利用逆转录定量实时PCR(RT-qPCR)技术检测、区分和定量T细胞群体的方法

摘要

本发明涉及一种用于检测、区分和定量T细胞群体的方法，包括下述步骤：a)使第一等份的个体体液与至少一种抗原接触，其中所述体液含有抗原呈递细胞(APC)和T细胞，b)将所述第一等份与所述至少一种抗原温育一段特定的时间，c)通过利用逆转录定量实时聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测所述第一等份中以及未与所述至少一种抗原温育过的第二等份的个体体液中由特定T细胞群体中的T细胞诱导的至少第一种APC标志物来检测和区分T细胞群体，和d)通过确定检测到的第一等份的APC标志物与第二等份的比例来检测和定量T细胞群体。本发明还涉及用于实施该方法的试剂盒。

说明书

本发明涉及用于检测、区分和定量T细胞群体的方法，包括下述步骤： a)使第一等份的个体体液与至少一种抗原接触，其中所述体液含有抗原呈递 细胞(APC)和T细胞，b)将所述第一等份与至少一种抗原温育一段确定的时 间，c)通过利用逆转录定量实时聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测所述第一等 份中以及未与所述至少一种抗原温育过的第二等份的个体体液中由特定T 细胞群体中的T细胞诱导的至少第一种APC标志物来检测和区分T细胞群 体，和d)通过确定检测到的第一等份的APC标志物与第二等份的比例来检 测和定量T细胞群体；还涉及用于实施该方法的试剂盒。

T细胞通过协调免疫应答以及藉由多种直接和间接效应物功能控制和 消灭病原体和肿瘤细胞，在抗微生物感染和肿瘤疾病的免疫防御复杂网络中 扮演关键角色。对复杂的T细胞功能的干扰可能导致自身攻击性T细胞的错 误活化，同时引发严重的自身免疫病如多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎 (RA)和青少年糖尿病(I型糖尿病)。

理论上，T细胞在表型上呈现很大的异质性以及广谱的效应物功能。因 此，基于表面蛋白CD4和CD8的表达，可以将T细胞大致分类为CD4阳 性T细胞(T辅助细胞(Th))和CD8阳性细胞毒T细胞(CTL)。

CD4⁺T细胞在免疫防御的活化、极化(polarization)和协调中扮演关键角 色。CD4⁺T细胞由于它们的T细胞受体与位于抗原呈递细胞(APC)表面上的 加载有肽的II类MHC分子的特异性相互作用而被活化，随后藉由细胞-细 胞接触和/或各种信使分子(例如细胞因子、趋化因子)的分泌来控制B细胞的 抗体产生(免疫应答的体液分支)以及CTL的活化(免疫应答的细胞分支)。

基于特征性表面蛋白的表达和标志物细胞因子的产生，可以将CD4⁺T 细胞细分为T辅助细胞1(Th-1)、T辅助细胞2(Th-2)、和T辅助细胞17 (Th-17)。Th-1细胞以细胞因子IFN-γ与TNF-α的产生以及转录因子T-bet的 表达为特征。Th-1细胞通过刺激巨噬细胞、CD4^-CD8⁺细胞毒性T细胞、 CD4⁺CD8⁺细胞毒性T细胞、以及天然杀伤细胞(NK细胞)和NKT细胞的活 化和分化来支持高效的细胞介导免疫应答的发动。Th-2以细胞因子IL-4、 IL-5、IL6、IL-10和IL-13的分泌以及转录因子GATA-3的产生为特征，并 且支持B细胞中抗体(免疫系统的体液分支)的产生以及类别改变。Th-17细 胞以细胞因子IL-17、TNF-α、GM-CSF和IL-6的产生为特征，且似乎在风 湿性自身免疫病中起关键作用。除了Th-1、Th-2和Th-17细胞之外另一种 CD4⁺T细胞群体被定义为调节性T细胞，其在免疫应答的弱化、口服免疫 耐受以及自身免疫病的预防中起重要作用。调节性T细胞可细分为CD4⁺CD25⁺CTLA4⁺天然调节性T细胞(T-reg)以及Th-3和Tr-1细胞，后两者以细 胞因子TGF-β(Th-3细胞)或IL-10(Tr-1细胞)的产生为特征。

