一种鉴别贵州两类不同香型烤烟的方法

摘要

本发明一种鉴别贵州两类不同香型烤烟的方法，烟草化学领域。方法利用三维荧光光谱技术，对种植于贵州黔西南、六盘水和毕节域的“清甜香”型风格烤烟与种植于黔东南、铜仁、遵义和黔南区域的“醇甜香”型两类不同风格烤烟烟叶实施聚类鉴别。通过测定烟叶的石油醚提取液中化学成分总体特征光谱，根据特征光谱峰的位置和强度，获取不同香型风格烤烟的化学物质相对含量的差异信息，用统计分析软件进行聚类分析，建立了一种快速、简便、准确鉴别贵州两类烤烟香型风格的特征光谱检测方法。

说明书

技术领域

本发明属烟草化学领域，具体地说是一种鉴别贵州两类不同香型烤烟的方法，即鉴别“清甜香”型和“醇甜香”型两类不同香型烤烟的方法。

背景技术

烟草香味是多种香气成分共同作用的结果，是评定烟草及其制品质量的重要指标。烟叶香气质量和香型与致香物质种类及含量直接相关。形成烟草香味的物质种类繁多，成分含量极微，各种致香成分间存在极其复杂的相互作用。不同植区烟叶的香型和香气质量与类型、品种、生态环境和栽培条件有关，其香气成分的组成、含量和比例不同，导致烟叶的香型分布具有明显的地域特点。烟草香味物质由遗传因素和环境因子共同决定，前者主要影响香味物质的性质和种类，后者则影响香味物质的含量和组成比例。

在烟草质量评价和卷烟配方中，传统上将我国烟叶分为“浓香”、“清香”和“中间香”三种类型，进一步细分后又以“浓香”、“浓偏中”、“中偏浓”、“中间香”、“中偏清”、“清偏中”及“清香”等类型细分。同香型烟叶风格特征存在差别归因于所含致香和潜香物质种类、含量比例的不同。为满足差异化描述，烟叶香型概念不断细化，相继提出了如“清甜香”、“醇甜香”等香型风格。有研究认为，烟草的香气类型与烟叶中香味成分的相对分子质量大小有关，浓香型烟叶中相对分子质量较大的香气成分占优，清香型烟叶中相对分子质量较小的香气成分占优；也有研究认为香型与氮杂环类香气成分含量有关，浓香型烟叶氮杂环类香气物质含量较高，而清香型烟叶氮杂环类香气物质含量相对较低；还有研究发现浓香型烟叶中的新植二烯、类胡萝卜素降解产物含量显著低于清香型，而美拉德反应产物和类西柏烷类降解产物含量也比其他香型烟叶含量低；研究还发现，西南云贵烟区烤烟中类胡萝卜素降解产物含量高于东北及福建烟区，多酚类等潜香型物质含量也存在差异。

贵州地处低纬度高海拔季风区，主体气候明显，烤烟种植海拔分布宽，生态条件、气候多样，独特的山地自然条件和生态环境造就了烟叶与众不同的质量和风格特色。贵州是我国仅次于云南的烟叶第二大产区，植区包括四个市（贵阳市、六盘水市、遵义市、安顺市）两个地区（铜仁地区、毕节地区）和三个自治州（黔西南自治州、黔东南自治州、黔南自治州）。贵州烟叶的风格界定一直沿用传统的介于“浓香”与“清香”之间的“中间香”型，其山地烟叶的特征彰显不够明确，特色风格的区域有待细化。近年来有专家提出贵州烟叶的香型风格还可细化分为两大类，分布于黔中、黔南、黔北、黔东植区烟叶划为山地“醇甜香”型，是贵州烟叶的主体。芳香类型以干草香、茶香、药草香、辛香、果香和坚果香为主体，香气类型丰富，烟气醇甜厚实。西部地区的黔西南、黔西北区域划分为山地“清甜香”香型，芳香类型以干草香、辛香、木香、动物香为主体，烟气清甜细腻。但对这两类香型烟叶特征的准确描述、划分的化学物质基础、定量判定方法等都还有待于进一步研究。贵州典型区域烟叶风格特征、化学成分及致香物质的研究，特别是对“中间香”型烟叶风格特色和香气物质特征细化研究有利于彰显贵州山地特色清香风格特点，也能为基地化优质烟草原料供应和品质保障体系建立、深化资源配置提供支撑。同时，还能够为烟草生产和加工过程中采用科学的调控技术和手段，提高烟叶原料的香气品质和工业可用性，建立烟叶原料化学成分的数字化管理创造条件、为烟草新品种的选育和品区划提供依据。对稳定贵州卷烟制品的配方和香气风格，提高卷烟产品的竞争实力具有重要的理论和现实意义。烟叶香型风格定位和评价是种植和发展特色优质烟叶的前提条件，也是充分利用生态资源的保障。贵州作为全国特色优质烟叶主产区，其风格特色的清晰界定和差异化描述，将有利于独特山地自然资源的有效利用、种植烟叶的市场影响和商业价值提升。

