一种利用UPLC/MS/MS快速测定黑花生种皮中花色苷的方法

摘要

本发明公开了一种利用UPLC/MS/MS快速测定黑花生种皮中花色苷的方法，属于检测技术领域。包括以下步骤：（1）黑花生种皮中花色苷的提取；（2）黑花生种皮中花色苷的净化；（3）黑花生种皮中花色苷的分析测定。本发明可以更快速、更充分的提取黑花生中的花色苷，以更准确地测出不同花色苷的种类和含量，对于揭示其活性功能的物质基础和作用机制具有重要意义，同时为开发富含花色苷的花生品种，提高花生的营养品质和保健功能提供理论依据。

说明书

技术领域

本发明涉及检测技术领域，具体的说是一种利用UPLC/MS/MS快速测定黑 花生种皮中花色苷的方法。

背景技术

花色苷是一种天然的水溶性色素，广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果 实等器官的细胞液中，从而使其呈现出红色、蓝色、紫色等颜色。花色苷是由 花色素与糖通过糖苷键结合而成的一类多酚类化合物。花色素的基本结构为 3,5,7-三羟基-2-苯基苯并吡喃，目前已知的花色素有20多种，但在植物中主要有 6种，即矢车菊色素、天竺葵色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛色素、锦葵色 素。花色苷具有一定的营养和保健功效，如抗氧化、抗突变、抗肿瘤与抗动脉 硬化等，在食品、医药、化妆品领域有着巨大应用潜力。黑花生种皮中含有大 量的花色苷，在促进人类身体健康、延缓衰老和预防心血管疾病方面发挥重要 作用。因此，作为一种廉价易得的抗氧化资源，黑花生种皮花色苷具有十分重 要的开发价值和广阔的应用前景。

花色苷的粗提物往往有较多的杂质，难于对其进行鉴定，只有将各组分进 行分离提纯为单体花色苷后，才能进行鉴定，确定其化学结构。分离纯化的方 法主要是层析法，包括纸层析(PC)，薄层层析(TLC)，柱层析(CC)，以及高效液 相色谱法(HPLC)等，但前述方法无法对未知物质进行结构鉴定，故不能确定复 杂基质中花色苷类化合物的具体种类及其含量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用UPLC/MS/MS快速测定黑花生种皮中花色 苷的方法。本发明可以更快速、更充分的提取黑花生中的花色苷，以更准确地 测出不同花色苷的种类和含量，对于揭示其活性功能的物质基础和作用机制具 有重要意义，同时为开发富含花色苷的花生品种，提高花生的营养品质和保健 功能提供理论依据。

本发明所采用的技术方案为：

一种利用UPLC/MS/MS快速测定黑花生种皮中花色苷的方法，其特征是， 包括以下步骤：

（1）黑花生种皮中花色苷的提取

称取0.20g黑花生种皮试样于50mL具塞塑料离心管中，加入10mL90%甲 醇水溶液，涡旋震荡1min，超声提取15min，在4000rmp转速下离心5min，将 上清液过滤至150mL烧瓶；依此方法再重复提取2次，每次提取时均加入10mL 90Vol%甲醇水溶液，最后合并3次提取的上清液；

所述90Vol%甲醇水溶液中含0.5Vol%甲酸，pH=2.5；

将合并后的上清液在40℃条件下减压浓缩，然后在40℃水浴条件下氮吹浓 缩，除去甲醇，再加入5mL0.1Vol%甲酸酸化水，涡旋震荡2min，即得样品溶 液；

（2）黑花生种皮中花色苷的净化

将SPEC₁₈柱依次用0.1Vol%甲酸酸化甲醇5mL和0.1Vol%甲酸酸化水5mL 活化，注入步骤（1）中样品溶液，SPEC₁₈柱吸附花色苷，然后用0.1Vol%甲酸 酸化水10mL淋洗柱，最后用0.1Vol%甲酸酸化甲醇5mL洗脱花色苷，在40℃ 水浴条件下氮气吹干；用0.1Vol%甲酸酸化水定容至2mL，经0.22μm滤膜过滤， 即得待测溶液；

