗粒排出细胞外。

对每隔1日乃至2日从试料9、10、11、及12的培养液中部分抽取的样本 中的淀粉进行了定量。使用Glucose-Test-WAKO(日本和光纯药工业株式会社制 造)进行了定量。其结果示于图5的(b)、(c)以及图6的(b)、(c)中。

如图5的(b)及图6的(b)所示，在氮贫乏条件下(TAPN-free培养基)， GSH1过剩表达株以及母株(野生型株)的培养液中的淀粉浓度均有所增加。另 一方面，在非氮贫乏条件下(TAP培养基(含N))，母株(野生型株)的几乎 所有的培养液中的淀粉浓度均无上升，而GSH1过剩表达株的淀粉浓度与在氮 贫乏条件下培养时的情况同样，均有所上升。

图5的(c)及图6的(c)表示了培养液中，每100万个拥有叶绿体的细胞 所产生的淀粉量的数值。如图示可知，相比于母株(野生型株)，GSH1过剩表 达株的每单个细胞的生产性均不受氮贫乏条件有无的影响而显著的提高。这意 味着：就作为原料的一部分的培养基成分而言，GSH1过剩表达株的淀粉积存产 率比母株(野生型株)优越。另外还意味着：就包括细胞组成成分在内的废弃 物的产生量而言，GSH1过剩表达株低于母株(野生型株)。此外还意味着：就 淀粉的提纯处理而言，GSH1过剩表达株比母株(野生型株)容易。另外，在要 使细胞从增殖阶段转向生产阶段时，在实际操作上也能容易地提高细胞密度。 因此每单个细胞的生产性提高，是非常有优势性的。

此外，还另行地反复实施了与图5及图6所示实验相同的实验，其结果示于 图19及图20中。图19与图5同样，是试料9及试料10中的“发出叶绿素荧 光的细胞(颗粒)的密度”及“不发出叶绿素荧光的细胞(颗粒)的密度”在 时间上变化的图表。图20与图6同样，是试料11及试料12中的“发出叶绿素 荧光的细胞(颗粒)的密度”及“不发出叶绿素荧光的细胞(颗粒)的密度” 在时间上变化的图表。如图19及图20所示，在反复进行了与图5及图6所示 实验相同的实验之后，所得的实验结果中表现出了与图5及图6所示结果相同 的倾向。由此得知实验数据具有很高的再现度。

〔实施例4〕

在自养条件下培养了实施例1中制备的GSH1过剩表达株，并对其增殖能力 以及淀粉颗粒产生能力作了评价。具体为，用TAP培养基对GSH1过剩表达株 进行了预培养后，将其接种到HSM培养基(参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1960) 46，83～91页)，并一边借助插在培养容器底部附近的玻璃管来送入无菌空气， 一边进行光照。其中，使用磁性搅拌器对培养液进行了搅拌。详细的培养条件 示于表7中。作为对照(control)，以同样条件培养了母株(野生型株)，并对其 增殖能力以及淀粉颗粒产生能力作了评价。

[表7]

为了将因通风而蒸发减少的培养基的量维持在约300mL，适时地补充了无 菌水。

评价结果示于图7中。图7的(a)是GSH1过剩表达株及母株(野生型株) 中的“发出叶绿素荧光的细胞(颗粒)的密度”及“不发出叶绿素荧光的细胞 (颗粒)的密度”在时间上变化的图表，(b)是每份培养液中的淀粉量在时间 上变化的图表。图7的(a)的图表中，纵轴代表细胞(颗粒)的密度，横轴代 表培养时间。于自养条件下开始进行培养时的培养时间记为0小时。另外，在 图7的(a)的图表中，上述“不发出叶绿素荧光的细胞(颗粒)的密度”相当 于“淀粉颗粒的密度”。

如图7的(a)所示，相比于母株(野生型株)，GSH1过剩表达株的增加速 度虽较慢，但细胞密度随时间而增加。另外，随着细胞密度的增加，淀粉颗粒 的密度具有在时间上呈线性增加的倾向。与此相比，野生型株的细胞密度虽有 所增加，但几乎无淀粉颗粒排出到细胞外。