烟草化学成分复杂，化学物质众多。作为复杂的多组分混合体系，烟草香味物质的分析检测大多依赖于高效分离的色谱与高鉴别的质谱，联用技术更宜实现烟草物质成分的指纹谱图构建。由于烟草品种、生态环境、栽培技术、烘烤调整手段不同，其香气成分的组成、含量和比例不尽相同，仅以某几种化学成分作为评价烟草香气风格质量指标难以全面反映其香型特征。加之色谱-质谱分析检测设备要求高、样品处理、分离检测所需时间长，不能满足快速、实时在线检测的需求。

红外和荧光光谱作为混合组分的快速检测技术，在不需分离的前提下，借助于数学工具和分类学的识别判断方法，在烟草化学成分分析与鉴定方面有独特的优势。

在烟草行业中，近红外光谱分析已广泛用于测定水分、烟碱、总糖等常规成分。随着近红外分析技术的发展，在烟草成分及烟气分析、烟叶类型与产地判别及物理指标测定、在线检测等方面得到应用。基于近红外光谱的分类研究，经数学建模后可实现对烟叶品种或产地的判别；傅立叶变换近红外光谱建立快速分析和预测烟草中植物色素数学模型、烤烟石油醚提取物含量的近红外模型等研究已有报道。

三维荧光光谱是荧光强度随激发和发射波长扫描获得的光谱数据用三维立体或平面等高线图形式显示的荧光技术。三维荧光光谱解决了平面谱图中荧光峰相互重叠、遮蔽不易观察等问题，可清晰地显示谱图的详细结构、表达完整的荧光信息，具有指纹特性。用三维荧光光谱信息可完成多组分混合物体系中较为复杂成分的定性与定量分析，构建快速检测方法。已成功的应用于中药材、药剂、食品及石油化工等领域中的分析检测。利用烟草提取物的三维荧光光谱，研究烟草品质、香气、劲头等吃味之间的关系已有报道。

石油醚能有效提取烟叶中产生香味的挥发性和非挥发性化学成分，是脂肪、游离脂肪酸、精油、树脂、蜡质、类脂物、甾醇、色素和有机酸等有机物质的混合物。烟草及烟草制品中石油醚提取物含量较多，约占总量的6%，而这些物质被认为是形成烟草香味的重要来源，与烟叶的香味和协调密切相关，与卷烟焦油量呈正相关性，因此烟草石油醚提取物总量常作为评价烟草香味品质的一项指标。测定石油醚提取物总量在烟草行业有标准方法。石油醚提取物含量高的烟叶化学成分比例协调，综合质量较好，其含量与烟叶香气量及品质呈正相关。曾有人对不同地区、不同气候条件、不同栽培条件、不同基因、品种和不同烘培条件下烟草石油醚提取物的差异进行了研究。

烟草的评吸和品质鉴定，一直主要依赖于感觉判断。烟草学者为此提出了尼古丁值、 多酚值、氮值和芳香值等参数，试图用烟草的化学成分来说明其质量。但是对烟草的香气、吃昧来说是一种生理强度、刺激性和味感的总体感觉，需要从总体特征角度对烟草的香味风格给予描述和表征，不是某个单一成分测定就能定级和品质鉴定的，目前还主要依赖于人工评析的感觉判断。

烟草石油醚提取物是复杂的多组分体系，三维荧光光谱在不分离的条件下能给出混合组分整体的光谱等高线图，获得烟草中主要化学成分发射荧光的特征指纹信息图，从而反映出烟草香型风格特征。因此，可能用来代替人的感觉判别烟叶香型香气风格。

聚类分析是根据“物以类聚”的道理，利用数学方法对样品进行分类的一种多元统计分析方法，能将大量的样品按各自的特性合理的进行分类。这种利用数学工具进行定量分类的数值分类学比依靠经验和专业知识分类更客观、准确。 系统聚类分析法是将测试变量归并为若干不同的类别，以分类树形图表示，使每一类别内的所有个体之间具有较密切的关系，而各类别之间的相互关系相对地比较疏远。经系统聚类分析后能得到一个反映个体间亲疏关系的自然谱系，客观地描述了分类对象的各个体之间的差异和联系，聚类分析与三维荧光测定用于烟草香型香气风格的判别目前还没有人进行过。

