具有抑制TGF-β受体活化的活性的化合物、该化合物的筛选方法、以及用于预防或治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病的组合物

摘要

本发明以提供能抑制由HCV引起的TGF-β受体的活化的化合物、以及该化合物的筛选方法为课题，发现了来源于HCV的NS3蛋白酶与I型TGF-β受体结合，通过该结合使TGF-β受体活化。进而还发现了：鉴定了NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合位点，通过识别这些结合位点的抗体，能抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体的活化。另外，发现了可以以NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合的抑制等为指标，来筛选抑制TGF-β受体活化的化合物。

说明书

技术领域

本发明涉及具有抑制TGF-β受体活化的活性的化合物、以及该化合物 的筛选方法，更详细地说，涉及具有通过抑制NS3蛋白酶与I型TGF-β 受体的结合，来抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体活化的活性的化合 物，以及该化合物的筛选方法。

背景技术

肝硬化在日本作为死亡原因是第9多(厚生劳动省“平成21年人口 动态统计月报年计的概况”)，有约30万人的患者和约350万人的肝炎患 者预备军。该疾病是肝组织由于细胞外基质蛋白质的异常蓄积而硬化的难 治之症，肝硬化(肝纤维化)在肝损伤与再生反复进行的过程产生，作为结 果肝细胞陷入细胞凋亡，呈现出形成肝衰竭的一系列病态。

作为引起该肝纤维化的主要原因，已知作为细胞因子的1种的TGF-β 的活化(非专利文献1)。肝硬化时，存在于肝血窦与肝实质细胞之间的肝星 状细胞被活化，过量产生以胶原蛋白为代表的细胞外基质。在动物模型中 显示了促进该胶原蛋白等的过量产生的是TGF-β，通过基因治疗等终止 TGF-β的作用则能防止肝硬化(非专利文献2)。进而，由陷于肝硬化的肝脏 以每年5～7%的频率发生肝癌而至死。在这里，由TGF-β引起的介由EMT (上皮间充质转换)的诱导和/或控制性T细胞诱导的癌免疫的低下可以说是 一个原因(非专利文献3)。

另外，日本的肝硬化的76%是由于丙型肝炎病毒(HCV)感染，HCV 感染者据说仅在日本国内推测就有200万人，在世界约有2亿人。感染HCV 则经过10年～30年发生肝硬化，进而转为肝癌，因此成为较大社会问题。 针对这样的状况，现在，主要采用PEG修饰干扰素与利巴韦林的合并使用 疗法，在40～50%的患者中确认了除去病毒的效果。进而开发了病毒粒子 的成熟化所必须的丝氨酸蛋白酶NS3的蛋白酶活性抑制剂，并进行II～III 期试验(非专利文献4～5)。

但是，对于HCV引起肝纤维化或肝癌的机理尚未阐明，因此依然没 有完成开发出能够根治治疗该病毒性疾病的物质。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Friedman Sl，Gastroenterol，2008年5月，134(6)， 第1655-69页

非专利文献2：Friedman Sl，Physiol Rev.，2008年1月，88卷，1 号，第125-172页

非专利文献3：Massague J，Cell，2008年7月，134卷，2号，第215-230 页

非专利文献4：Nature Reviews Drug Discovery，2009年1月，8卷， 1号，第11页

非专利文献5：Nature Reviews DrUg Discovery，2010年7月，9卷， 7号，第501-503页

发明内容

发明要解决的课题

本发明鉴于上述现有技术中存在的课题而完成的，其目的在于，提供： 能抑制由HCV引起的TGF-β受体活化的化合物、该化合物的筛选方法、 以及用于预防或治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病的组合物。

用于解决课题的方法

本发明者们为了实现上述目的而反复进行了深入研究，结果发现，来 源于HCV的NS3蛋白酶与I型TGF-β受体结合、以及通过该结合使TGF-β 受体被活化。另外，还发现通过该活化，促进成为肝纤维化的主要原因的 肝星状细胞及肝细胞中的胶原蛋白产生。进而发现，鉴定NS3蛋白酶与I 型TGF-β受体的结合位点，通过识别这些结合位点的抗体，能抑制由NS3 蛋白酶引起的TGF-β受体的活化，从而完成了本发明。

本发明，更详细地说提供以下的发明。

(1)一种化合物，其具有以下活性：通过抑制NS3蛋白酶与I型TGF-β 受体的结合，来抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体活化。

(2)根据(1)所述的化合物，其对NS3蛋白酶或I型TGF-β受体具有结 合活性。

(3)根据(2)所述的化合物，其对包含序列号1～6的任一项所记载的氨 基酸序列的肽具有结合活性。

(4)根据(1)～(3)的任一项所述的化合物，其是针对NS3蛋白酶或I型 TGF-β受体的抗体。

(5)一种用于预防或治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病的组合物，其含 有权利要求1～4的任一项所述的化合物作为有效成分。

(6)一种具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体活化的活性的化合 物的筛选方法，其包括以下的(a)～(c)的工序：

(a)在被检化合物的存在下，使NS3蛋白酶与I型TGF-β受体接触的 工序，

(b)检测NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合的工序，

(c)选择抑制上述结合的化合物的工序。

(7)一种具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体活化的活性的化合 物的筛选方法，其包括以下的(a)～(c)的工序：

(a)在被检化合物的存在下，使NS3蛋白酶与I型TGF-β受体接触的 工序，

(b)检测由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体的活化的工序，

(c)选择抑制上述活化的化合物的工序。

(8)一种抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体的活化的方法，其特征 在于，抑制NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合。

(9)一种用于预防或治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病的方法，其特征 在于，抑制NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合。

发明的效果

根据本发明，可提供能抑制由HCV引起的TGF-β受体的活化的化合 物、以及其筛选方法，进而可提供用于预防或治疗由丙型肝炎病毒引起的 疾病的组合物。

附图说明

图1是显示NS3蛋白酶具有TGF-β2样抗原活性的图。

图2是显示通过NS3蛋白酶而使TGF-β信号被活化的图。

图3是显示通过NS3蛋白酶而促进胶原蛋白的产生的图。

图4是显示推测的NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合部位的图。

图5是显示NS3蛋白酶中的、与I型TGF-β受体的预测结合位点及预 测接触残基的氨基酸序列的图。

图6是显示I型TGF-β受体中的、与NS3蛋白酶的预测结合位点及预 测接触残基的氨基酸序列的图。

图7是显示在将各抗体与NS3蛋白酶同时添加于×9CAGA/CCL64细 胞这样的条件下，通过与各预测结合位点结合的、抗I型TGF-β受体抗体 及抗NS3抗体，而抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β信号的活化的图。

图8是显示在将各抗NS3抗体和NS3蛋白酶进行预温育这样的条件 下，通过抗NS3抗体，而抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β信号的活化的 图。

图9是显示在将各抗NS3抗体和NS3蛋白酶进行预温育这样的条件 下，通过抗NS3抗体，而抗体用量依赖性地抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β 信号的活化的图。

图10是显示在将各抗I型TGF-β受体抗体和×9CAGA/CCL64细胞 进行预温育这样的条件下，通过抗I型TGF-β受体抗体，而抑制由NS3 蛋白酶引起的TGF-β信号的活化的图。

图11是显示在将各抗I型TGF-β受体抗体和×9CAGA/CCL64细胞 进行预温育这样的条件下，通过抗I型TGF-β受体抗体，而抗体用量依赖 性地抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β信号的活化的图。

图12是显示通过不识别预测结合位点的抗TGF-β2抗体等，不能抑制 由NS3蛋白酶引起的TGF-β信号的活化的图。

图13是显示在将各抗NS3抗体与TGF-β2进行预温育这样的条件下， 通过抗NS3抗体，不能抑制由TGF-β2引起的TGF-β信号的活化的图。

图14是显示在将各抗I型TGF-β受体抗体和细胞(Reporter Assay(报 告检测)系)进行预温育这样的条件下，通过抗I型TGF-β受体抗体，而部 分地抑制由TGF-β2引起的TGF-β信号的活化的图。

图15是显示由NS3蛋白酶促进的胶原蛋白的产生，被抗NS3单克隆 抗体(e1211、e0458、s0647、P3-g0899，P3-g1390)抑制的图。

具体实施方式

本发明的化合物的特征在于，具有以下活性：通过抑制NS3蛋白酶与 I型TGF-β受体的结合，来抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体活化。

NS3蛋白酶是来源于丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白质的1种，包 含631氨基酸。N端包含蛋白酶结构域、C端包含解螺旋酶结构域。作为 蛋白酶结构域及解螺旋酶结构域的典型例子，可分别举出包含由GenBank  ACCESSION No.AAB27127.1所特定的蛋白质的1056～1204氨基酸的肽 和包含1224～1455氨基酸的肽。

另外，I型TGF-β受体与II型TGF-β受体、及作为这些受体的配基 的TGF-β结合而形成复合体，作为来源于人的典型例子，可举出由 GenBank ACCESSION No.BAG63449.1所特定的蛋白质。

进而，在本发明中，所谓TGF-β受体的活化，是指成为以下状态： TGF-β受体通过形成复合体而能产生向下游的信号转导。通过该信号转导， 可产生例如：该复合体的形成后产生的I型TGF-β受体的磷酸化、由被磷 酸化的I型TGF-β受体而引起的Smad2/3的磷酸化、被磷酸化的Smad2/3 与Smad4的复合体的形成、该Smad复合体向核内的移动、由移动至核内 的Smad复合体引起的靶基因的转录活化。