此外，对在自养条件下培养到第10天的GSH1过剩表达株及母株(野生型 株)进行了淀粉遇碘反应。具体为，通过离心分离，从GSH1过剩表达株的培 养液1mL中收取了细胞(颗粒)。对母株(野生型株)也同样地从培养液中收取 了细胞(颗粒)。用丙酮对收取的细胞(颗粒)进行处理，以从细胞中除去叶绿 素，然后进行了淀粉遇碘反应。之所以从细胞中除去叶绿素，是为了要看清淀 粉遇碘反应的结果。

反应结果示于图8中。图8是GSH1过剩表达株及母株(野生型株)的淀粉 遇碘反应结果的图。如图8所示，关于GSH1过剩表达株，由于其白色颗粒经 淀粉遇碘反应而染成浓蓝紫色，由此确认出淀粉颗粒排出到了细胞外。另外， 关于母株(野生型株)，虽然其染色较弱，但也确认出了若干的淀粉遇碘反应。 根据反应结果可知在自养条件下时，即使不在氮贫乏条件下，母株(野生型株) 也能在一定程度上产生淀粉。

关于图7的(a)所示自养条件下的培养，使用沿时间轴而每天采集的培养 液样本1mL，对其中的淀粉进行了定量。进行定量时，使用的是 Glucose-Test-WAKO(日本和光纯药工业株式会社制造)。

定量结果示于图7的(b)中。相比于母株(野生型株)，GHS1过剩表达株 较早地开始了淀粉的生产。另外，与经过了相同培养时间的母株(野生型株) 相比，GHS1过剩表达株的淀粉生产量较高。例如，就每1L的培养液而言，培 养到第10天的各培养液中的淀粉浓度为：GHS1过剩表达株产生的淀粉的浓度 为416.8mg；母株(野生型株)产生的淀粉的浓度为196.4mg。因此，从单份培 养液来看，GSH1过剩表达株的生产性高达母株(野生型株)的生产性的2倍以 上。这意味着：就作为原料的一部分的培养基成分而言，GSH1过剩表达株的淀 粉积存产率比母株(野生型株)优越。另外还意味着：就包括细胞组成成分在 内的废弃物的产生量而言，GSH1过剩表达株低于母株(野生型株)。此外还意 味着：就淀粉的提纯处理而言，GSH1过剩表达株比母株(野生型株)容易。此 外，图7的(a)及(b)所示的实施例结果是，GSH1过剩表达株的细胞增殖量 与GSH1过剩表达株的淀粉生产量正相反，受到了抑制。因此这启示了GSH1 过剩表达株比母株(野生型株)更能有效地利用培养成份，且更适于用作在光 合作用下连续生产淀粉的细胞株。

〔实施例5〕

将实施例1中制备的GSH1过剩表达株接种至100mL的TAP培养基，然后 在80μE/m²/秒的连续光照下进行了培养。根据红外线(950nm)的透射量来连续 地监测OD值，当到达对数增殖期或稳定期时，便抽取5mL的培养液，然后将 抽取的培养液移植(后代接续)到新的TAP培养基100mL中，并继续以同样的 条件进行了培养。

图9是GSH1过剩表达株的增殖能力的调查结果图。图9中所示箭头的起点 代表培养液的抽取时机。另外，图9中，“初代”的意思指初代培养，“后代接 续1”的意思指第1次的后代培养，“后代接续2”的意思指第2次的后代培养， “后代接续3”的意思指第3次的后代培养，“后代接续4”的意思指第4次的 后代培养。

如图9所示可知，在进入对数增殖期以及稳定期且经过了约150小时的培养 后，GSH1过剩表达株仍能作为培养种(Seed Culture)来重新进行增殖。在此， 用y＝0.0067x-0.4287来表达初代培养(初代)的指数函数性成长区间的近拟 线，其R²＝0.9959。另外，用y＝0.0085x-1.774来表达第1次后代培养(后代 接续1)的指数函数性成长区间的近拟线，其R²＝0.9952。