在与感染了微生物和寄生物的细胞和组织以及肿瘤细胞的对抗中，CTL 通过直接效应物机制，诸如释放细胞毒性物质(例如穿孔蛋白、颗粒酶)和触 发凋亡来破坏所述细胞和组织，从而起关键作用。此外，通过分泌免疫刺激 性细胞因子(IFN-γ,TNF-α,IL-15)和趋化因子(MIP1α,MIP1β,Rantes)以及多 种可溶性抗病毒因子(IFN-α,IFN-β,IFN-δ,CAF)，CTL表现更多的，在某种 程度上说非常特异性的效应物功能，此类功能非常高效地有助于对病原体复 制和扩散的限制。此外，其他细胞毒性T细胞群体已经得到描述，此类群体 展现CD4⁺CD8⁺表型(CD4⁺CD8^暗,CD4^暗CD8^亮或CD4^hiCD8^hi)。

因此，T细胞是获得性免疫系统防止和控制微生物，尤其是病毒诱导的 疾病，以及识别和破坏肿瘤细胞的一种重要的保护性机制。

特定的T细胞的活化、极化和调节是藉由APC的严格控制而调控的， 并且实质上由APC的亚型及成熟水平、抗原摄取和呈递的机制、以及相应 免疫原的固有性质所定义。由此，免疫原的剂量和定位，以及免疫调节物质 的浓度，确定是否产生由Th-1、Th-2或Th-17介导的免疫应答，或者是否 诱导耐受。

专职性APC，诸如树突细胞(DC)、单核细胞和巨噬细胞，以及B细胞， 特异性地识别病原体和肿瘤细胞，摄取它们，并将它们的片段与I类及II类 MHC分子一起呈递给T细胞，从而在天然免疫系统和获得性免疫系统之间 的接合点上占据关键位置。此外，皮肤的成纤维细胞、胸腺和甲状腺的上皮 细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞、以及血管内皮细胞可充当非专职性APC。 另外，当前的研究显示T细胞也可以充当APC。这些APC T细胞是由于与 APC，特别是DC(Sokke Umeshappa et al.(2009),J.Virol.182:193-206)接触， MHC I类和II类分子以及共刺激分子如CD80,CD40配体(CD40L),OX40配 体(OX40L)，以及4-1BB配体(4-1BBL,TNFSF9)发生细胞间转移而产生的。

对于APC成功刺激T细胞而言，需要三种独立的信号：藉由T细胞受 体(TCR)特异性识别加载有肽的MHC分子(信号1)、基于APC以及T细胞 的共刺激分子与它们的配体的相互作用(信号2)、以及T细胞极化性细胞因 子，诸如IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-6和TGF-β(信号3)的存在。

细胞外的可溶性蛋白质通常藉由外源性抗原加工途径而被降解，所产生 的肽以与MHC-II分子复合的形式被呈递在APC的表面上。与MHC II类分 子复合的肽被CD4⁺T细胞(T辅助细胞)所识别。

与之对照的是，细胞质蛋白质的降解藉由内源性加工途径来发生，导致 所产生的表位被呈递在MHC I类分子上。这些肽/MHC-I复合物被转运到 APC表面，在那里它们被呈递给细胞毒性T细胞(CTL)。虽然MHC I类分子 上呈递的表位大多数来源于内源蛋白质而与MHC-II分子复合的肽大多来源 于外源蛋白质，这种区别不是绝对的。例如，多种外源存在的免疫原，如微 粒结构、多种病毒颗粒、免疫复合物及脂蛋白，通过抗原呈递的内源加工途 径中的一种称为交叉呈递(cross presentation)的机制而最终出现在MCH I分 子上。

对于幼稚T细胞的特异性活化而言，除了识别加载有肽的MHC分子(信 号1)之外，还需要第二种共刺激信号(信号2)。这是由多种基于APC和T细 胞的共刺激配体与它们的受体相互作用而触发的。TNF/TNF受体超家族以 及免疫球蛋白超家族的成员属于共刺激分子的最重要的代表。在没有共刺激 信号的条件下T细胞变成无反应性。无反应性(anergy)是T细胞不扩增并且 不对抗原起反应的状况。