另外，本发明中的“抑制”包含完全的抑制(阻碍)及部分的抑制两者。

另外，作为本发明的化合物，只要是能通过抑制NS3蛋白酶与I型 TGF-β受体的结合来抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体的活化的物质， 则没有特别限制，从抑制该结合这样的观点出发，优选对NS3蛋白酶或I 型TGF-β受体具有结合活性的化合物，更优选对包含下述序列号1～6的 任一项所记载的氨基酸序列、即NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合位点 的肽具有结合活性的化合物。进而，作为本发明的化合物，从不影响由 TGF-β2引起的活化、特异性地抑制NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合 这样的观点出发，特别优选对包含下述序列号1～3的任一项所记载的氨基 酸序列的肽具有结合活性的化合物。

TGRDKNQVEGEVQVVSTATQS(序列号1)

TNVDQDLVGWPAPPGARSLTP(序列号2)

RGDNRGSLLSPRPVSYLKGSS(序列号3)

FVSVTETTDKVIHNSM(序列号4)

IAEIDLIPRDRPFV(序列号5)

CAPSSKTGSVTTTY(序列号6)

另外，序列号1～3所记载的氨基酸序列表示NS3蛋白酶侧的结合位 点，序列号4～6所记载的氨基酸序列表示I型TGF-β受体侧的结合位点。

本发明的化合物的1种方式为抗体。本发明中的“抗体”包含免疫球 蛋白的所有类及亚类。“抗体”包含多克隆抗体、单克隆抗体，另外，也 包含抗体的功能性片段的形式。

另外，本发明的抗体包含嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、及这些抗 体的功能性片段。作为抗体的功能性片段，可举出Fab、Fab’、F(ab’)2、 可变区片段(Fv)、二硫键Fv、单链FV(scFv)、sc(Fv)2、双体抗体(Diabody)、 多特异性抗体及它们的聚合物等。

在将本发明的抗体作为药物施与人的情况下，从降低副作用的观点出 发，优选嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体。

抗体如果是多克隆抗体，则可用抗原(上述炎症性细胞因子等)将免疫 动物进行免疫，由其抗血清通过现有的方法(例如，盐析、离心分离、透析、 柱层析等)进行纯化来获得。另外，单克隆抗体可通过杂交瘤法、重组DNA 法等来制作。

嵌合抗体例如可以如下获得：用抗原对小鼠进行免疫，由该小鼠单克 隆抗体的基因切下与抗原结合的抗体可变部(可变区)，与来源于人骨髓的 抗体恒定部(恒定区)基因结合，通过将其插入表达载体丙导入宿主使嵌合 抗体产生(例如，日本特开平7-194384号公报、日本特许3238049号公报、 美国专利第4816397号公报、美国专利第4816567号公报、美国专利第 5807715号公报)。

人源化抗体例如可通过将非来源于人的抗体的抗原结合部位(CDR)的 基因序列移植于人抗体基因(CDR移植)来制作(例如，参照日本特许 2912618号、日本特许2828340号公报、日本特许3068507号公报、欧洲 专利239400号公报、欧洲专利125023号公报、国际公开90/07861号公报、 国际公开96/02576号公报)。

人抗体例如可以利用可生产人抗体谱的转基因动物(例如小鼠)来制作 (例如，Nature，362：255-258(1992)、Intern.REV.Immunol，13：65-93(1995)、 J.Mol.biol，222：581-597(1991)、Nature Genetics，15：146-156(1997)、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：722-727(2000)、日本特开平10-146194号 公报、日本特开平10-155492号公报、日本特许2938569号公报、日本特 开平11-206387号公报、日本特表平8-509612号公报、日本特表平 11-505107号公报)。

在本发明中使用的抗体中，包含在不减少期望的活性(通过抑制NS3 蛋白酶与I型TGF-β受体的结合，来抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受 体活化的活性)的条件下修饰其氨基酸序列而得的抗体。另外，在所修饰的 抗体中，对于不减少该期望的活性，可使用后述筛选方法的活性的评价系 统来确认。

本发明的抗体的氨基酸序列突变体，可通过对编码本发明的抗体链的 DNA的突变引入，或者通过肽合成来制作。这样的修饰包含例如本发明的 抗体的氨基酸序列内的残基的替换、缺失、添加和/或插入。抗体的氨基酸 序列被改变的部位只要与改变前的抗体具有同等的活性，则可以是抗体的 重链或轻链的恒定区，还可以是可变区(框架区及CDR)。认为CDR以外 的氨基酸的改变对与抗原的结合亲和性的影响相对少，现在改变CDR的 氨基酸来筛选对抗原的亲和性被提高的抗体的方法是公知的(PNAS，102： 8466-8471(2005)、Protein Engineering,Design&Selection，21：485-493 (2008)、国际公开第2002/051870号、J.biol.Chem.，280：24880-24887(2005)、 Protein Engineering,Design&Selection，21：345-351(2008))。

另外，抗体的改变例如可以是改变糖基化部位的数、位置、种类等的 抗体的翻译后加工的改变。所谓抗体的糖基化，典型地是N-键或O-键。 抗体的糖基化较大地依赖于用于表达抗体的宿主细胞。糖基化图谱的改变 可通过参与糖生产的特定酶的导入或缺失等公知方法来进行(日本特开 2008-113663号公报、日本特许4368530号公报、日本特许4290423号公报、 美国专利第5047335号公报、美国专利第5510261号公报、美国专利第 5278299号公报、国际公开第99/54342号公报)。进而，在本发明中，为了 增加抗体的稳定性等目的，可通过将脱酰胺化的氨基酸或与脱酰胺化的氨 基酸邻接的氨基酸替换成其他氨基酸来抑制脱酰胺化。另外，还可以将谷 氨酸替换成其他的氨基酸来增加抗体的稳定性。在本发明中使用的抗体， 也提供这样进行稳定化后的抗体。

作为本发明中使用的抗体，如前所述，只要是具有通过抑制NS3蛋白 酶与I型TGF-β受体的结合来抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体活化 的活性的抗体即可，优选针对NS3蛋白酶或I型TGF-β受体的抗体，从特 异性地抑制NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合这样的观点出发，更优选 与包含序列号1～6所记载的氨基酸序列的肽结合的抗体。进而在这些抗体 中，从不影响由TGF-β2引起的活化、特异性地抑制NS3蛋白酶与I型 TGF-β受体的结合这样的观点出发，特别优选与包含序列号1～3所记载 的氨基酸序列的肽结合的抗体。

另外本发明的化合物的其他方式，是在NS3蛋白酶与I型TGF-β受体 的结合以及由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体的活化中，对NS3蛋白酶、I 型TGF-β受体等具有显性负性的性状的多肽。作为这样的多肽，例如可举 出由对序列号1～6的任一项所记载的氨基酸序列的进行了替换、缺失、添 加和/或插入而得的的多肽和/或肽库，通过后述的筛选方法选择出的多肽。 这样的显性负性体可通过重组DNA法、化学合成等来制作。

进而本发明的化合物的其他方式，可举出具有抑制由NS3蛋白酶引起 的TGF-β受体活化的活性，能抑制NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合 的低分子化合物。该低分子化合物例如可以如下获得：以包含NS3蛋白酶 或I型TGF-β受体中的序列号1～6的任一项所记载的氨基酸序列的肽部 位的结构为基础来设计并合成，或者由合成低分子化合物文库通过后述的 筛选方法来选择。

另外，本发明提供含有本发明的化合物的组合物，作为本发明的组合 物的形态，可以是药物组合物、饮食品(包含动物用饲料)、或用于研究目 的(例如，体外和/或体内的实验)的试剂。

本发明的组合物，通过含有本发明的化合物作为有效成分，从而抑制 NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合，具有抑制由NS3蛋白酶引起的 TGF-β受体活化的活性，因此可适合使用作为用于预防或治疗由丙型肝炎 病毒引起的疾病，例如，急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等而施与的 药物组合物。

另外本发明的组合物，通过含有本发明的化合物，从而还可以适合为 了预防或改善这些疾病而作为日常性摄取的饮食品使用。

进而本发明的组合物，通过含有本发明的化合物，从而抑制NS3蛋白 酶与I型TGF-β受体的结合，还可以适合作为抑制由NS3蛋白酶引起的 TGF-β受体的活化的试剂使用。

本发明的组合物，可通过公知的制剂学方法进行制剂化。例如，可以 制成胶囊剂、锭剂、丸剂、液剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、膜涂剂、颗粒 (pellet)剂、片(troch)剂、舌下剂、咀嚼剂、含服剂、糊剂、糖浆剂、悬浮 剂、酏剂、乳剂、涂布剂、软膏剂、硬膏剂、巴布膏剂、经皮吸收型制剂、 洗剂、吸引剂、喷雾剂、注射剂、栓剂等，可经口或非经口使用。

在这些制剂化中，可以与药理学上或饮食品容许的载体或其他的添加 剂等适宜组合，作为载体具体为灭菌水和/或生理盐水、植物油、溶剂、基 剂、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、芳香剂、赋形剂、 赋型剂(vehicle)、防腐剂、结合剂、稀释剂、等渗剂、无痛化剂、增量剂、 崩解剂、缓冲剂、涂剂、润滑剂、着色剂、甜味剂、粘稠剂、矫味矫臭剂、 溶解辅助剂。