但是，在把进入稳定期且经过了150小时的培养物用作种(Seed)时，与刚 进入稳定期就立刻将培养物用作种的方案相比，增殖的启动晚了18个小时。根 据该结果明显得知：GSH1过剩表达株在其对数增殖期结束时，并不意味着其所 有的细胞均将死亡，对数增殖期结束时的细胞群中仍含有具备增殖能力的细胞。 即，显然，能将GSH1过剩表达株的处在对数增殖期及稳定期的细胞用作种， 来进行反复批量培养。

对GSH1过剩表达株在各增殖期时的特征，进行了更详细的分析。分析结果 示于图10中。图10表示的是进行各后代接续时的GSH1过剩表达株状态的调 查结果，(a)是实施了图9所示“后代接续1”时的GSH1过剩表达株的细胞大 小与细胞内部复杂度之间的相关关系图，(b)是实施了图9所示“后代接续2” 时的GSH1过剩表达株的细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图，(c) 是实施了图9所示“后代接续3”时的GSH1过剩表达株的细胞大小与细胞内部 复杂度之间的相关关系图。

如图10所示，确认到GSH1过剩表达株即使在培养时期(对数增殖期及稳 定期)也释放出淀粉颗粒。在图10的(a)～(c)各自所示的、前方散射与侧 方散射间的相关关系图中，位于图内左下角的颗粒群是淀粉颗粒。根据图10的 (a)～(c)，确认到含有大量的淀粉颗粒。从以上的结果看，明显可知GSH1 过剩表达株即使是处在对数增殖期的培养物，也会释放淀粉颗粒。

〔实施例6〕

对于实施例1中制备的GSH1过剩表达株，观察了其释放到细胞外的淀粉颗 粒的性状。具体为，使释放到细胞外的淀粉颗粒悬浮于0.01％的Tween20(注册 商标；日本SIGMA株式会社制造；型号P1379)1mL中，然后进而添入分散了 9mL的Percoll(注册商标；日本SIGMA株式会社制造；型号P1644)，之后进 行离心分离(9100×g；30分钟)来提纯，并用扫描电子显微镜观察了所得的淀 粉颗粒。

图11是GSH1过剩表达株释放到其细胞外的淀粉颗粒的形状的观察结果图。 图11的(a)是用扫描电子显微镜观察淀粉颗粒的结果图。如图11的(a)所示， GSH1过剩表达株产生的淀粉颗粒很细小，其平均粒径为长径1.3μm(标准差为 0.181)、短径1.0μm(标准差为0.204)，且颗粒大小均匀。通常用玉米、马铃薯、 小麦等制成的淀粉颗粒的平均粒径为10～50μm，因此可见GSH1过剩表达株产 生的淀粉颗粒有多么细小。

如上所述，GSH1过剩表达株所产生的淀粉颗粒，比通常用玉米、马铃薯、 小麦等制成的淀粉颗粒要细小。而这种细小的淀粉颗粒能有效地用于医药品的 制造。

另外，GSH1过剩表达株的淀粉颗粒释放，是伴随细胞破裂的释放。虽细胞 在其破裂前后时会发生自我分解(autolysis)，但淀粉颗粒本身不会被控制自我 分解的酶所分解。因此，通过GSH1过剩表达株，能获得杂质少的淀粉颗粒。

具体如下。若细胞不发生自我分解，那么为了提取出积存在细胞内的淀粉颗 粒，就需要通过磨碎等化学性、物理性的手法来破坏细胞，而且细胞破坏后的 碎片会成为残渣而混在淀粉颗粒当中。另一方面，若细胞发生自我分解，那么 高分子蛋白质、高分子碳水化合物、高分子膜类等会经酶反应而分解成低分子 物质，所以产生的细胞碎片便较少。细胞不残留，这就意味着每份原料(培养 基成分)的淀粉颗粒的生产效率高，因此可以说具有高产率。此外，自我分解 所产生的低分子物质能用于进行藻类的增殖，因此能期待通过该物质的再利用 来节省藻类增殖上所需的培养基。细胞的自我分解并不发生在野生型株中，而 是仅发生在GSH1过剩表达株中。