APC上共刺激信号的表达主要是藉由外源刺激因素，诸如病原体或受 创伤组织的成分，以及细胞因子来控制的。APC的活化和成熟导致促炎症性 以及T细胞极化性细胞因子，以及共刺激分子(CD80、CD86和CD40)的表 达，从而急剧增加APC的活化细胞介导的免疫反应的能力。TCR的特异性 抗原识别以及与共刺激分子的相互作用诱导对病原体和疾病特异性的幼稚 T细胞的靶向性活化和增殖。这伴随着IL-2分泌的增加和CD40配体的表达， 它们在后续的其他特异性T细胞亚群的活化和扩增中起重要作用。Th-1或 Th-2效应物细胞中活化T细胞极化的发生依赖于APC的成熟水平、占优势 地位的细胞因子环境、以及相应抗原的固有性质和剂量。

急性微生物感染过程中特异性T细胞应答的发动通常分三步进行：在 效应期(effctor phase)中，抗原特异性幼稚T细胞通过与加载有抗原的APC 接触而被活化，导致该特异性T细胞的急剧扩增、效应物功能的产生、以及 活化的效应物T细胞在感染部位的浸润。该效应期通常持续1-2周的时间， 直到病原体被消灭。在随后的收缩期(contraction phase)中，该期持续数周， 所产生的效应物T细胞中90%死亡。只有少数抗原特异性T细胞存活并分 化为长期持续存在的记忆T细胞。在记忆期(memory phase)中，这些记忆T 细胞在身体中以相对稳定的细胞数持续存在许多年。这些记忆T细胞在重新 与它们的抗原接触后能够很快重新活化并发挥它们的效应物功能。

为了避免针对机体自身蛋白质和组织的不期望的免疫反应，通过克隆删 除(无反应性)将自身反应性T细胞预先消除或灭活。结果是对机体的自身结 构，如蛋白质、细胞、组织和器官的抗原特异性耐受。在自身免疫病中，这 些保护性机制被抑制或者发育不足。有若干信息提示自身免疫病是藉由天然 的“易感性”(遗传倾向)，结合环境影响诸如微生物感染、妊娠，或者由于 机体的自身结构与病原体和外来组织特异性多肽的相似性，即所谓分子拟态 (molecular mimicry)，而获得的。

除此之外，活化T细胞还在慢性病毒感染以及移植组织和器官的排斥 中起核心作用。

T细胞的表型、频度、特异性、功能性、活化状态是获取关于疾病现有 状态或已经克服的疾病的信息的高效策略。此外，这些方法对于在治疗性或 预防性接种中、以及在慢性炎症、自身免疫病以及在移植排斥中T细胞的数 目和功能性诊断性检测中监控(监测)特异性T细胞应答是非常重要的。

在过去数十年中已经开发出了不同的T细胞检测技术，它们大致可以 分为两类。第一组方法依赖于使用肽-MHC多聚体，诸如四聚体(Beckman Coulter)、五聚体(Proimmune)、和streptameres(IBA)来直接鉴定和定量多肽 特异性T细胞。这种方法容许测定具有已知的MHC限制性的表位特异性T 细胞。用这种方法分析T细胞的功能性是不可能的。这导致使用MHC多聚 体常规监测疾病或病原体特异性T细胞的最重要的限制，因为MHC/肽多聚 体是对表位以及HLA特异性的。因此，在具有不同HLA分型的受试者中对 病原体及疾病特异性T细胞进行全面监测需要使用范围宽泛的一系列不同 的肽/MHC多聚体，导致成本高昂。此外，这些肽/MHC多聚体目前仅对于 有限的一系列MHC分子可用。

另一种用于测定特异性T细胞的方法依赖于使用加载有肽的HLA分 子，其连接于绿色荧光蛋白(GFP)。T细胞受体对这些复合物的表位特异性 识别和结合导致GFP标记的肽的内化，从而使得相应的CTL可视(Tomaru et al.(2003),Nat Med.9:469)。

与之相对的，监测特异性T细胞的“功能性”方法依赖于在离体状态 下用刺激物抗原刺激含有T细胞和APC的患者材料，然后通过多种检测系 统检测特定的再活化T细胞中的成熟过程，诸如增殖、标志物细胞因子的产 生。特异性CD4⁺T细胞的检测通常是通过如下实现的：用长度为15-25个 氨基酸的蛋白质、多肽或肽刺激含有APC或T细胞的患者样品，诸如肝素 化全血或分离的血液外周血单个核细胞(PBMC)；以及通过测定特征性标志 物细胞因子的产生或T细胞增殖来检测特异性T细胞活化。细胞因子检测通 过例如流式细胞术方法，诸如胞内细胞因子染色和细胞因子分泌测定法，以 及ELISpot或ELISA技术来进行。T细胞增殖的测定可以通过例如5'-溴脱 氧尿嘧啶(BrdU)-或羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯(CSFE)增殖测定法来 测定。