在使用本发明的组合物作为药物组合物的情况下，也可与用于预防或 治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病的公知的药物组合物合并使用。作为公知 的药物，例如，可举出PEG干扰素和/或利巴韦林。进而，也考虑与现在 进入III期临床试验的NS3蛋白酶的活性抑制剂(Vertex社制的Telaprevir、 Schering-Ploug社制的Boceprevir等)的合并使用。这些活性抑制剂在以 NS3蛋白酶作为对象的方面与本发明的化合物相同，但目标到底是HCV 病毒的粒子的成熟化所必要的蛋白酶的活性，在由丙型肝炎病毒引起的疾 病的发病机制中的作用点与本发明的化合物不同。因此，通过合并使用本 发明的化合物和PEG干扰素、利巴韦林、NS3蛋白酶的活性抑制剂，可以 期待在将使用的各药物的浓度抑制得较低的同时，抑制由丙型肝炎病毒引 起的病态的发展，排除病毒，实现由丙型肝炎病毒引起的肝疾病的根治治 疗。

在使用本发明的组合物作为饮食品使用的情况下，该饮食品可以是例 如健康食品、功能性食品、特定保健用食品、营养辅助食品、病人用食品、 食品添加物、或动物用饲料。本发明的饮食品，除了可作为如上述的组合 物摄取以外，还可作为各种饮食品来摄取。作为饮食品的具体例，可举出 食用油、调味品、蛋黄酱、人造黄油等含油分的制品；汤类、乳饮料、清 凉饮料水、茶饮料、酒精饮料、饮剂、果子冻状饮料、功能性饮料等液状 食品；饭类、面条类、面包类等含碳水化物食品；火腿、香肠等的畜产加 工食品；鱼糕(かまぼこ)、干货、水产腌制品(塩辛)等水产加工食品；腌菜 等蔬菜加工食品；果子冻、酸奶等半固态食品；酱、发酵饮料等发酵食品； 西点类、日本点心类、糖果类、口香糖类、软糖、冷冻点心、冰点等各种 点心类；咖喱、浇汁、中式例汤等的即食制品；速溶汤、速溶酱汁等方便 食品和/或微波炉对应食品等。进而，还可举出粉末、颗粒、片剂、胶囊剂、 调制成液状、糊状或果子冻状的健康饮食品。本发明的组合物可将包含人 的动物作为对象来使用，作为除人以外的动物没有特别限制，可以以各种 家畜、家禽、宠物、实验用动物等作为对象。具体地可举出猪、牛、马、 绵羊、山羊、鸡、野鸭、鸵鸟、鸭、狗、猫、兔、仓鼠、小鼠、大鼠、猴 等，但并不限定于这些。

本发明的饮食品的制造可通过该技术领域中公知的制造技术来实施。 在该饮食品中，还可添加对于预防或改善由丙型肝炎病毒引起的疾病有效 的1种或2种以上的成分。另外，通过与发挥除了预防或改善由丙型肝炎 病毒引起的疾病以外的功能的其他成分或其他功能性食品组合，也可制成 多功能性的饮食品。

在施与或摄取本发明的组合物时，其施与量或摄取量根据对象的年龄、 体重、症状、健康状态、组合物的种类(药物、饮食品等)等进行适宜选择。 例如，本发明组合物的每1次的施与量或摄取量，通常为0.01mg/kg体重 体重～100mg/kg体重。

本发明的组合物的制品(药物、饮食品、试剂)或其说明书可以附加用 于抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体的活化的意思的表示。在这里所 谓“在制品或说明书附加表示”，是指在制品的本体、容器、包装等附加 表示，或在公开制品信息的说明书、附加文件、宣传物、其他的印刷物等 中附加表示。在用于抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体的活化的意思 的表示中，可包含关于通过施与或摄取本发明的组合物来抑制由NS3蛋白 酶引起的TGF-β受体的活化的机理的信息。作为机理，例如，可举出涉及 通过抑制NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合来抑制由NS3蛋白酶引起 的TGF-β受体的活化的信息。另外，在用于抑制NS3蛋白酶与I型TGF-β 受体的结合的意思的表示中，可包含涉及用于由丙型肝炎病毒引起的疾病 的预防或治疗等的信息。

另外，本发明如前所述，通过将本发明的化合物或组合物施与对象或 使对象摄取等，从而可以抑制NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合，抑制 由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体的活化。进而，通过抑制该活化，也可 预防或治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病。因此，本发明提供：以抑制NS3 蛋白酶与I型TGF-β受体的结合为特征的、抑制由NS3蛋白酶引起的 TGF-β受体的活化的方法；以及以抑制NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的 结合为特征的、用于预防或治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病的方法。

进而，本发明还提供具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体活化 的活性的化合物的筛选方法，其包含以下(a)～(c)的工序：

(a)在被检化合物的存在下，使NS3蛋白酶与I型TGF-β受体接触的 工序，

(b)检测NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合的工序，

(c)选择抑制上述结合的化合物的工序。

作为在本发明的筛选方法中使用的被验化合物没有特别限制，例如可 举出基因文库的表达产物、合成低分子化合物文库、肽库、抗体、细菌释 放物质、细胞(微生物、植物细胞、动物细胞)的提取液及培养上清、纯化 或部分纯化多肽、来源于海洋生物、植物或动物的提取物、土壤、噬菌体 随机展示肽文库。另外，通过本方法筛选的化合物，是抑制NS3蛋白酶与 I型TGF-β受体的结合，具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体活化 的活性的化合物。因此，这些化合物如前所述，可成为由丙型肝炎病毒引 起的疾病的预防或治疗药的候选。

另外，这里使用的NS3蛋白酶及I型TGF-β受体，例如，作为NS3 蛋白酶，可举出包含前述的GenBank ACCESSION No.AAB27127.1所特 定的蛋白质的1056～1204氨基酸和1224～1455氨基酸的肽，作为I型 TGF-β受体，可举出GenBank ACCESSION No.BAG63449.1所特定的蛋 白质。另外，除了这些天然型的蛋白质，还可使用维持对各自的结合活性 的片段、改变体、修饰体等，例如，可使用作为与用于使检测容易的标志 物蛋白质、碱性磷酸酶(SEAP)、β-半乳糖苷酶等酶、谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)、绿色荧光蛋白质(GFP)等荧光蛋白质的融合蛋白质表达而得到的蛋 白质。I型TGF-β受体可使用在细胞表面表达的形态的物质。另外，关于 NS3蛋白酶也可使用如后述的实施例所记载的那样的、在N末端侧融合了 NS4A的一部分序列而得的蛋白质。另外，NS4A与NS3蛋白酶同样地是 来源于HCV的蛋白质，是与NS3蛋白酶的N末端部位结合而形成复合体， 作为使蛋白酶活性增强的辅因子发挥功能的蛋白质。

在(a)的工序中，使彼此结合的NS3蛋白酶与I型TGF-β受体在被验 化合物存在下进行接触，该接触可以在被验化合物不存在下，在不抑制NS3 蛋白酶与I型TGF-β受体的结合的条件下进行。

另外在(b)的工序中，检测NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合，对 该结合的检测没有特别限制，可适当采用公知的手法。例如，可采用免疫 共沉降法、酵母双杂交系统、ELISA法、使用利用了表面等离子体共振现 象的检测装置(例如，BIAcore(GEヘルスケア社制))的方法、利用了 FRET(荧光共振能量移动)的方法。

进而在(c)的工序中，选择抑制上述结合的化合物，例如，在使用免疫 共沉降法的情况下，在被验化合物存在下，通过将在利用NS3蛋白酶的特 异性的抗体使NS3蛋白酶沉降时共沉淀的I型TGF-β受体的量、与在被验 化合物不存在下的I型TGF-β受体的量(对照值)进行比较来评价。即，在 被验化合物存在下的I型TGF-β受体的量与被验化合物不存在下的量相比 较低的情况(例如，对照的值的80%以下、50%以下、30%以下的情况)下， 可将该被验化合物评价为具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体活化 的活性的化合物。在上述结合的检测中使用除免疫沉降法以外的方法的情 况下也同样，使用被验化合物不存在下的上述结合的程度作为对照值来进 行评价。

进而，本发明还提供具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体活化 的活性的化合物的筛选方法，其包括以下的(a)～(c)的工序：

(a)在被检化合物的存在下，使NS3蛋白酶与I型TGF-β受体接触的 工序，

(b)检测由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体的活化的工序，

(c)选择抑制上述结合的化合物的工序。

在该筛选方法中使用的被验化合物、NS3蛋白酶、及I型TGF-β受体、 以及(a)的工序，与上述筛选方法相同。

另外在(b)的工序中，检测由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体的活化， 对该活化的检测没有特别限制，可适宜采用公知的方法。例如，可采用利 用磷酸化位点特异性抗体的I型TGF-β受体和/或Smad2/3等的磷酸化的 检测、用荧光蛋白质等标记的Smad复合体的向核内的转移的检测、如后 述的实施例6～8所记载的Reporter Assay。

进而在(c)的工序中选择抑制上述活化的化合物，例如，在使用 Reporter Assay时，可通过将被验化合物存在下的荧光素酶活性的值与被 验化合物不存在下的荧光素酶活性的值(对照值)进行比较来评价。即，在 被验化合物存在下的荧光素酶活性的值与被验化合物不存在下的值相比较 低的情况(例如，对照的值的80%以下、50%以下、30%以下的情况)下， 可将该被验化合物评价为具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体活化 的活性的化合物。在上述活化的检测中使用除Reporter Assay以外的方法 时也同样，可使用被验化合物不存在下的上述活化的程度作为对照值来进 行评价。