图11的(b)是GSH1过剩表达株释放到其细胞外的淀粉颗粒的遇碘反应结 果图。如图11的(b)所示，GSH1过剩表达株放出的淀粉颗粒，与对照用的玉 米淀粉同样，经淀粉遇碘反应而染成了蓝紫色。

另外，图11的(c)表示了添加有GSH合成酶抑制剂BSO时的、GSH1过 剩表达株的淀粉产生能力。发现在未添加BSO的GSH1过剩表达株中，由于GSH 的合成不受抑制，因此淀粉得以排出到了细胞外。而另一方面，在添加有BSO 的GSH1过剩表达株中，由于GSH的合成因BSO而受到了抑制，因此淀粉未 能排出到细胞外。

〔实施方式7〕

对GSH1过剩表达株的油脂产生能力进行了评价。具体为，在TAP培养基 200mL(含氮源)中，于17μE/m²/秒的连续光照下，对实施例1中制备的GSH1 过剩表达株进行了4天的预培养。然后，通过离心分离(2000g；5分钟)来收 取了培养物90mL中所含的细胞，且使收集的细胞各自重新悬浮到含氮源的新 TAP培养基(100mL)、以及不含氮源的新TAP培养基(100mL)中，也就是进 行了培养基交换。其后，在80μE/m²/秒的连续光照下又培养了6天。对预培养 结束时的细胞、以及培养基交换后经过了6天的细胞，用尼罗红进行染色，并 对染色了的细胞实施了流式细胞术。

作为对照(control)，使用GSH1过剩表达株的母株，也就是莱茵衣藻CC503 株(野生型株)，进行了同样的实验。

图12表示GSH1过剩表达株的油脂产生能力的调查结果，(a)是母株(野 生型株)中发出尼罗红(nile-red)所致荧光的细胞的直方图，(b)是GSH1过 剩表达株中发出尼罗红所致荧光的细胞的直方图，(c)是用共焦激光显微镜观 察预培养液中所含的经尼罗红染色的母株(野生型株)的观察结果图，(d)是 用共焦激光显微镜观察预培养液中所含的经尼罗红染色的GSH1过剩表达株的 观察结果图。图12的(a)及(b)上侧的直方图中，淡灰色的峰表达的是用含 有氮源的TAP培养基所培养的细胞，无色的峰表达的是用不含氮源的TAP培养 基所培养的细胞，最右侧(荧光强度最大)的峰表达的是为测定颗粒密度而添 入的人工荧光球(用作内部基准)。图12的(a)及(b)下侧的直方图表达的 是预培养基中所含的经尼罗红染色了的细胞。

如图12所示，无论是进行了4天预培养(含氮源)的培养试料，还是交换 成含氮源的培养基后又经过了6天培养的培养试料，还是交换成不含氮源的培 养基后又经过了6天培养的培养试料，GSH1过剩表达株每单个细胞的荧光强度 均比母株有所增加。该结果表明，就每单个细胞所含的油脂量而言，GSH1过剩 表达株高于母株(野生型株)。具体为，GSH1过剩表达株中的尼罗红所致荧光 的荧光强度，比母株(野生型株)强了约10^0.5倍(约3.2倍)。

图13表示GSH1过剩表达株的状态调查结果，(a)是GSH1过剩表达株的 细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图，(b)是GSH1过剩表达株的细 胞大小与尼罗红所致荧光的强度之间的相关关系图，(c)是(b)的方框区域中 的、细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图，(d)是母株(野生型株) 的细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图。