目前传统的烟草香型、香气风格的判别是采样人工评析的方式，通过香味轮廓分析进行的，难以给出客观、定量和数字化的描述。因此，快速、简便、准确、定量判断烟草香型特征的分析检测方法的建立是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于建立一种快速、简便、准确鉴别贵州两类烤烟香型风格的方法，本发明的目的通过以下方法达到：

本发明一种鉴别贵州两类不同香型烤烟的方法，其特征是利用三维荧光光谱技术，测定贵州烤烟烟叶的石油醚提取液中化学成分总体特征光谱，根据总体特征光谱峰的位置和强度，得到表征不同香型风格烤烟的化学物质相对含量的差异，用统计分析软件进行聚类分析，建立鉴别贵州“清甜香”型和“醇甜香”型两类不同香型风格烤烟的快速检测方法。所指用三维荧光光谱技术测定烟叶石油醚提取液的总体特征光谱，是以激发和发射波长分别为峰Ⅰ：297/326nm，峰Ⅱ：250/330nm，峰Ⅲ：225/336nm的3个荧光峰为特征峰，分别测得烟叶石油醚提取液总体发射光谱强度FⅠ、FⅡ和FⅢ，以荧光强度分数D₁、D₂、D₃或荧光强度比值R₁、R₂、R₃，分别进行聚类分析，得到树状聚类图，其中D₁、D₂、D₃分别表示峰Ⅰ、峰Ⅱ和峰Ⅲ的荧光强度分数；R₁、R₂、R₃分别表示3个荧光峰强度比值；D₁=FⅠ/∑F、D₂=FⅡ/∑F、D₃=FⅢ/∑F，∑F表示三个荧光峰强度和；R₁=FⅠ/ FⅡ，R₂= FⅡ/ FⅢ，R₃= FⅢ/ FⅠ；以荧光强度分数聚类时，取距离系数5～7；以荧光强度比值聚类时，取距离系数2～4，即可鉴别贵州烤烟两类不同香型。

本发明方法按下列步骤进行鉴别：

（1）样品处理：分别取标准“醇甜香”型、“清甜香”型和待测的烤烟样品，将样品编号后于40℃烘箱干燥，粉碎，过40 目筛，准确称量各样品，用色谱纯石油醚浸润、振荡2小时后静置，上清液即为石油醚烤烟提取液；

（2）总体特征光谱测定：取步骤（1）上清液，用色谱纯石油醚稀释20倍，得分析液，转移至无荧光石英比色皿，设置激发波长在200~500 nm，发射波长在200~600 nm范围，以2.0 nm为波长递增，出射和入射狭缝均为5.0 nm，检测器倍增管电压720V的条件下进行三维荧光光谱测定，分别得到各样品分析液的激发/发射波长分别为峰Ⅰ：297/326 nm，峰Ⅱ：250/330 nm，峰Ⅲ：225/336 nm的3个特征峰的发射光谱荧光强度FⅠ、FⅡ和FⅢ；

（3）数据分析：分别测定并计算出各分析液激发/发射波长为峰Ⅰ：297/326nm、峰Ⅱ：250/330nm、峰Ⅲ：225/336nm 的3个荧光特征峰的荧光强度FⅠ、FⅡ、FⅢ，计算出荧光强度分数D₁、D₂、D₃和荧光强度比值R₁、R₂、R₃。利用SPSS17.0数据统计分析软件，在“变量视图”中定义“样品编号、D₁、D₂、D₃”或“样品编号、R₁、R₂、R₃”变量，其中“样品编号”为字符串型，其他变量为数值型，将各样品分析液的荧光强度分数和荧光强度比值数据输入“数据视图”中，选择“分析”→“分类”→“系统聚类分析”运算功能，其中“标注个案”为样品编号，分别选择D₁、D₂、D₃和R₁、R₂、R₃ 3个变量，利用组间联接的聚类方法中的“平方欧式距离”度量标准进行系统聚类分析，得到树状聚类图，由特征峰强度分数可知、当距离系数为5~7时，荧光强度分数值能将各编号待测样品鉴别出是属“清甜香”型风格还是属“醇甜香”型风格的烟叶；由特征峰强度比值可知，当距离系数为2~4时，荧光强度分数值能将各编号待测样品鉴别出是属“清甜香”型风格还是属“醇甜香”型风格的烟叶。 

本发明所用荧光光谱仪为美国瓦里安(Varian)公司的Cary Eclipse型荧光分光光度计，荧光测定条件为：1 cm厚四面抛光无荧光石英比色皿，激发波长E_x 200~500nm，发射波长E_m 200~600nm，波长递增2.00nm，狭缝5.00nm，电压720V。