实施例

以下，基于实施例及比较例更具体地说明本发明，但本发明并不限定 于以下的实施例。另外，本实施例中使用的“纯化重组NS3蛋白质”如下 述那样进行制备。

＜纯化重组NS3蛋白质＞

首先，培养用插入了以下基因的质粒载体PET32a(+)(Novagen社制) 转化而得的大肠杆菌KRX株，所述基因编码在来源于HCV的NS3蛋白 酶结构域区域(GenBank ACCESSION No.AAB27127.1所特定的蛋白质中 的1027～1445氨基酸)的N末端(该蛋白质中的1027～1206氨基酸)介由接 头(SGS)而融合有来源于HCV的NS4A的一部分序列(GenBank  ACCESSION No.AAB27127.1所特定的蛋白质中的1678～1690氨基酸， GSVVIVGRIILSG)而得的蛋白质，即scNS4A-NS3蛋白酶(参照Protein  Sci.，1998年，7卷，10号，2143～2149页，包含序列号7所记载的氨基 酸序列的蛋白质)。然后，用IPTG(异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷)诱导添加 了来源于pET32a(+)载体的trx-His-S标签的目的蛋白质的表达后，回收菌 体。将回收的菌体悬浮于缓冲液(20mM Tris-HCl[pH值8.0]、300mM NaCl、4mM MgCl₂、10%甘油、1mM DTT、0.1%n-ctyl-β-o-吡喃葡萄糖 苷)后，用超声波破碎并离心，将分离的上清用0.45μm孔径大小的过滤器 进行过滤。将过滤的上清用HiSTrap HP柱(GEヘルスケア社制)进行亲和 纯化，用HiPrep26/60Desalting柱(GEヘルスケア社制)交换成缓冲液 (20mM TriS-HCl[pH值8.0]，300mM NaCl，0.1mM CaCl₂，2mM DTT) 后，为了除去lPS，使其通过EndoTrap Blue柱(GEヘルスケア社制)后， 将回收的穿流(flow-through)作为纯化重组NS3蛋白质供于本实施例。

(实施例1)NS3蛋白酶的TGF-β2样抗原活性的确认

首先，为了研究来源于HCV的NS3蛋白酶与TGF-β信号转导有无关 联，使用TGF-β2Emax(R)ImmunoAssay System(Promega社制)通过 ELISA法来研究纯化重组NS3蛋白质的TGF-β2样抗原活性。即，用碳酸 缓冲液(pH值9.2)将试剂盒中附带的TGF-β涂布抗体稀释至1/1000，在96 孔ELISA用板(NUNC社制)中以各100μl/孔添加，在4℃静置一夜，对板 进行涂布。将涂布后的板用含0.05%Tween20的磷酸缓冲液(以下，也称 为“PBST”)洗涤后，将试剂盒附带的TGF-β封闭溶液以各270μl/孔添加， 在37℃静置35分钟进行封闭。接着用PBST洗涤进行了封闭处理的板， 添加制备的TGF-β2标准溶液及上述纯化重组NS3蛋白质溶液，在4℃静 置一夜。另外，纯化重组NS3蛋白质通过试剂盒中附带的TGF-β样品稀 释溶液进行稀释至终浓度为2.5、5、10、20μg/ml，作为ELISA的样品， 分别添加各100μl/孔。用PBST洗涤添加了样品的板后，将用TGF-β样品 稀释溶液稀释至1/2000的抗TGF-β2多克隆抗体以各100μl/孔添加，室温 下振荡2小时。接着，用PBST洗涤添加了多克隆抗体的板后，将用TGF-β 样品稀释溶液稀释至1/100的过氧化物酶标记TGF-β以各100μl/孔添加， 室温下静置2小时。进而用PBST洗涤添加了TGF-β的板后，作为过氧化 物酶底物用显色底物将TMB(四甲基联苯胺)溶液以各100μl/孔添加，在室 温下使其最大显色15分钟，在得到充分的显色的时刻等量添加1mol/l的 盐酸停止反应。其后，测定在450nm的波长下板内的各孔的吸光度。接着， 使用TGF-β2标准品来绘制标准曲线，将纯化重组NS3蛋白质的TGF-β2 样抗原活性换算成活性型TGF-β2量来求出。将得到的结果示于图1。

正如由图1所示的结果明确的那样，确认了来源于HCV的NS3蛋白 酶显示TGF-β2样抗原活性，启示了其参与HCV感染时的肝细胞内的 TGF-β信号转导。另外，NS3蛋白酶的抗原活性强度为TGF-β2的抗原活 性强度的1/50000～1/100000左右。

(实施例2)由NS3蛋白酶引发的TGF-β信号活化的研究

接着，用Reporter Assay来研究来源于HCV的NS3蛋白酶在细胞内 是否活化TGF-β信号。即，使用以下细胞株来研究纯化重组NS3蛋白质 的TGF-β2样活性，所述细胞株是将在荧光素酶基因的上游插入9个对于 TGF-β靶基因的转录重要的转录因子Smad的DNA结合序列(CAGA)而得 的PGl报告质粒(Promega社制)导入貂肺上皮细胞(CCL64细胞)中而构建 的(以下，也称为“×9CAGA/CCL64细胞”)。具体地说，在添加了10% 胎牛血清(EQUITECH-BIO社制)和1%防腐剂(青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶 液，Invitrogen社制)的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM， Invitrogen社制)(以下，也称为“培养培养基”)中以2×10⁵个/ml悬浮× 9CAGA/CCL64细胞，在96孔的细胞培养用板(TPP社制)中以各100μl/ 孔接种，在5%CO₂存在下，在37℃培养一夜。接着，从板中吸引除去培 养上清，用含钙-镁的磷酸缓冲液(以下，也称为“PBS(+)”)洗涤细胞后， 在含有0.1%牛血清白蛋白(EQUITECH-BIO社制)和上述1%防腐剂的 DMEM(以下，也称为“处理培养基”)中以终浓度为12.5、25、50、100μg/ml 加入添加有纯化重组NS3蛋白质的物质100μl，在5%CO₂存在下，在37 ℃进一步培养20小时。第二天，使用荧光素酶分析系统(Promega社制)， 按照该试剂盒的附加文件来测定板内的细胞中的荧光素酶活性。即，吸引 除去培养上清后，用PBS(+)洗涤细胞，在各孔中添加将试剂盒中所附的 Passive Lysis Buffer(5×)稀释1倍而得的液体20μl，室温下振荡15分钟溶 解细胞。其间，预先用10ml的Luciferase Assay Reagent II(荧光素酶测定 试剂II，以下，也称为“LARII溶液”)来溶解1小瓶的Luciferase Assay  Substrate(荧光素酶测定底物)，在96孔的荧光素酶分析用板(Costar社制) 中分注各100μl/孔。接着，将细胞溶解液各10μl加入到预先分注的LARII 溶液中，用移液器进行混和后，用发光光度计(制品名：ARVO(TM)， PerkinElmer社制)测定发光强度。对于各处理，例数为3，以未处理的细 胞的报告活性为1，将纯化重组NS3蛋白质处理细胞的活性量作为相对值 来求出。将得到的结果示于图2。

由图2表示的结果可知，纯化重组NS3蛋白质浓度依赖性地增加荧 光素酶活性。由此显示，NS3蛋白酶以某种方式作用于TGF-β受体，动员 TGF-β信号。

(实施例3)NS3蛋白酶对肝星状细胞的胶原蛋白产生的促进化的研究

已知TGF-β作用于肝脏的星状细胞，促进由星状细胞的胶原蛋白的异 常产生，引起肝纤维化。因此，接下来对于NS3蛋白酶与胶原蛋白产生促 进的关联性进行研究。即，将Wistar系大鼠(SPF下饲养，雄性，15周龄) 在戊巴比妥麻醉下开腹后，在门静脉中插入导管，按照脱血用洗涤液、 0.06%链霉蛋白酶溶液(Carbiochem社制)、0.03%胶原酶(和光纯药社制) 溶液的顺序进行灌流。其后，摘出肝脏，在含有0.057%链霉蛋白酶、0.057% 胶原酶的肝星状细胞分离用缓冲液中加入了2mg/ml DNaseI(Roche  Diagnostics社制)1ml而得的溶液中，在30分钟、36℃的温浴中进行温育。 另外，其间，用1N NaOH将溶解液中的pH值保持为7.2～7.4。接着，将 该肝组织溶解液通过筛网进行过滤，加入肝星状细胞分离用缓冲液使总量 为150ml并分注于3支50ml聚丙烯管中，在4℃以2000转/分钟离心8分 钟。进而吸引除去聚丙烯管中的上清，在各管中加入DNaseI溶液各0.2ml， 添加格氏平衡盐类溶液并用移液器混和，使总量为100ml，再次分注于2 支50ml聚丙烯管中，在4℃以2000转/分钟离心8分钟。吸引除去聚丙烯 管中的上清后，在各管中加入0.2ml的DNaseI溶液，添加格氏平衡盐类溶 液并用移液器混和后，使总量为67.5ml并移至烧杯中，加入通过0.22μm 过滤器灭菌后的Nycodenz(SIGMA社制)溶液(终浓度7.75%)27ml进行混 和。将该细胞溶液分注于8支15ml管中，重层1ml的格氏平衡盐类溶液， 在4℃以3200转/分钟离心15分钟来分离肝星状细胞。将分离的肝星状细 胞以1×10⁵个/ml的浓度悬浮于含有10%胎牛血清(EQUITECH-BIO社制) 和1%防腐剂(Invitrogen社制)的DMEM培养基中，在直径6cm的细胞培 养用皿(CORNING社制)中接种各3ml，在37℃、5%CO₂存在下培养一 夜。第二天，在交换培养基的同时开始处理使得纯化重组NS3蛋白质的终 浓度为20μg/ml，隔天交换培养基并培养7天。另外，作为控制准备没有 用纯化重组NS3蛋白质等处理的细胞(未处置细胞)，隔天交换培养基并培 养7天。7天后，由这些细胞使用RNA纯化试剂盒RNeasy Micro Kit (QIAGEN社制)提取mRNA，使用分光光度计(Nano Drop)测定260nm的 吸光度，求出浓度。接着将该mRNA作为模板，使用PrimeScript(TM)RT  reagent Kit(TAKARA社制)，按照附加文件进行RT反应。进而使用SYBR (R)Premix EX Taq(TM)II(TAKARA社制)，按照附加文件制备反应液， 使用胶原蛋白(Collagen1α1)、α平滑肌肌动蛋白(αSMA)、TGF-β1、及作 为内标的GAPDH的各引物(Invitrogen公司制)进行PCR反应，将mRNA 表达量与未处置细胞的mRNA表达量比较。将得到的结果示于图3。