相比之下，特异性CD8⁺T细胞(CTL)的检测通常是通过用长度为8-16 个氨基酸的短肽刺激含有APC和T细胞的患者样品来进行的。此外，可以 通过用可在APC细胞内表达T细胞的靶结构的重组病毒或细菌进行感染， 然后通过流式细胞法，诸如胞内细胞因子染色或通过分别使用ELISpot或 ELISA技术，测定由抗原特异性T细胞产生的标志物细胞因子(通常是 INF-γ)，从而特异性地检测CTL。作为替代，可以利用⁵¹铬释放测定法，或 者使用适当的非放射性方法，诸如乳酸脱氢酶细胞毒性测定(例如来自 Clontech者)，来进行CTL的特异性检测。

这些可用的技术容许测定疾病或病原体特异性CD4⁺或CD8⁺记忆T细 胞，但对于检测仅在疾病的活动期中瞬时出现的活化T辅助细胞则不适用或 者适用性非常有限。

CD4⁺T细胞在活动的微生物感染和疾病进展中瞬时活化。这里，瞬时 活化暗示着T细胞仅在确定的、相当短的一段时间内存在。因此，活化的T 辅助细胞是活动疾病事件检测的重要对象。需要尽可能显著的检测测定法来 在诊断活动性感染性疾病和自身免疫病的语境中准确地测定活化T细胞。

然而，对于某些需要区分活化和非活化T细胞的应用，例如急性微生 物感染和再活化中活化T细胞的检测，或者在疑似多发性硬化或1型糖尿病 的病例中对活化的自身攻击性T细胞的检测，基于记忆T细胞的体外再活化 的方法不能使用或者仅能非常有限地使用。

迄今为止可用于检测活化CD4⁺T细胞的方法目前仅显示较低的灵敏 度，因此是不利的。该低灵敏度的原因之一是由于病原体或疾病特异性活化 CD4⁺T细胞是直接被检测的，并且通常在患者材料中仅少量存在。但是， 可用的特异性活化T细胞的数量稀少阻碍了亦可满足诊断需要的可靠而明 晰的检测，因为这些迄今为止可用的方法的检测限经常被压低。

因此，当前可用于检测抗原特异性活化T辅助细胞的方法通常依靠例 如对活化T细胞表面上瞬时表达的蛋白质的流式细胞术测定。属于此类蛋白 质的具体有CD40配体和CD25蛋白。然而，CD40配体很难用流式细胞术 检出，因为抗体的结合会导致CD40配体内化。相比之下，CD25蛋白可能 不仅出现于活化的T辅助细胞上，还出现在调节性T细胞上，因此其对于可 靠地区分这两种T辅助细胞亚群而言是不适合的。此外，HLA-DR与CD69 的表达增强，以及CD27的表达减少也是活化T细胞的标志。这里，对活化 的抗原特异性T细胞的检测要求在特异性重刺激后进行平行标志物检测以 便：确定特异性，例如通过使用特异性四聚体、五聚体或streptamer；表型， 例如通过测定特征性表面标志物，和/或T细胞活化，例如藉由标志细胞因 子的产生。迄今为止已知的方法的另一个劣势是，通过ELISA、ELISpot或 FACS技术是不可能的，原因是标志物蛋白质的膜定位、细胞内囊泡中预形 成的标志物蛋白质的存在，以及可用的抗体与细胞蛋白的高度非特异反应 性。