本发明所用数据处理软件为微软公司办公套装软件（Microsoft office）的试算表软件（Excel）组件及SPSS公司的 “统计产品与服务解决方案”中SPSS17.0数据统计分析软件，对所测样品特征光谱数据进行系统聚类分析。

样品采集处理条件是采集烤烟烟叶样品C₃F（中橘三）等级，取样量至少1kg，经干燥、粉碎、过筛后准确称取1g左右样品，用色谱纯石油醚30ml浸润、振荡2小时后静置至少24小时，取上清液用色谱纯石油醚稀释20倍体积后作为测定三维荧光光谱的分析液。

本发明申请一种鉴别贵州两类不同香型烤烟的方法的应用，其特征是可用于任何地方出产的“清甜香”和“醇甜香”型烤烟风格类型判别。

利用本发明申请方法完成对贵州不同地区出产烤烟进行香型分类，得出黔东南、铜仁、黔南和遵义地区的烤烟属“醇甜香”型，六盘水、黔西南和毕节的烤烟属“清甜香”型，其中毕节的“清甜香”型和铜仁的“醇甜香”型最为明显。本发明在分析中将毕节烤烟样品作为“清甜香”型标准样品，将铜仁烤烟样品作为“醇甜香”型标准样品。在特征峰强度分数聚类图中，在5~7的距离系数范围内，凡与毕节烤烟数据聚为一类的即为“清甜香”型；凡与铜仁烤烟数据聚为一类的即为“醇甜香”型；在特征峰强度比值聚类图中，在2~4的距离系数范围内，凡与毕节烤烟数据聚为一类的即为“清甜香”型；凡与铜仁烤烟数据聚为一类的即为“醇甜香”型。

本发明申请对烟叶石油醚提取液用三维荧光光谱扫描，发现提取液中三维荧光光谱有三个特征荧光峰，分别是峰Ⅰ：E_x/E_m=297/326nm，峰Ⅱ：E_x/E_m=250/330nm，峰Ⅲ：E_x/E_m=225/336nm。各峰强度为峰Ⅰ＞峰Ⅲ＞峰Ⅱ，见图1和图2，三个峰代表烤烟烟叶的石油醚提取液中化学成分总体特征光谱。总体特征光谱峰的位置、强度表征出烟叶不同香型风格的化学物质相对含量的差异，用统计分析软件进行聚类分析就能快速鉴别贵州“清甜香”型和“醇甜香”型两类不同香型的烤烟香型类别。

本发明申请中的关键技术是：（1）烟样测试液的石油醚稀释倍数为0.5mL上清液用石油醚稀释20倍；（2）采集3个特征荧光峰的强度分数和比值进行数据分析；（3）特征光谱数据采用系统聚类分析中平方欧式距离法。

本发明申请的特点是样品处理方法简单、光谱测定快速、简便、绿色环保、且数据处理非常简单，无需复杂的数学计算和建模、判别结果客观、准确、直观。方法简便易行，判别结果较传统的人工评吸方法更加客观、准确和量化，极具实用推广价值。

附图说明：

图1 烟叶石油醚提取液三维荧光光谱三维立体图，其中横坐标为激发波长E_x，纵坐标为发射波长E_m，竖坐标为峰强度F。提取液的三维荧光光谱有3个特征荧光峰，分别是峰Ⅰ：E_x/E_m=297/326nm，峰Ⅱ：E_x/E_m=250/330nm，峰Ⅲ：E_x/E_m=225/336nm。各特征峰的发射波长较为接近而激发波长有较大的差别。峰强度表现为峰Ⅰ＞峰Ⅲ＞峰Ⅱ，其中峰Ⅰ强度最大，峰Ⅱ、峰Ⅲ强度较低，且各样品值相差不大。

图2 烟叶石油醚提取液三维荧光光谱等值线图，其中横坐标为发射波长E_m，纵坐标为激发波长E_x。3个特征峰的等值线密度表现为峰Ⅰ＞峰Ⅲ＞峰Ⅱ，说明峰Ｉ强度最大，其次是峰Ⅲ，峰Ⅰ强度最低。

图3 烟草样品的荧光强度分数聚类图。以毕节烤烟样品（标1）作为“清甜香”型标准样品，在距离系数为5~7范围内，能将样品1（六盘水烟样）、样品2（黔西南烟样）判别为同属标样1的“清甜香”型；将铜仁烤烟样品（标2）作为“醇甜香”型标准样品，在距离系数5~7范围内，能将样品3（遵义烟样）、样品4（黔东南烟样）、样品5（黔南烟样）判别为同属标样2的“醇甜香”型。