由图3表示的结果可知，在处理了纯化重组NS3蛋白质的培养大鼠原 代肝星状细胞中，Collagenα1基因的表达与未处置细胞相比增加约6倍， 确认了NS3蛋白酶显著地促进肝星状细胞的胶原蛋白产生。

另外，已知通过TGF-β的活化，作为星状细胞的活化的标志物的αSMa 基因的表达量和/或TGF-β1基因的表达量没有变化，由图3表示的结果可 知，即使用NS3蛋白酶处理星状细胞，这些基因的表达量也没有变化。

因此，由实施例1～3表示的结果启示，NS3蛋白酶如TGF-β那样， 通过大概结合于TGF-β受体来作用，通过将其活化来传达TGF-β信号， 促进胶原蛋白的产生，由此引起肝纤维化。

(实施例4)NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的对接模拟

TGF-β已知与I型TGF-β受体及II型TGF-β受体形成复合体来传达 信号(参照“Joan Massague,Mol Cell，2008年2月1日，29卷，2号，149-150 页”)。因此，由NS3蛋白酶具有TGF-β样活性，启示在分子生物学上， 在NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的间发生分子间相互作用，形成这些复合 体。因此，实施蛋白质间对接模拟(Docking Simulation)，研究这些蛋白质 间相互作用的有无。另外，还可预测NS3蛋白酶内及TGF-β受体内的哪 个氨基酸残基参与这些相互作用。

另外，在目前，不存在完全的蛋白质间相互作用预测装置，提出了由现 存的蛋白质间相互作用数据库来学习的方法、基于经验物理函数的方法等。 本次实施的方法，是全面地评价蛋白质的几何互补性(换言之即蛋白质的凹 凸)情况的方法，基于“Molecular Surface recognition：Determination of  geometric fit between proteins and their ligands by correlation  techniques，Proc.Nati.Acad.Sci.，1993年3月，89卷，2195-2199页” 的记载进行安装。即，将蛋白质座标投射于以等间隔分割的三维栅格中， 各栅格分派表面得分、分子内部得分。对于受体及配基进行该操作。接着， 进行得到的栅格间的卷积计算，全面地探索表面，由得分算出结合状态的 互补性。即，作为得分(互补性得分)越高则互补性越好来评价。另外，该 方法的一个优点在于，由于通过将蛋白质座标变换为三维栅格座标，并可 以通过采用高速傅里叶变换来算出得分，从而执行速度为高速，因此可以 不是考虑受体的一部分，而是考虑全部的受体表面与配基表面的互补性。 另外，该方法的另一个优点在于，即使在不存在由外部的结合部位指定的 状态下，也可预测结合部位。

在本实施例中，具体地说，作为蛋白质的座标，HCV NS3蛋白酶使用 PDB Code：1NS3，I型TGF-β受体使用PDB Code2PJY的B链(type-II)、 C链(type-I)。将得到的结果示于图4。另外，作为预测结构，通过12.0刻 度的欧拉角的组合，产生360×360×180/12＝18000的结构。图4所示的 预测结构为互补性得分上位的20结构，该20结构的得分的分布为760  740 731 720 708 690 687 686 684 684 682 677 669 666  663 662 662 661 660 659，平均值为435.5，中央值为428.0，标准 偏差为54.6。

另外，互补性得分上位的结合状态中较多出现的氨基酸残基，可推测 为容易出现在实际与受体的相互作用中的残基，因此在预测结合状态下， 将原子间距离为以内的氨基酸残基定义为接触残基，作为NS3蛋白 酶与I型TGF-β受体的预测接触残基。将得到的结果示于图5及图6。另 外，图5中记载的氨基酸序列表示NS3蛋白酶的蛋白酶结构域的氨基酸序 列(序列号8所记载的氨基酸序列)，图6中记载的氨基酸序列表示I型 TGF-β受体的细胞外结构域的氨基酸序列(序列号9所记载的氨基酸序列)。 另外，在图5及6中，带有下划线的氨基酸残基表示在预测结合状态下是 原子间的距离为以内的氨基酸残基(预测接触残基)，带有阴影的部位 表示是参与NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合的部位(预测结合位点)。

由图4所示的结果可知，采用上述方法的结果，预测了NS3蛋白酶与 I型TGF-β受体在3个位置结合。另外，如图5及图6所示，还推定了参 与这些结合的部位(预测结合位点)或氨基酸残基(预测接触残基)。

(实施例5)抗体的制作方法

为了证实介由上述预测结合位点(序列号1～6所记载的氨基酸序列)， NS3蛋白酶与I型TGF-β受体结合，由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体的 活化发生，如以下那样基于上述预测结合位点的氨基酸序列制备合成肽等， 制作以这些合成肽等作为抗原的多克隆抗体。

＜合成肽的制备＞

将以NS3蛋白酶或I型TGF-β受体的预测结合位点(序列号1～6记载 的氨基酸序列)作为靶的多克隆抗体制作中使用的合成肽的序列的一览示 于表1。另外，在表1中，“NH2”及“COOH”分别表示各合成肽的N 末端侧及C末端侧。另外N末端侧的“C”表示为了使后述的mcKLH与 各合成肽结合所需的半胱氨酸残基。进而“miniPEG”表示作为间隔分子 插入，为了改善抗原肽与载体蛋白的位阻而付与的平均分子量6000的聚乙 二醇。

表1

用Fmoc固相合成法来合成表1所示的肽(株式会社バイオマトリック ス研究所)。最终肽用含有95%TFA的切割混合物(cleavage cocktail)进行 脱保护及由树脂的切下而制备，合成的肽用HPlC进行纯化。接着，对得 到的合成肽，为了赋予抗原性作为载体蛋白质使其结合mcKLH(PIERCE 社制)。

＜针对纯化重组NS3蛋白质的抗血清的制作＞

使用纯化重组NS3蛋白质将2只兔(雌性，日本白色种(健康))进行免 疫。即，初次每只皮内施与弗氏(Freund)完全佐剂中的150μg的纯化重组 NS3蛋白质，以后皮内施与佐剂中的300μg的纯化重组NS3蛋白质、或耳 缘静脉中施与加食盐的磷酸缓冲液(PBS)中的50μg的纯化重组NS3蛋白 质。免疫使用弗氏完全佐剂的情况下为2周间隔，使用PBS的情况下为1 周间隔。接着，最终免疫的7天后由心脏进行全采血。回收的血液在4℃ 静置一夜后，用离心分离来分离回收血清成分，制成抗血清。得到的抗血 清以0.1%浓度添加叠氮化钠，在4℃保管。另外，血清中的抗体效价使用 ELISA法来确定。在该检测中，首先用PBS稀释的重组蛋白质来涂布微量 滴定板。接着在用0.2%Tween20/PBS洗涤并封闭后的孔中添加连续稀释 的血清进行温育，用针对兔免疫球蛋白的过氧化物酶结合抗体来检测针对 免疫原的抗体。

＜针对合成肽的抗血清的制作＞

使用与KLH结合的各合成肽，通过皮内施与分别将2只兔(雌性，日 本白色种(健康))进行免疫。即，初次每只施与弗氏完全佐剂中的300μg的 KLH结合合成肽，以后施与佐剂中的300μg的KLH结合合成肽。免疫分 别以2周间隔进行。最终免疫的7天后由心脏进行全采血。回收的血液在 4℃静置一夜后，以离心分离来分离回收血清成分，制成抗血清。得到的抗 血清以0.1%浓度添加叠氮化钠，在4℃保管。血清中的抗体效价使用 ELISA法来确定。在该检测中，首先用PBS稀释的合成肽来涂布微量滴定 板。接着在用0.2%Tween20/PBS洗涤并封闭的孔中添加连续稀释的血清 进行温育。用针对兔免疫球蛋白的过氧化物酶结合抗体来检测针对合成肽 的抗体。

＜由抗血清纯化多克隆抗体＞

将如上所述制作的针对纯化重组NS3蛋白质的抗血清用等量的结合缓 冲液稀释后，用过滤器进行过滤除去不溶物。按照常规方法通过填充了 ProteinA-sepharose4B(GEヘルスケア社制)的柱吸附抗体成分后，除去非 特异吸附成分，然后通过置于酸性条件下来回收游离的成分，制成纯化多 克隆抗体。得到的纯化抗体用100倍量的PBS缓冲液进行透析置换后，以 终浓度为0.1%添加叠氮化钠。