因此对于这样的方法存在需求，其容许检测、区分和定量细菌、病毒、 寄生物或自身抗原所活化的特异性T细胞群体，从而能够将这些T细胞群体 归属于特定的疾病和疾病阶段。

因此，本发明要解决的问题是提供容许定性、灵敏且定量地检测特异性 T细胞群体的病原体或疾病特异性T细胞的方法。

本发明要解决的另一个问题是提供容许在特异性T细胞(诸如抗原特异 性幼稚T细胞、活化T细胞和记忆T细胞)之间进行区分，作为不同的特异 性T细胞群体的方法。

此外，本发明要解决的另一个问题是提供一种用于实施检测活动病原体 特异性感染和疾病事件的方法的试剂盒，其依靠对活化的病原体或疾病特异 性T细胞的间接检测。

本发明另一个要解决的问题是提供一种用于实施对活动的和潜伏的感 染和疾病事件的鉴别诊断的方法的试剂盒，其依靠对活化的病原体或疾病特 异性T细胞的间接检测以及它们与幼稚T细胞及记忆T细胞的区别。

本发明的问题由权利要求中定义的主题所解决。

下面的附图的目的在于说明本发明。

图1显示了(A)迄今为止使用的依照现有技术的技术的原理和(B)根据本 发明的特异性T细胞检测方法的技术的原理。

图2显示在离体预活化的ESAT-6/CFP-10特异性T细胞与具有潜伏结 核病的血液供体的PBMC的共培养物中具有胞内可检测的4-1BBL蛋白的B 细胞的数目的点图，其中所述共培养物用或者不用ESAT-6/CFP-10融合蛋白 刺激。将体外扩增的预活化的ESAT-6/CFP-10特异性T辅助细胞与自体 PBMC1:1混合，并在存在或不存在10μg/ml ESAT-6/CFP-10的条件下共培 养18h。在最后16h中用布雷菲德菌素A抑制蛋白质分泌。通过流式细胞 术进行B细胞中的细胞内4-1BBL的检测。

图3是显示在加载有ESAT-6/CFP-10的PBMC中，与未加载的PBMC 相比，与自体体外扩增的预活化ESAT-6/CFP-10特异性T辅助细胞共培养后 通过RT-qPCR测定的4-1BBL mRNA的相对增加的图。将具有潜伏结核分枝 杆菌感染的患者的新鲜分离的PBMC与10μg/ml ESAT-6/CFP-10温育12小 时，然后与离体扩增的自体ESAT-6/CFP-10特异性T辅助细胞以1:1的比例 共培养。以ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞与未加载的PBMC的共培养物作 为阴性对照。在标示的时间点收集刺激样品，并通过RT-qPCR测定在特异 性刺激的细胞培养物中相对于未刺激的细胞培养物中4-1BBL mRNA表达的 相对增加。根据2^-ΔΔCq方法分析RT-qPCR数据，其中用GAPDH作为参比 基因，并用未刺激的对照作为校准物。

图4是显示通过RT-qPCR测定的、加载有ESAT-6/CFP-10的PBMC中 相对于未加载的PBMC中4-1BBL mRNA产生的相对增加与抗原特异性的活 化ESAT-6/CFP-10特异性T辅助细胞的数目的关联的图。将具有潜伏结核分 枝杆菌的供体的1x10⁶个新鲜分离的PBMC与递增数目的离体扩增的 ESAT-6/CFP-10特异性T辅助细胞在10μg/ml ESAT-6/CFP-10的存在下一起 培养。以自体PBMC和预活化ESAT-6/CGP-10特异性Th细胞的未刺激共培 养物作为对照。在标示的时间点收集2x10⁵个细胞，并通过RT-qPCR测定 在特异性刺激的细胞中相比于未刺激的细胞4-1BBL mRNA浓度的相对增 加。根据2^-ΔΔCq方法分析RT-qPCR的数据，其中用GAPDH作为参比基因， 并用未刺激的对照作为校准物。