（3）黑花生种皮中花色苷的分析测定

①实验条件的确定

色谱条件：色谱柱：MSC₁₈（2.1mm×150mmI.D.,3.5μm）色谱柱， 柱温40℃；流动相A：6Vol%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱；流速： 0.5mL/min；洗脱方式：梯度洗脱；进样量：10μL；记录时间：20min；

质谱条件：离子化模式：大气压电喷雾离子源（ESI），正离子模式；离子源 温度：120℃；脱溶剂气温度：450℃；锥孔气流量：60L/h；脱溶剂气流量600L/h； 毛细管电压1.5kV；锥孔电压45V；

②按照①中实验条件，注入步骤（1）中所述待测溶液，进行分析测定， 采用全扫描、母离子扫描、子离子扫描、多反应监测模式（MRM）确定花色苷 种类与含量。

优选的，上述步骤①中所述的梯度洗脱为：

本发明所具有的优点：

（1）建立一种应用UPLC/MS/MS快速分离鉴定黑花生种皮中花色苷的方 法，明确了黑花生种皮中的花色苷组分及含量，对于揭示其活性功能的物质基 础和作用机制具有重要意义，同时为开发富含花色苷的花生品种，提高花生的 营养品质和保健功能提供理论依据。

（2）UPLC/MS/MS操作简便、准确度高、重复性好，而且可对花色苷进行 结构鉴定。

（3）采用90Vol%甲醇水溶液（含0.5Vol%甲酸）作为花色苷的提取溶液， 以涡旋和超声的混合提取方式，可以更充分、更快速地提取黑花生中的花色苷。

（4）采用SPEC18柱净化，依次用0.1Vol%甲酸酸化甲醇和0.1Vol%甲酸酸 化水活化，上样，然后用0.1Vol%甲酸酸化水淋洗柱，最后用0.1Vol%甲酸酸化 甲醇洗脱花色苷，氮气吹干，用0.1Vol%甲酸酸化水定容，经0.22μm滤膜过滤。 可以获得更优异的净化效果。

（5）采用MSC₁₈（2.1mm×150mmI.D.,3.5μm）色谱柱，柱温40℃， 流动相A：6Vol%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱，流速为0.5mL/min， 初始流动相比例为100:0(A:B体积比)，到5min时流动相比例变为95:5，到 15min时流动相比例变为75:25，到17min时流动相比例变为95:5，到19min 时流动相比例变为100:0。色谱柱和流动相的选择对黑花生种皮花色苷达到了优 异的分离效果。

（6）采用全扫描、母离子扫描、子离子扫描、多反应监测模式（MRM）获 得了花色苷类化合物的结构信息，从而确定了黑花生种皮中花色苷种类与含量， 实现了对黑花生种皮花色苷组成成分的定性和定量分析。