另外，如上所述制作的针对合成肽的抗血清，使用针对各自的抗原柱 进行亲和纯化。即，按照常规方法制成使各合成肽结合于CNBr-activated  Sepharoseose4B(GEヘルスケア社制)而制成抗原柱。用过滤器过滤以等量 的结合缓冲液稀释的抗血清除去不溶物后，通过抗原柱吸附特异抗体。除 去非特异吸附成分，然后通过置于酸性条件下来回收游离的成分，制成纯 化多克隆抗体。得到的纯化抗体用100倍量的PBS缓冲液进行透析置换后， 以终浓度为0.1%添加叠氮化钠。

(实施例6)通过针对NS3蛋白酶与TGF-β受体的结合部位的抗体进 行的、由NS3蛋白酶引起的TGF-β样活性抑制的研究

与实施例2同样操作，在培养培养基中以2×10⁵个/ml的浓度悬浮× 9CAGA/CCL64细胞，在96孔细胞培养用板中以各100μl/孔接种，在5% CO₂存在下、在37℃培养一夜。培养后吸引除去板内的培养上清，以PBS(+) 洗涤细胞后，将“NS3蛋白酶与抗体的混合溶液”或仅含有NS3蛋白酶的 溶液以各100μl/孔进行添加，在5%CO₂存在下、在37℃进一步培养20 小时，然后与实施例2同样操作，求出各抗体存在下的报告活性。得到的 结果示于图7。另外，图7～14中，“对照”表示在培养基中不添加蛋白 质(纯化重组NS3蛋白质及重组人TGF-β2)及抗体、即不接触的条件下培 养的细胞的报告活性的值，“兔1”及“兔2”这样的标记表示通过同一抗 原进行免疫，但由不同的兔个体提取的多克隆抗体。

另外，上述“NS3蛋白酶与抗体的混合溶液”如下制备：在处理培养 基中添加纯化重组NS3蛋白质使得终浓度为100μg/ml，进而，添加针对I 型TGF-β受体侧的预测结合位点制作的抗体(以下，也称为“抗I型受体 抗体”)6种、针对NS3蛋白酶侧的NS3侧的预测结合位点制作的抗体(以 下，也称为“抗NS3抗体”)6种、或针对纯化重组NS3蛋白制作的抗体(以 下，也称为“抗重组NS3抗体”)2种使得各个终浓度为10μg/ml。

进而，作为“NS3蛋白酶与抗体的混合溶液”，使用如下制备的物质： 在处理培养基中添加纯化重组NS3蛋白使得终浓度为100μg/ml，分别以终 浓度为10μg/ml进一步添加抗NS3抗体6种、抗重组NS3抗体、或作为阴 性对照的无免疫的小鼠抗体，然后在4℃进行1小时预温育。除此以外， 与上述同样操作，求出各抗体存在下的报告活性。得到的结果示于图8。

进而，作为“NS3蛋白酶与抗体的混合溶液”，使用如下制备的物质： 在处理培养基中加入纯化重组NS3蛋白质使得终浓度为100μg/ml，进一步 分别以终浓度为1.25、2.5、5、10μg/ml添加抗NS3抗体2种，以终浓度 为3.1、6.3、12.5、25、50、100μg/ml添加抗重组NS3抗体，或以终浓度 为1.25、2.5、5、10μg/ml添加无免疫小鼠抗体，然后在4℃进行1小时预 温育。除此以外，与上述同样操作，求出各抗体存在下的报告活性。得到 的结果示于图9。

另外，与上述同样操作，将×9CAGA/CCL64细胞接种于96孔细胞培 养用板并培养一夜后，吸引除去板内的培养上清，以PBS(+)洗涤细胞。接 着，对洗涤后的细胞，分别以50μl/孔加入以20μg/ml添加有抗I型受体抗 体6种或无免疫的小鼠抗体(阴性对照)的处理培养基，在5%CO₂存在下、 在37℃处理1小时。其后，分别以50μl/孔进一步加入以200μg/ml添加有 纯化重组NS3蛋白的处理培养基，使各抗体的终浓度为10μg/ml，纯化重 组NS3蛋白的终浓度为100μg/ml，在5%CO₂存在下、在37℃进一步培养 20小时。培养后，与实施例2同样操作，求出各抗体存在下的报告活性。 得到的结果示于图10。

进而，与上述同样操作，将×9CAGA/CCL64细胞接种于96孔细胞培 养用板中培养一夜后，吸引除去板内的培养上清，以PBS(+)洗涤细胞。接 着，对洗涤后的细胞，分别以50μl/孔加入以2.5、5、10、20μg/ml的添加 有抗I型受体抗体2种或无免疫的小鼠抗体(阴性对照)的处理培养基，在 5%CO₂存在下、在37℃处理1小时。其后，分别以50μl/孔进一步加入以 200μg/ml添加有纯化重组NS3蛋白的处理培养基，使各抗体的终浓度为 1.25、2.5、5、10μg/ml，纯化重组NS3蛋白的终浓度为100μg/ml，在5%CO₂存在下、在37℃进一步培养20小时。培养后，与实施例2同样操作，iuch 各抗体存在下的报告活性。得到的结果示于图11。

由图7表示的结果可知，确认了通过同时在细胞中添加6种抗I型受 体抗体、6种抗NS3抗体、或2种抗重组NS3抗体与NS3蛋白酶，有NS3 蛋白酶引起的荧光素酶活性的增加30～50%被抑制。

另外，由图8及图10所示的结果可知，确认了通过用各抗体将各抗原 进行前处理，由NS3蛋白酶引起的荧光素酶活性的增加几乎100%被抑制。

进而，对于抑制效果强的抗体研究浓度依赖性，由图9及图11所示的 结果可知，确认了浓度依赖性地抑制由NS3蛋白酶引起的荧光素酶活性的 增加。

另外，由图7～11所示的结果可知，在作为阴性对照使用的无免疫小 鼠抗体中没有确认该抑制作用，由以上情况可知，NS3蛋白酶在实施例4 中预测的部位与I型TGF-β受体结合，动员TGF-β信号。

进而，由使用这些抗体的实验结果证实，NS3蛋白酶与I型TGF-β 受体实际地介由上述预测结合位点结合，产生由NS3蛋白酶引起的TGF-β 受体的活化。另外，识别NS3蛋白酶或I型TGF-β受体中的预测结合位点 的抗体，也显示抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体的活化，与前述的 实施例3中记载的结果结合可知，本发明的抗体对预防或治疗由丙型肝炎 病毒引起的肝疾病是有效的。

(实施例7)针对NS3蛋白酶与TGF-β受体的结合位点的抗体对荧光 素酶活性抑制效果的特异性的研究

与实施例2同样地将×9CAGA/CCL64细胞接种于96孔细胞培养用板， 培养一夜。制备以下物质：在以终浓度为100μg/ml添加有纯化重组NS3 蛋白的处理培养基中，分别以终浓度大约为10μg/ml添加抗NS3抗体1种、 TGF-β2Emax(R)ImmunoAssay System(Promega社制)所附带的抗 TGF-β2多克隆抗体、或2种无免疫兔抗体。并在4℃进行1小时预温育。 接着，从培养一夜后的板中吸引除去培养上清，用PBS(+)洗涤后，将预温 育的处理培养基分别以各100μl/孔添加，在5%CO₂存在下、在37℃进一 步培养20小时。其后，与实施例2同样操作，求出各抗体存在下的报告活 性。得到的结果示于图12。

由图12所示的结果可知，抗NS3抗体几乎100%抑制由NS3蛋白酶 引起的荧光素酶活性增加，与此相对，在对NS3蛋白酶有亲和性的上述抗 TGF-β2多克隆抗体、无免疫兔抗体不能得到该抑制效果。因此，由这样 的结果可知，为了抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β信号转导，结合于实 施例4中预测的部位是有效的。

(实施例8)针对NS3蛋白酶与TGF-β受体的结合部位的抗体对 TGF-β2的活性的影响的研究

与实施例2同样操作，将×9CAGA/CCL64细胞接种于96孔细胞培养 用板，培养一夜。制备以下物质：在以终浓度为500μg/ml添加有重组人 TGF-β2(PEProTECH社制)的处理培养基中，以各个终浓度为10μg/ml添 加抗NS3抗体、抗重组NS3抗体、作为阳性对照的抗TGF-β2抗体、或作 为阴性对照抗TGF-β2-LAP抗体。在4℃进行1小时预温育。接着，从上 述培养一夜后的板中吸引除去培养上清，用PBS(+)洗涤细胞后，将预温育 的处理培养基分别以各100μl/孔进行添加，在5%CO₂存在下、在37℃进 一步培养20小时。其后，与实施例2同样操作，求出各抗体存在下的报告 活性。得到的结果示于图13。

另外，与实施例2同样操作，将×9CAGA/CCL64细胞接种于96孔细 胞培养用板，培养一夜。从培养一夜后的板中吸引除去培养上清，以PBS(+) 洗涤细胞后，以20μg/ml的浓度，将含有抗I型受体抗体、抗TGF-β2抗 体(阳性对照)、或抗TGF-β2-LAP抗体(阴性对照)的处理培养基分别以50μl/ 孔进行添加，在37℃、在5%CO₂存在下处理1小时。其后，将含有1000pg/ml 重组人TGF-β2的处理培养基以50μl/孔进行添加，调制使得重组人TGF-β2 的终浓度为500pg/ml，各抗体的终浓度为10μg/ml，在37℃、5%CO₂存 在下进一步培养20小时培养。其后，与实施例2同样操作，求出各抗体存 在下的报告活性。得到的结果示于图14。