图4 烟草样品的荧光强度比值聚类图。以毕节烤烟样品（标1）作为“清甜香”型标准样品，在距离系数为2~4范围内，能将样品1（六盘水烟样）、样品2（黔西南烟样）判别为同属标样1的“清甜香”型；将铜仁烤烟样品（标2）作为“醇甜香”型标准样品，在距离系数2~4范围内，能将样品3（遵义烟样）、样品4（黔东南烟样）、样品5（黔南烟样）判别为同属标样2的“醇甜香”型。

具体实施例

实施例一：荧光光谱法中荧光强度分数鉴别贵州两类不同香型烤烟

采集贵州7个种烟区等级为C₃F（中橘三）烤烟烟叶样品125个，采样量各为1kg，于40℃烘箱干燥6h，粉碎，过40 目筛。准确称量1g烟样，用色谱纯石油醚30ml浸润、振荡2小时后静置24小时。取经上述样品处理方法处理后的上清液0.5 mL，用色谱纯石油醚稀释20倍，转移至1 cm厚度四面的抛光无荧光石英比色皿，激发波长在200~500 nm，发射波长在200~600 nm范围，以2.0 nm为波长递增，出射和入射狭缝均为5.0 nm，检测器倍增管电压720V的条件下进行三维荧光光谱测定，光谱图见附图1和2。得到石油醚提取液的激发和发射波长分别为峰Ⅰ：297/326 nm，峰Ⅱ：250/330 nm，峰Ⅲ：225/336 nm的3个特征峰总体发射光谱的荧光强度。利用微软办公软件Excel计算出各特征峰的荧光强度分数D₁、D₂、D₃。其中D₁=FⅠ/∑F，D₂=FⅡ/∑F，D₃=FⅢ/∑F，∑F为3个荧光峰强度和。得到各烟样三维荧光强度分数值（表1）。利用SPSS17.0数据统计分析软件，在“变量视图”中定义“样品编号、D₁、D₂、D₃”4个变量，其中“样品编号”为字符串型，其他3个为数值型。将不同植烟区样品编号及各地区烟叶石油醚提取液的荧光强度分数数据输入“数据视图”中，选择“分析”→“分类”→“系统聚类分析”运算功能。其中“标注个案”为样品编号，选择D₁、D₂、D₃ 3个变量，利用组间联接的聚类方法中的“平方欧式距离”度量标准进行系统聚类分析，得到特征峰荧光强度分数值的树状聚类图，见附图3。由图可知，以毕节烤烟样品（标1）作为“清甜香”型标准样品，在距离系数为5~7范围内，将样品1（六盘水烟样）、样品2（黔西南烟样）判别为同属“清甜香”型；以铜仁烤烟样品（标2）作为“醇甜香”型标准样品，在距离系数5~7范围内，将样品3（遵义烟样）、样品4（黔东南烟样）、样品5（黔南烟样）判别为同属“醇甜香”型。区域特征表现清晰，分类明确。

实施例二：荧光光谱法中荧光强比值鉴别贵州两类不同香型烤烟

样品采集、处理及光谱测定方法同实施例一。计算出3个特征荧光峰的荧光强度比值R₁、R₂、R₃。其中R₁=FⅠ/ FⅡ，R₂= FⅡ/ FⅢ，R₃= FⅢ/ FⅠ。得到各烟样三维荧光强度比值数据（表2）。利用SPSS17.0数据统计分析软件，在“变量视图中”定义“样品编号、R₁、R₂、R₃”4个变量，其中“样品编号”为字符串型，其他三个为数值型。将不同植烟区样品编号及各地区烟叶石油醚提取液的荧光强度比值数据输入“数据视图”中，选择“分析”→“分类”→“系统聚类分析”运算功能。其中“标注个案”为样品编号，选择R₁、R₂、R₃ 3个变量，利用组间联接的聚类方法中的“平方欧式距离”度量标准进行系统聚类分析，得到特征峰荧光强度比值的树状聚类图，见附图4。由图可知，以毕节烤烟样品（标1）作为“清甜香”型标准样品，在距离系数为2~4范围内，将样品1（六盘水烟样）、样品2（黔西南烟样）判别为同属“清甜香”型；以铜仁烤烟样品（标2）作为“醇甜香”型标准样品，在距离系数2~4范围内，将样品3（遵义烟样）、样品4（黔东南烟样）、样品5（黔南烟样）判别为同属“醇甜香”型。区域特征表现清晰，分类明确。