附图说明

附图1不同pH条件下花色苷吸光度曲线图；

附图2黑花生种皮花色苷提取物MS全扫描图；

附图3黑花生种皮花色苷提取物的母离子扫描总离子流图；

附图4黑花生种皮花色苷提取物(11.17min)的子扫描总离子流图(A)和质谱 图(B)；

附图5黑花生种皮花色苷提取物(13.74min)的子扫描总离子流图(A)和质谱 图(B)；

附图6黑花生种皮花色苷提取物(14.27min)的子扫描总离子流图(A)和质谱 图(B)；

附图7黑花生种皮花色苷提取物(15.19min)的子扫描总离子流图(A)和质谱 图(B)；

附图8黑花生种皮花色苷提取物(14.16min)的子扫描总离子流图(A)和质谱 图(B)；

附图9黑花生种皮花色苷提取物(15.26min)的子扫描总离子流图(A)和质谱 图(B)；

附图10黑花生种皮花色苷提取物(14.29min)的子扫描总离子流图(A)和质 谱图(B)；

附图11黑花生种皮花色苷提取物(14.03min)的子扫描总离子流图(A)和质 谱图(B)；

附图12黑花生种皮花色苷提取物(15.29min)的子扫描总离子流图(A)和质 谱图(B)；

附图13黑花生种皮花色苷提取物(14.33min和15.18min)的子扫描总离子流 图(A)和质谱图(B)、(C)。

具体实施方式

为阐明对本发明特征的理解，下面结合实施实例对本发明做进一步阐述。

以下结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。

1、仪器与样品

1.1、仪器：超高效液相色谱系统（ACQUITYUltraPerformanceLCWaters公 司）配以质谱（MicromassQuattroUltimaIMPT质谱仪Waters公司）、 N-EVAP^TM112氮吹仪、WATERS固相萃取仪、MSC₁₈（2.1mm×150mmI.D., 3.5μm）色谱柱。

1.2、样品：黑花生

2、方法与结果

2.1、黑花生种皮中花色苷的提取

称取0.20g黑花生种皮试样于50mL具塞塑料离心管中，加入10mL90%甲 醇水溶液，涡旋震荡1min，超声提取15min，在4000rmp转速下离心5min，将 上清液过滤至150mL烧瓶；依此方法再重复提取2次，每次提取时均加入10mL 90Vol%甲醇水溶液，最后合并3次提取的上清液；所述90Vol%甲醇水溶液中含 0.5Vol%甲酸，pH=2.5；将合并后的上清液在40℃条件下减压浓缩，然后在40℃ 水浴条件下氮吹浓缩，除去甲醇，再加入5mL0.1Vol%甲酸酸化水，涡旋震荡 2min，即得样品溶液；

花色苷的稳定性与pH有显著的相关性，花色苷在酸性条件下具有显著的 稳定。但是如果酸性太强可能导致花色苷水解。pH=2.5时，花色苷的提取率最 高；如图1所示。

2.2、黑花生种皮中花色苷的净化

将SPEC₁₈柱依次用0.1Vol%甲酸酸化甲醇5mL和0.1Vol%甲酸酸化水5mL 活化，注入步骤（1）中样品溶液，SPEC₁₈柱吸附花色苷，然后用0.1Vol%甲酸 酸化水10mL淋洗柱，最后用0.1Vol%甲酸酸化甲醇5mL洗脱花色苷，在40℃ 水浴条件下氮气吹干；用0.1Vol%甲酸酸化水定容至2mL，经0.22μm滤膜过滤， 即得待测溶液；

花青素属类黄酮物质的一种，在自然界分布广泛，自然状态下多以花色苷的 形式存在，是植物主要水溶性色素之一。花青素的基本结构母核为2-苯基苯并 吡喃，吡喃环上的氧原子为4价，有碱的性质，同时结构中含有酚羟基，具有 酸的性质，其颜色随着pH不同而改变，在酸性条件下显色较好，呈红色，在中 性、近中性条件下呈无色，碱性条件下呈蓝色。花色素苷是极性化合物，易溶 于水。一般对于花色苷的分离与净化采用SPEC18柱和sephadex葡聚糖凝胶净 化柱的原理是由于凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来， 小分子的化合物保留强，最后出柱。由于sephadex葡聚糖凝胶净化柱不能把黑 花生种皮中非极性杂质取出，因此不选择sephadex柱。

酸性条件下花色苷橙红色，在C18活化、上样、淋洗、洗脱过程直观明显。 因此选择SPEC18柱方法操作简便、直观，具有较高的回收率、精密度和灵敏 度。

2.3、黑花生种皮中花色苷的分离与鉴定

花色苷的分离与鉴定应用UPLC/MS/MS。采用MSC₁₈（2.1mm×150mmI.D.,3.5μm）色谱柱，柱温40℃，流动相A：6Vol%甲酸水溶 液，流动相B：乙腈，梯度洗脱，流速为0.5mL/min，初始流动相比例为100:0(A: B体积比)，到5min时流动相比例变为95:5，到15min时流动相比例变为75:25， 到17min时流动相比例变为95:5，到19min时流动相比例变为100:0，进样体 积10μL。离子化模式为大气压电喷雾离子源（ESI），正离子模式，离子源温度 120℃，脱溶剂气温度450℃，锥孔气流量60L/h，脱溶剂气流量600L/h，毛细 管电压1.50kV，锥孔电压45V。分别采用全扫描、母离子扫描、子离子扫描、 多反应监测模式（MRM）确定花色苷种类与含量。