由图13所示的结果可知，在作为阳性对照的抗TGF-β2抗体中， TGF-β2的活性几乎100%被抑制，与此相对，在针对NS3蛋白酶的抗体 中，并未确认对TGF-β2的活性的影响。另一方面，由图14所示的结果可 知，通过针对I型TGF-β受体的抗体，TGF-β2的活性最大27%被抑制。 因此，由这样的结果启示，NS3蛋白酶与TGF-β受体的结合部位，虽然和 TGF-β2与TGF-β受体的结合部位不相同，但存在一部分共有的部位。

(实施例9)针对NS3蛋白酶与TGF-β受体的结合部位的单克隆抗体 的制作

＜单克隆抗体制作用NS3蛋白的纯化＞

首先，将插入了编码scNS4A-NS3蛋白酶的基因的质粒载体 PET32a(+)，整合到导入有pMINOR质粒的大肠杆菌KRX株中，进行培 养。另外，关于scNS4A-NS3蛋白酶，参照Protein Sci.，1998年，7卷， 10号，2143～2149页。另外关于pMINOR质粒，参照J.Struct.Func. Genom.，2006年，7卷，31～36页。

接着，用鼠李糖诱导目的蛋白质的表达后，通过离心分离诱导了该蛋 白质的表达的大肠杆菌的培养液，来回收菌体。回收的菌体悬浮于缓冲液 (20mM Tris-HCl[pH值8.0]、500mM NaCl、4mM MgCl₂、10%甘油、20μm ZnCl₂、1mM DTT、0.1%n-ctyl-β-o-吡喃葡萄糖苷，完全无EDTA(Roche  Applied Science社制))中，用超声波将菌体破碎后，以14000×g离心20 分钟，回收上清。将回收的上清通过HisTrap HP柱(GEヘルスケア社制)， 使目的蛋白质暂时吸附在填充于柱中的树脂中，然后用溶出缓冲液 (500mM咪唑、20mM Tris-HCl pH值8.0、500mM NaCl、20μm ZnCl₂、 1mM DTT)使目的蛋白质从树脂中溶出。

将这样操作得到的溶出液通过HiPrep26/60Desalting柱(GEヘルスケ ア社制)，进行脱盐操作，置换成含有目的蛋白质的缓冲液(20mM TriS-HCl [pH值8.0]，150mM NaCl，20μm ZnCl₂，10mM DTT，100mM CaCl₂)。 为了除去内毒素而使其通过EndoTrap Blue柱(Hyglos Gmbh社制)而回收 过滤的液体，作为单克隆抗体制作用NS3蛋白(以下，也称为“重组NS3”) 供给以下的实验。

＜免疫及细胞融合＞

接着，向雌性的BLAB/c小鼠腹腔注射重组NS3来进行免疫。初次免 疫每只施与弗氏完全佐剂中的50μg的重组NS3，以后的免疫中施与水包油 型乳剂佐剂中的50μg的重组NS3。免疫分别以3周间隔进行。最终免疫施 与含有50μg的重组NS3的加食盐的磷酸缓冲液(PBS)来进行。最终免疫的 3天后，对于血清中的抗体效价高的个体的脾脏细胞使用聚乙二醇4000进 行与P3.X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞的细胞融合处理。杂交瘤细胞使用公 知的kohler及Milstein的技术在HAT培养基中进行选择。

另外，血清中的抗体效价使用ELISA法来检测。在该检测中，首先将 96孔微板用重组NS3或后述的结合了Imject OVA的抗原(以下，也称为 “OVA结合合成肽”)涂布。接着用1%脱脂乳/加食盐的磷酸缓冲液进行 封闭后，添加连续稀释的血清进行培养。用TBS/0.05%Tween20洗涤板后， 在孔中加入以1%脱脂乳/加食盐的磷酸缓冲液稀释的针对小鼠免疫球蛋白 的过氧化物酶结合抗体，在室温下温育1小时。温育后，用TBS/0.05% Tween20洗涤板，将底物溶液(0.05%邻苯二胺/柠檬酸缓冲液(pH值 5)/0.03%H₂O₂)加入孔中，进行显色反应。在添加底物溶液开始10分钟后， 通过添加2N硫酸来停止反应，用分光光度计测定490nm的吸光度。

＜OVA结合合成肽的制备＞

首先，用Fmoc固相合成法合成表1所示的肽NS-1～NS-3(株式会社 バイオマトリックス研究所)。肽最终产物以含有95%TFA的切割混合物 进行脱保护和由树脂的切下来制备。另外，为了在筛选中使用合成肽，将 Imject OVA(Thermo SCIENTIFIC Pierce Protein Research Products社制) 作为载体蛋白质使其与合成肽结合。

＜筛选＞

使用利用了ELISA法及免疫沉降的免疫沉降ELISA法，挑选与重组 NS3反应的杂交瘤。即，首先将重组NS3(终浓度1μg/ml，以50mM碳酸 缓冲液制备)在疏/亲水性分子吸附性96孔微板上在室温下固定1小时。接 着用TBS/0.05%Tween20洗涤板后，将孔表面的自由的吸附部分使用1% 脱脂乳/加食盐的磷酸缓冲液在室温下封闭1小时，再用TBS/0.05% Tween20进行洗涤。将杂交瘤培养上清加入孔中，在室温下温育1小时。 其后，用TBS/0.05%Tween20洗涤板，接着将以1%脱脂乳/加食盐的磷酸 缓冲液稀释的过氧化物酶结合小鼠抗IgG抗体加入孔中，室温下温育1小 时。温育后，用TBS/0.05%Tween20洗涤板，将底物溶液(0.05%邻苯二胺 /柠檬酸缓冲液(pH值5)/0.03%H₂O₂)加入孔中，进行显色反应。在添加底 物溶液10分钟后，用2N硫酸停止反应，用分光光度计测定490nm的吸 光度。另外，作为比较对象，对于抗NS1肽多克隆抗体(在实施例5中制 备的、与表1所记载的NS-1结合的多克隆抗体)、抗NS3肽多克隆抗体(在 实施例5中制备的、与表1所记载的NS-3结合的多克隆抗体)、抗rikenNS3 肽多克隆抗体(在实施例5中制备的、以纯化重组NS3蛋白质为抗原的多 克隆抗体)也同样地进行评价(以下，同样)。将得到的结果示于表2及3的 C栏。

另外，在免疫沉降ELISA法中，将混合了重组NS3、抗体吸附珠和杂 交瘤培养上清的各溶液的反应液搅拌1小时后，将放置5分钟得到的上清 作为试样通过ELISA法进行检测。将得到的结果示于表2及3的B栏。 另外，表2及3的B栏所记载的“IP%”，是将对于抗原被抗体完全除去 的上述上清通过ELISA法的测定值作为100%，将对于抗原完全没有被除 去的上述上清通过ELISA法的测定值作为0%，而分别算出的值。

表2

表3

接着，为了除去与重组NS3中含有的标签蛋白质(trx-His-S标签)反应 的杂交瘤，以对由基因重组大肠杆菌制备的重组trx-His-S标签蛋白质的反 应性为指标，使用利用了ELISA法及免疫沉降的免疫沉降ELISA法来挑 选。即，首先将trx-His-S标签蛋白质(终浓度1μg/ml，用50mM碳酸缓冲 液制备)在疏/亲水性分子吸附性96孔微板上在室温下固定1小时。接着用 TBS/0.05%Tween20洗涤板后，使用1%脱脂乳/加食盐的磷酸缓冲液将孔 表面的自由吸附部分在室温下封闭1小时，再用TBS/0.05%Tween20进行 洗涤。将杂交瘤培养上清加入孔中，在室温下温育1小时。其后，用 TBS/0.05%Tween20洗涤板，接着将用1%脱脂乳/加食盐的磷酸缓冲液稀 释的过氧化物酶结合小鼠抗IgG抗体加入孔中，在室温下温育1小时。温 育后，用TBS/0.05%Tween20洗涤板，将底物溶液(0.05%邻苯二胺/柠檬 酸缓冲液(pH值5)/0.03%H₂O₂)加入孔中，进行显色反应。添加底物溶液 10分钟后，用2N硫酸停止反应，用分光光度计测定490nm的吸光度。

另外，在免疫沉降ELISA法中，将混合了trx-His-S标签蛋白质、抗 体吸附珠和杂交瘤培养上清的各溶液混合的反应液搅拌1小时后，将得到 的上清作为试样通过ELISA法进行检测。

接着，预想在使用该trx-His-S标签蛋白质的ELISA法及免疫沉降 ELISA法中确认了对trx-His-S标签蛋白质显示反应性的杂交瘤为抗 trx-His-S标签蛋白质抗体产生克隆，因此由研究对象中排除。