如图13的(c)所示，通过对图13的(b)所示的发出强荧光的颗粒群(图 13的(b)中方框区域内的颗粒)设门(gating)，可知细胞发出了很强的光。而 游离在细胞周围的微小颗粒(即，包括淀粉颗粒在内的微小颗粒的群体)却未 发光。根据以上结果得知：在表现出与淀粉颗粒呈同程度前方散射及同程度侧 方散射的微粒群中，不含由油脂构成的微粒。

在此，若细胞形态得到维持，便较强地发出尼罗红所致的荧光。若细胞发生 破坏，且其所含的油脂游离在细胞外，则无法通过流式细胞术(FCM)来检测 (难以检测出)。因此，若GSH1过剩表达株的细胞不断崩溃，那么GSH1过剩 表达株与母株(野生型株)间的油脂量差的推算值就有可能低于实际值。

对此，为了进而明确GSH1过剩表达株与母株(野生型株)间的油脂量差， 从两方细胞中分别提取了脂肪酸，然后进行了定量分析。具体为，使用与上述 流式细胞术中所用的细胞相同的细胞(在含氮源的TAP培养基或不含氮源的 TAP培养基中，于80μE/m²/秒的连续光照下，对GSH1过剩表达株培养了6天 后而得的细胞)，运用Bligh和Dyer(人名)开发的方法(参照了Can.J.Biochem. Physiol.37(8)：911～917页)来收取了GSH1过剩表达株产生的脂肪酸，并对 收取的脂肪酸实施甲酯化，之后进行气相色谱质量分析(GC/MS)。在GC/MS 中，作为内部基准，添加了十五烷酸。对所有的试料，均添加了等量的十五烷 酸。作为对照(control)，对GSH1过剩表达株的母株即莱茵衣藻CC503株(野 生型株)进行了同样的实验。

即，用于进行GC/MS的试料为以下的4种：

(i)在氮存在下培养的母株(野生型株)、

(ii)在氮贫乏条件下培养的母株(野生型株)、

(iii)在氮存在下培养的GSH1过剩表达株、

(iv)在氮贫乏条件下培养的GSH1过剩表达株。

另外，将以下的市售品用作了脂肪酸基准品：十五烷酸(日本GL Sciences 株式会社制造；型号1021-43150)、棕榈酸(日本SIGMA株式会社制造；型号 P0500)、棕榈油酸(日本SIGMA株式会社制造；型号P9417)、硬脂酸(日本 SIGMA株式会社制造；型号S4751)、油酸(日本SIGMA株式会社制造；型号 01008)、亚油酸(日本SIGMA株式会社制造；型号L1376)、亚麻酸(日本SIGMA 株式会社制造；型号L2376)。

图14是气相色谱质量分析的结果图。如图14所示，在所有的试料中，均发 现了与棕榈酸基准品(C16:0)同等的峰。其结果，得知母株(野生型株)以及 GSH1过剩表达株中产生了作为脂肪酸的棕榈酸。

对母株(野生型株)及GSH1过剩表达株中所含的油脂量进行定量的结果， 示于表8中。

[表8]

如表8所示，通过对每100万个细胞的油脂含量进行比较，得知了GSH1 过剩表达株所含的油脂量比母株(野生型株)多5倍以上。据此得知，通过使 藻类增加其叶绿体内的谷胱甘肽的浓度，便能增加细胞内所含的油脂量。

〔实施例8〕

本领域中已有报告指出，莱茵衣藻sta6缺损变异株(也称“sta6变异株”) 的油脂含量高于野生型(莱茵衣藻STA6)。还有报告指出，在用尼罗红对细胞 内油脂储藏体即油体进行了染色后，发现sta6变异株比野生型株含有更大、更 多的油体(参照Wang et al.(2009)Eukaryotic Cell Vol.8(12)：1856～1868页(非 专利文献1))。