按照2.3中实验条件，注入2.2中所述待测溶液，进行分析测定。

2.4、黑花生种皮花色苷全扫描

对黑花生种皮花色苷提取物进行MS全扫描，如图2所示。提取出质谱选择 离子共11种，分别为M/Z=611（11.17min）、581（13.74min）、479（14.27min）、 565（15.19min）、595（14.16min）、463（15.26min）、625（14.29min）、595（13.42min）、 551（15.29min）、465（14.33min、15.17min）。

2.5、黑花生种皮花色苷母离子扫描

未衍生化的糖苷配基主要有6种，即天竺葵色素（Pg）：M/Z=271，矢车菊 色素（Cy）：M/Z=287，芍药色素（Pn）：M/Z=301，飞燕草色素（Dp）：M/Z=303， 牵牛色素（Pt）：M/Z=317和锦葵色素（Mv）：M/Z=331。设置10V和20V两种 碰撞电压，对M/Z=271、287、301、303、317、331的子离子进行母离子扫描， 得到其总离子流。对黑花生种皮花色苷提取物进行母离子扫描，其总离子流图 如图3所示。

对天竺葵色素（Pg）：M/Z=271的子离子进行母离子扫描，在13.57min出现 色谱峰（如图3-D），表明黑花生种皮中含有以天竺葵色素为糖苷配基的花色苷 类化合物，但色谱峰丰度较低，含量较少；对矢车菊色素（Cy）：M/Z=287的子 离子进行母离子扫描，在11.17min、13.74min出现色谱峰（如图3-E）；对芍药 色素（Pn）：M/Z=301的子离子进行母离子扫描，在14.05min、14.27min、15.24min 出现色谱峰（如图3-F），表明黑花生种皮中含有以芍药色素为糖苷配基的花色 苷类化合物，但色谱峰丰度较低，含量较少；对飞燕草色素（Dp）：M/Z=303 的子离子进行母离子扫描，在14.55min、14.98min、15.28min出现色谱峰（如 图3-A），表明黑花生种皮中含有以飞燕草色素为糖苷配基的花色苷类化合物， 色谱峰丰度较高，含量较高；对牵牛色素（Pt）：M/Z=317的子离子进行母离子 扫描，在14.60min、15.19min出现色谱峰（如图3-C），表明黑花生种皮中含有 以牵牛色素为糖苷配基的花色苷类化合物，但色谱峰丰度较低；对锦葵色素 （Mv）：M/Z=331的子离子进行母离子扫描，未出现色谱峰（如图3-B），表明 黑花生种皮中不含锦葵色素为糖苷配基的花色苷类化合物。

2.6、黑花生种皮花色苷子离子扫描

从全扫描图中提取质谱图，得到不同质核比的准分子离子。在10V和20V 两种碰撞电压下，分别对这些准分子离子进行子离子扫描。

保留时间为11.17min的花色苷（图4-A），准分子离子M/Z=611，进行子离 子扫描得到M/Z=287的子离子（图4-B）。M/Z=287为花青素苷元矢车菊色素的 离子碎片，611-287=324糖基为槐二糖，推断为矢车菊素-槐二糖苷。

保留时间为13.74min的花色苷（图5-A），准分子离子M/Z=581，进行子离 子扫描得到M/Z=287的子离子（图5-B）。M/Z=287为花青素苷元矢车菊色素的 离子碎片，581-287=294糖基为接骨木二糖，推断为矢车菊素-接骨木二糖苷。

保留时间为14.27min的花色苷(图6-A），准分子离子M/Z=479，进行子离子 扫描得到M/Z=317的子离子（图6-B）。M/Z=317为花青素苷元牵牛色素的离 子碎片，479-317=162糖基为己糖，推断为牵牛色素-己糖苷。