＜对于表位的研究＞

对于用上述的方法选择的对重组NS3显示阳性的杂交瘤，通过ELISA 法研究了由它们产生的抗NS3单克隆抗体对上述合成肽(NS-1～NS-3)的反 应性，对于这些抗体所识别的表位进行研究。即，首先分别将结合了OVA 的NS-1、NS-2、NS-3的合成肽(终浓度0.5μg/ml，用50mM碳酸缓冲液 制备)在疏/亲水性分子吸附性96孔微板上于室温下固定1小时。接着用 TBS/0.05%Tween20洗涤板后，将孔表面的自由吸附部分用1%脱脂乳/加 食盐的磷酸缓冲液在室温下封闭1小时，再用TBS/0.05%Tween20进行洗 涤。接着，将杂交瘤培养上清加入孔中，在室温下温育1小时。其后，用 TBS/0.05%Tween20洗涤板，接着将用1%脱脂乳/加食盐的磷酸缓冲液稀 释的过氧化物酶结合小鼠抗IgG抗体加入孔中，在室温下温育1小时。温 育后，用TBS/0.05%Tween20洗涤板，将底物溶液(0.05%邻苯二胺/柠檬 酸缓冲液(pH值5)/0.03%H₂O₂)加入孔中，进行显色反应。添加底物溶液 10～15分钟后，通过添加2N硫酸来停止反应，用分光光度计测定490nm 的吸光度。将得到的结果示于表4及5的E～G栏。

表4

表5

＜对于抗NS3单克隆抗体的反应性的评价＞

另外，对于对重组NS3显示阳性的杂交瘤，还通过ELISA法研究了 由其产生的抗NS3单克隆抗体的对NS3肽(市售品)的反应性。即，首先将 NS3-NS4A(HCV)，(重组)(His-tag)(ALEXIS社制)(终浓度0.5μg/ml，用 50mM碳酸缓冲液制备)在疏/亲水性分子吸附性96孔微板上于室温下固 定1小时。接着用TBS/0.05%Tween20洗涤板后，将孔表面的自由吸附部 分用1%脱脂乳/加食盐的磷酸缓冲液在室温下封闭1小时，再用 TBS/0.05%Tween20进行洗涤。将杂交瘤培养上清加入孔中，在室温下温 育1小时。其后，用TBS/0.05%Tween20洗涤板，接着将用1%脱脂乳/ 加食盐的磷酸缓冲液稀释的过氧化物酶结合小鼠抗IgG抗体加入孔中，在 室温下温育1小时。温育后，用TBS/0.05%Tween20洗涤板，将底物溶液 (0.05%邻苯二胺/柠檬酸缓冲液(pH值5)/0.03%H₂O₂)加入孔中，进行显色 反应。添加底物溶液10～15分钟后，通过添加2N硫酸来停止反应，用分 光光度计测定490nm的吸光度。将得到的结果示于表2及3的D栏。

＜单克隆抗体的纯化＞

依据公知的方法，用0.22μm过滤器来过滤上述杂交瘤的培养上清从 而从培养上清除去不溶物。接着依据常规方法，使培养上清通过填充了 Proteing-sepharose4B(GE Heithecare社制)的柱并使抗体成分吸附后，通 过柱洗涤除去非特异吸附成分，然后在酸性条件下使吸附的IgG游离。回 收游离的IgG(单克隆抗体)，制成纯化抗体。另外，得到的纯化抗体用100 倍量的PBS进行透析，置换缓冲液。

另外，表2～5所记载的35种的抗NS3单克隆抗体的同种型，使用同 种型鉴定用试剂盒(Bethyl Laboratories社制)，根据附带的方案进行鉴定。

(实施例9)使用抗NS3单克隆抗体的Reporter Assay

对于对重组NS3显示阳性的杂交瘤，对于由它们产生的抗NS3单克隆 抗体对NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合(由NS3蛋白酶产生的TGF-β 样活性)的抑制进行了研究。即，首先将设计成通过来自II型TGFβ受体 的信号增强而荧光素酶基因的表达被增强那样的报告细胞(× 9CAGA/CCL64细胞)以汇合的形式接种于96孔微板，在37℃、5%CO₂的条件下培养一夜。细胞在除去培养上清后用PBS洗涤，置换成以终浓度 为100μg/ml添加了重组NS3的无血清培养基。此时，在添加了重组NS3 的无血清培养基中以终浓度为1μg/ml或0.1μg/ml添加含有浓度已知的抗 NS3单克隆抗体的杂交瘤培养上清(不含血清)。另外，准备在添加了重组 NS3的无血清培养基中未添加抗NS3单克隆抗体的物质。接着，将这样制 备的细胞在37℃、在5%CO₂下培养一夜后，进行培养上清的除去和利用 PBS的洗涤。接着，在洗涤后的细胞中添加30μl Passive Lysis buffer (Promega社制)，在室温下剧烈搅拌15分钟使细胞溶解。将按照标准的方 案制备的Luciferase Assay Substrate(Promega社制)向Luciferase Assay (荧光素酶测定)用96孔微板中以每1孔各100μl分注，进而，向其中添加 细胞溶解液15μl。接着，添加了细胞溶解液的微孔板直接用荧光板读取器 测定荧光素荧光信号。另外，将仅添加了重组NS3的无血清培养基(不添 加抗NS3单克隆抗体的培养基)的测定值作为100来对得到的各测定值进 行换算，由此算出各抗NS3单克隆抗体对NS3蛋白酶与I型TGF-β受体 的结合的抑制的程度(结合抑制%)。将得到的结果示于表2及3的A栏。 另外，表2～5所示的35种的克隆，是本次制作的抗NS3单克隆抗体中， 在该Reporter Assay中显示活性(结合抑制)的克隆或在上述免疫沉降 ELISA法中显示对抗原的反应性(IP为10%以上)的克隆。

(实施例10)针对NS3蛋白酶与TGF-β受体的结合部位的抗体对NS3 蛋白酶的胶原蛋白产生促进能力的抑制

对于针对NS3蛋白酶与TGF-β受体的结合部位的单克隆抗体(抗NS3 单克隆抗体)5种(表2～5所记载的克隆：e1211、e0458、s0647、P3-g0948、 P3-g1390是否抑制由NS3蛋白酶引起的胶原蛋白产生促进能力，使用来自 人正常肝细胞的细胞株Hc细胞来研究。在添加了10%胎牛血清 (EQUITECH-BIO社制)和1%防腐剂(青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液， Invitrogen社制)的Dulbecco’s Modified Eagle Medium培养基(DMEM， Invitrogen社制)中悬浮Hc细胞使其为4×10⁵个/ml，在24孔的细胞培养 用板(TPP社制)中以各500μl/孔接种，在5%CO₂存在下，在37℃培养一 夜。接着，由板吸引除去培养上清，用含钙-镁磷酸缓冲液洗涤细胞后，以 各250μl/孔添加包含以终浓度为0.02、0.2、2、20μg/ml添加有抗NS3单 克隆抗体克隆No.e1211、或对于其他的克隆以20μg/ml添加有含有抗NS3 单克隆抗体的0.1%牛血清白蛋白(EQUITECH-BIO社制)和上述1%防腐 剂的DMEM(以下，也称为“处理培养基”)，在5%CO₂存在下、在37℃ 培养1小时。其后，进一步以各250μl/孔加入以100μg/ml添加有重组NS3 处理培养基，使e1211抗体的终浓度为0.01、0.1、1、10μg/ml、对于其他 的克隆终浓度为10μg/ml，而且重组NS3的终浓度为50μg/ml，在5%CO₂存在下、在37℃进一步培养20小时。另外，还制备在不含有抗NS3单克 隆抗体及纯化重组NS3蛋白酶的处理培养基中培养的细胞(无处理细胞)作 为阴性对照。进而，还制备在不含有抗NS3单克隆抗体、以终浓度为 50μg/ml添加有纯化重组NS3蛋白酶的处理培养基中培养的细胞作为阳性 对照。

其后，使用TRIzol试剂(Invitrogen社制)从这些细胞提取RNA，使用 分光光度计(Nano Drop)测定260nm的吸光度，求出浓度。接着以该RNA 作为模板，使用primeScript(TM)RT reagent Kit(TAKARA社制)，按照 附加文件进行RT反应。进而使用SYBR(R)Premix Ex Taq(TM)II (TAKARA社制)，按照附加文件制备反应液，使用胶原蛋白(Collagen)1α1 及作为内标的GAPDH的各引物(Invitrogen社制)进行PCR反应，用 GAPDH表达量修正Collagen1α1mRNA表达量后，与无处理细胞(阴性对 照)的表达量进行比较。将得到的结果示于图15。

如图15所示，通过NS3蛋白酶使Hc细胞的胶原蛋白表达量增强至约 2倍(参照阴性对照及阳性对照)，明确了该NS3蛋白酶的胶原蛋白产生促 进能力可被抗NS3单克隆抗体抑制。特别研究的5种抗NS3单克隆抗体中， e1211从最低的低浓度开始显示抑制活性。

产业上可利用性

如以上说明的那样，根据本发明，可提供能抑制由HCV引起的TGF-β 受体活化的化合物、以及该化合物的筛选方法，进一步可提供用于预防或 治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病的组合物。

另外，本发明的化合物及含有该化合物作为有效成分的药物组合物， 具有基于抑制NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合这样的作用机制的效 果，因此与PEG干扰素、利巴韦林、NS3蛋白酶的活性抑制剂等这样的现 有或开发中的由丙型肝炎病毒引起的疾病的治疗药相比，在肝纤维化等的 发病机制的作用点不同。因此，通过合并使用本发明的药物组合物与这些 现有或开发中的治疗药，可降低使用的各药物的浓度，同时抑制由丙型肝 炎病毒引起的病态的发展，排除病毒，有可能根治治疗由丙型肝炎病毒引 起的肝疾病。