因此，将sta6缺损变异株用作母株而制备了GSH1过剩表达株。具体为， 不采用莱茵衣藻CC503株，而是使用了sta6变异株即CC4333株(美国DuKe 大学衣藻中心所出让)。除此之外，均用与实施例1相同的方法制备了GSH1过 剩表达株(以下称“GSH1过剩表达株(sta6^-背景)”)。

图15表示GSH1过剩表达株(sta6^-背景)和其母株(sta6^-)的状态调查结 果，(a)是母株(sta6^-)的细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图，(b) 是GSH1过剩表达株(sta6^-背景)的细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关 系图。

如图15所示，从前方散射与侧方散射间的相关关系图来看，在GSH1过剩 表达株(sta6^-背景)与母株(sta6^-)之间未发现有差异。这意味着，仅在以流 式细胞术来测试的情况下，未在GSH1过剩表达株(sta6^-背景)与母株(sta6^-) 之间发现细胞大小的差异、细胞内构造的差异。

然后，将GSH1过剩表达株(sta6^-背景)接种到TAP培养基100mL中，在 17μE/m²/秒的连续光照下进行了5天的预培养。然后，通过离心分离(2000g；5 分钟)来收取了培养物90mL中所含的细胞。使收集的细胞重新悬浮到含氮源的 新TAP培养基90mL、以及不含氮源的新TAP培养基90mL中，也就是进行了 培养基交换。之后，在80μE/m²/秒的连续光照下，又培养了3天。对预培养结 束时的细胞、以及培养基交换后第3天的细胞，用尼罗红进行染色，并对染色 了的细胞施以流式细胞术。作为对照(control)，使用GSH1过剩表达株(sta6^-背景)的母株，也就是sta6变异株(CC4333株；sta6^-)，进行了同样的实验。

图16表示预培养后、以及培养基交换后第3天的GSH1过剩表达株(sta6^-背景)及其母株(sta6^-)的油脂生产能力的调查结果，(a)是预培养后的GSH1 过剩表达株(sta6^-背景)及其母株(sta6^-)中的发出尼罗红所致荧光的细胞的 直方图，(b)是培养基交换后第3天的GSH1过剩表达株(sta6^-背景)及其母 株(sta6^-)中的发出尼罗红所致荧光的细胞的直方图。在图16的(a)及(b) 中，浓灰色的直方图表示母株(sta6^-)的测试结果，淡灰色的直方图表示GSH1 过剩表达株(sta6^-背景)的测试结果。

如图16的(b)所示，与母株(sta6^-)相比，培养基交换后第3天的GSH1 过剩表达株(sta6^-背景)的荧光强度分布区域偏在于强侧(图中右侧)。这说明 GSH1过剩表达株(sta6^-背景)细胞内的油脂含量比母株(sta6^-)多。

根据以上的结果得知，通过使藻类增加其叶绿体内的谷胱甘肽的浓度，便能 增加细胞内所含的油脂量。

〔实施例9〕

将实施例1中制备的GSH1过剩表达株接种到pH7的三-乙酸-磷酸(TAP) 培养基(参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，54，1665～1669页)中，然后置于24℃ 的培养室内，并在振荡、100μE/m²/秒连续光照的半异养条件下，进行了培养。 每2天，收集培养物1mL中所含的细胞，并用组分为丙酮80％∶水20％的溶剂， 提取出了叶绿素a及叶绿素b。使用分光光度计测定了波长645nm、663nm下的 光吸收率，然后根据测得的这些光吸收率的值，用Porra等人提倡的计算式(参 照Biochim.Biophys.Acta(1989)，第975卷，384～394页)，计算了叶绿素a及 叶绿素b的量。

图17是实施例1中制备的GSH1过剩表达株的叶绿素量的调查结果图。如 图17所示，在培养后第4天至第10天的这段期间，叶绿素总量(叶绿素a的 量与叶绿素b的量的和)虽伴随细胞的增殖而增加，然而其后却主要因叶绿素a 的分解而减少。叶绿素总量在培养到第10天时达到最大值，此时单份培养液中 的叶绿素总量为3.8μg/mL。这一数值低于母株(野生型株)的叶绿素总量，也 就是低于7.6μg/mL。也就是说，在整个培养期间中，就单份培养液中的叶绿素 总量而言，GSH1过剩表达株低于母株(野生型株)。