保留时间为15.19min的花色苷(图7-A），准分子离子M/Z=565，进行子离子 扫描得到M/Z=317的子离子（图7-B）。M/Z=317为花青素苷元牵牛色素的离 子碎片，565-317=248糖基为丙二酰葡萄糖，推断为牵牛色素-丙二酰葡萄糖苷。

保留时间为14.16min的花色苷，准分子离子M/Z=595(图8-A），进行子离子 扫描得到M/Z=301的子离子(图8-B）。M/Z=301为花青素苷元芍药色素的离子 碎片，595-301=294糖基为接骨木二糖，推断为芍药色素-接骨木二糖苷。

保留时间为15.26min的花色苷，准分子离子M/Z=463(图9-A），进行子离 子扫描得到M/Z=301的子离子(图9-B）。M/Z=301为花青素苷元芍药色素的离 子碎片，463-301=162糖基为己糖，推断为芍药色素-己糖苷。

保留时间为14.29min的花色苷，准分子离子M/Z=625.33(图10-A），进行子 离子扫描得到M/Z=301.34的子离子(图10-B）。M/Z=301为花青素苷元芍药色素 的离子碎片，625-301=324糖基为槐二糖，推断为芍药色素-槐二糖苷。

保留时间为13.42min的花色苷，准分子离子M/Z=595(图11-A），进行子离 子扫描得到M/Z=271的子离子(图11-B）。M/Z=271为花青素苷元天竺葵色素的 离子碎片，595-271=324糖基为槐二糖，推断为天竺葵色素-槐二糖苷。

保留时间为15.29min的花色苷，准分子离子M/Z=551(图12-A），进行子离 子扫描得到M/Z=303的子离子(图12-B）。M/Z=303为花青素苷元飞燕草色素 的离子碎片，551-303=248糖基为丙二酰葡萄糖，推断为飞燕草色素-丙二酰葡 萄糖苷。

保留时间为14.33min、15.17min的花色苷，这两种花色苷类物质具有相似 的质谱特性，但其在色谱保留时间上不同。准分子离子M/Z=465(图13-A），进 行子离子扫描得到M/Z=303的子离子(图13-B、C）。M/Z=303为花青素苷元飞 燕草色素的离子碎片，465-303=162糖基为己糖，推断为飞燕草色素-己糖苷， 根据出峰时间的不同，判定含有两种不同的飞燕草色素-己糖苷。

2.7、黑花生种皮花色苷的种类与含量

对黑花生种皮花色苷提取物进行全扫描、母离子扫描和子离子扫描，并通 过MRM验证，鉴定出11种不同的花色苷，分别为1#矢车菊素-槐二糖苷、2# 天竺葵色素-槐二糖苷、3#矢车菊素-接骨木二糖苷、4#芍药色素-接骨木二糖苷、 5#芍药色素-槐二糖苷、6#飞燕草色素-己糖苷、7#牵牛色素-己糖苷、8#飞燕草 色素-己糖苷、9#牵牛色素-丙二酰葡萄糖苷、10#芍药色素-己糖苷、11#飞燕草 色素-丙二酰葡萄糖苷。其中，6#和8#具有相似的质谱特性，但在色谱保留时间 上为不同的花色苷单体。结果如表1所示。

矢车菊素花色苷所占比例为52.71Vol%，为第一主要的花色苷，矢车菊素- 接骨木二糖苷所占比例为28.28Vol%，为第一主要单体花色苷。飞燕草色素花色 苷所占比例为43.49Vol%，为第二主要的花色苷。牵牛色素花色苷所占比例为 2.66Vol%，为第三主要的花色苷。芍药色素花色苷、天竺葵色素花色苷所占比 例较低，分别为0.91Vol%和0.23Vol%。表明黑花生种皮的颜色主要由矢车菊素 花色苷、飞燕草色素花色苷、牵牛色素花色苷控制。

表1黑花生种皮花色苷种类