对于单份培养液中叶绿体总量较低的培养株，可以说其藻体中因光过剩吸收 而导致的光能损耗也较低。换而言之，在以同等光量来实施液体培养时，对于 单份培养液中叶绿素总量较低的培养株，可以说其能将光能输送到培养株体的 更深部。目前有报告提出了通过减少叶绿素b的量来减小光化学体系2内天线 叶绿体的尺寸的研究(参照田中等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95卷(1998)， 12719～12723页；Polle等人，Planta 211卷(2000)，335～344页)。因此，减 少叶绿体b含量的处理，能起到将光能输送到培养株体内更深部的效果。

这启示了通过改变涉及光合作用的色素的总量、组成比，可有助于提高光合 作用产物的生产性。

如图17所示，通过GSH1的过剩表达，能较好地改变色素总量、色素组成 比。这启示了GSH1的过剩表达有助于提高光合作用产物的生产性。

〔实施例10〕

为了使蓝藻(Synechococcus)表达gshA，制备了重组DNA分子。gshA是 源自大肠杆菌的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因。

(1)将大肠杆菌载体pACYC187(序列编号9所示；日本GENE株式会社 制造；型号313-02201)中第3700个腺嘌呤碱基替换成胞嘧啶，由此定出限制 性内切酶Sma Ⅰ的识别位点。接着，用Sma Ⅰ和Sal Ⅰ这2种限制性内切酶，对 该载体进行处理，由此制备出了含抗氯霉素基因以及复制起点(p15A ori)的、 约为2.7kb的DNA片段。

(2)以大肠杆菌JM109株的基因组DNA为模板，使用2种引物DNA(序 列编号12及序列编号13所示)，经PCR法而制备了含gshA基因的约为1.6kb 的DNA片段(序列编号10所示)。用限制性内切酶Xho Ⅰ，对获得的PCR片 段进行了处理。

(3)通过T4DNA连接酶，将步骤(1)和步骤(2)中制备的DNA片段相 连，并用大肠杆菌来进行了扩增。通过检查各种限制性内切酶的分解物的大小， 确认到已完成了具有在抗氯霉素靶基因(以下简称“CAT”)下游区连接有gshA 的这个构造(以下称“CAT-gshA基因盒”)的目标质体。将该质体命名为 “pACYC 184R-Sma Ⅰ-E.c.gshA”。

(4)接着，对蓝藻中用以驱动自主DNA复制的、被称为复制区域的基因 区域，进行了克隆。具体为，以文献(Akiyama等人，(1999)DNA RESEARCH， 第5卷，327～334页)为参考，针对蓝藻Synechococcus PCC7002株(美国模 式培养物保存所的ATCC27264)菌体内的质体pAQ1，通过PCR法来扩增了该 质体pAQ1中所含的复制区域(序列编号11所示)。扩增时所用的2种PCR引 物的序列为，序列编号14以及序列编号15所示的序列。将所得的约为3.4kb的 PCR片段，通过T4DNA连接酶，与用限制性内切酶EcoRV将质体引物pZero2 (注册商标；日本INVI-TROGEN株式会社制造)开环而得的DNA片段相连， 之后通过大肠杆菌进行了扩增。通过检查各种限制性内切酶的分解物的大小， 确认到已完成了具备有能实现蓝藻内部DNA自主复制的基因区域的目标质体。 将该质体命名为“pZero2-pAQ1-ori”。

(5)最后，把经CAT的阅读而表达大肠杆菌gshA的基因盒，连接到在蓝 藻内部进行自主复制的质体上。具体为：以步骤(3)中制备的pACYC184R-Sma Ⅰ-E.c.gshA为模板，使用2种PCR引物(序列编号16及序列编号17所示)， 通过PCR法进行了扩增。将获得的约为2.7kb的PCR片段，通过T4DNA连接 酶，与用限制性内切酶Stu Ⅰ对步骤(4)中制备的pZero2-pAQ1-ori进行分解后 而产生的约为6.2kb的DNA片段相连，之后用大肠杆菌进行了扩增。通过检查 各种限制性内切酶的分解物的大小，确认到已完成了具备有能实现蓝藻内部 DNA自主复制的基因区域、以及CAT-gshA基因盒的目标质体。将该质体命名 为“pSyn5”。

(6)为了与将pSyn5导入蓝藻的实验进行对照，设计了供对照实验用的质 体。该质体是仅具有CAT而不具有gshA的质体。具体为，以pACYC184R为 模板，使用2种PCR引物(序列编号16及序列编号18所示)，通过PCR法进 行了扩增。将获得的约为1.1kb的PCR片段，通过T4DNA连接酶，与用限制性 内切酶Stu Ⅰ对步骤(4)中制备的pZero2-pAQ1-ori进行分解后而产生的约为 6.2kb的DNA片段相连，之后用大肠杆菌进行了扩增。通过检查各种限制性内 切酶的分解物的大小，确认到已完成了具备有能实现蓝藻内部DNA自主复制的 基因区域、以及CAT基因的目标质体。将该质体命名为“pSyn3”。

通过公知的方法(参照Fringaard等人，(2004)Methods in Molecular Biology， 第274卷，325～340页)，将质体pSyn5以及pSyn3分开地导入蓝藻Synechococcus PC7002株中。将导入有质体pSyn5的性状转换体、以及导入有质体pSyn3的性 状转换体各自命名为“E.c.gshA阳株”、“E.c.gshA阴株”。在E.c.gshA阳株中， 源自大肠杆菌的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶发挥其功能。而在E.c.gshA阴株中， 不存在源自大肠杆菌的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶。

将这2种蓝藻各自接种到80mL的“DAIGO”培养基(在纯水1L中溶解500mg 的DAIGOIMK培养基(日本制药株式会社制造；型号398-01333)、36g的人工 海水SP(日本制药株式会社制造；型号395-01343)、1g的三羟甲基氨基甲烷(日 本NACALAI株式会社制造；型号35434-21)、1g的碳酸氢钠(日本和光纯药株 式会社制造；型号198-01315)、10mg的氯霉素(日本和光纯药株式会社制造； 型号034-10572)，并进行过滤灭菌后的培养基)中，并一边通入空气一边搅拌， 然后将其保温在30℃，并进行70μE/m²/秒的连续光照，如此培养了3天。

通过离心分离，收集了培养物1mL中所含的细胞，并将收集的细胞悬浮在 0.2mL的水中。接着，加入0.8mL的丙酮并进行激烈搅拌，由此抽出了色素。 通过离心分离来去除细胞残渣，从而获得了色素的清澄溶液。用分光光度计， 检定了该溶液的吸收光谱。

图18表示从蓝藻性状转换体，即E.c.gshA阳株及E.c.gshA阴株中提取出的 色素类的吸收光谱的调查结果。图18的(a)表示E.c.gshA阳株的吸收光谱，(b) 表示E.c.gshA阴株的吸收光谱，(c)表示从E.c.gshA阳株的吸收光谱中减去 E.c.gshA阴株的吸收光谱后的光谱图。采用蓝藻进行实验后，也同样表现出了与 实施例9相同的结果。即，E.c.gshA阳株相比于E.c.gshA阴株，发生了色素组 分的变化(图18)。由此可知，使蓝藻过剩表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的技术 方案，也同样能获得与实施例1中制备的GSH1过剩表达株相同的光合作用效 果。

[产业上的利用可能性]

与现有技术相比，通过本发明能廉价、高效地通过衣藻来制造生物量。生物 量作为生化燃料的原料而具有利用前景。因此，本发明能用在能源产业等广泛 的产业中。