图5：(A)显示：通过RT-qPCR测定的、在加载有和未加载ESAT-6/CFP-10 的PBMC中由于与离体预活化的自体ESAT-6/CFP-10特异性T辅助细胞共 培养4-1BBL mRNA产生的相对增加的图。在存在及不存在10μg/ml ESAT-6/CFP-10的条件下将具有潜伏结核病的供体的1x10⁶个新鲜分离的 PBMC与50000个离体预活化的ESAT-6/CFP-10特异性T辅助细胞共培养。 在标示的时间点移出2×10⁵个细胞，离心沉降，并在液氮中冷冻。通过 RT-qPCR测定在特异性刺激的细胞培养物中相比于未刺激的细胞培养物中 4-1BBL mRNA的相对增加。根据2^-ΔΔCq方法分析RT-qPCR的数据，其中用 GAPDH作为参比基因，并用未刺激的对照作为校准物。(B)显示：通过 RT-qPCR测定的、加载有或未加载ESAT-6/CFP-10的PBMC与离体预活化 的自体ESAT-6/CFP-10特异性T辅助细胞共培养的过程中IFN-γmRNA产 生的相对增加的图。在存在及不存在10μg/ml ESAT-6/CFP-10的条件下将具 有潜伏结核病的供体的1x10⁶个新鲜分离的PBMC与50000个离体预活化 的ESAT-6/CFP-10特异性T辅助细胞共培养。在标示的时间点移出2×10⁵个 细胞，离心沉降，并通过RT-qPCR测定在特异性刺激的细胞培养物中相比 于未刺激的细胞培养物中IFN-γmRNA的相对增加。根据2^-ΔΔCq方法分析 RT-qPCR的数据，其中用GAPDH作为参比基因，并用未刺激的对照作为校 准物。

图6显示通过RT-qPCR技术测定的活化Th细胞对4-1BBL mRNA合成 的诱导的抗原特异性的图。与扩增珠子预活化的非ESAT-6/CFP-10特异性T 细胞比较，预活化的ESAT-6/CFP-10特异性T细胞在用ESAT-6/CFP-10刺激 过的细胞培养物中相对于未刺激的细胞培养物显示显著改善的诱导4-1BBL mRNA产生的能力。在存在和不存在10μg/ml ESAT-6/CFP-10的条件下将 用扩增珠子非特异性活化的以及特异性预活化的ESAT-6/CFP-10特异性Th 细胞与自体PBMC共培养，其中使用不同数目的T细胞和1x10⁶个新鲜分 离的PBMC。在标示的时间点分别移出2x10⁵个细胞，离心沉降，并通过 RT-qPCR定量4-1BBL mRNA的相对量。根据2^-ΔΔCq方法分析RT-qPCR的数 据，其中用GAPDH作为参比基因，并用未刺激的对照作为校准物。

图7显示另一幅通过RT-qPCR技术测定的活化Th细胞对4-1BBL mRNA合成的诱导的抗原特异性的图。预活化的ESAT-6/CFP-10特异性T 细胞仅在经ESAT-6/CFP-10刺激的细胞培养物中、而不在经EBV BZLF1或 CMV pp65蛋白刺激的细胞培养物中诱导4-1BBL mRNA产生的增加的诱导。 将具有顽固性结核分枝杆菌感染的供体的1x10⁶个PBMC与大约70,000个 预活化的ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞在10μg/ml ESAT-6/CFP-10、EBV BZLF1或CMV pp65的存在下共培养。预活化T细胞与PBMC的未经刺激 的共培养物作为另一对照。在每一情况下，在标示的时间点从样品移出2x 10⁵个细胞，并在RT-qPCR中定量4-1BBL mRNA的相对含量。根据2^-ΔΔCq方法分析RT-qPCR的数据，其中使用GAPDH作为参比基因，使用未刺激 的对照作为校准物。

图8显示了通过RT-qPCR技术测定的活化Th细胞中4-1BBL mRNA合 成诱导的抗原特异性的另一幅图。预活化的ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞、 EBV BZLF1特异性Th细胞、和CMV pp65特异性Th细胞仅在用它们分别 的靶抗原刺激过的共培养物中显示增加的4-1BBL mRNA产生诱导。(A)至(C) 显示了通过RT-qPCR测定的，在加载有(A)结核分枝杆菌ESAT-6/CFP-10、 (B)CMV pp65、及(C)EBV BZLV1的PBMC中，CMV pp65、EBV BZLF1、 以及结核分枝杆菌ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞的4-1BBL-mRNA合成的 诱导。在每一情况下，将1x10⁶个/ml的PBMC与大约70,000个离体扩增 的pp65、BZLF1、及ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞在存在(以及不存在，作 为对照)分别10μg/ml的ESAT-6/CFP-10、(B)pp65、或(C)BZLF1的条件下 共培养。在标示的时间点从样品移出2x10⁵个细胞，分离总RNA并转录成 cDNA，并通过RT-qPCR确定4-1BBL mRNA的相对含量。根据2^-ΔΔCq方法 进行分析，使用GAPDH作为参比基因，未刺激的对照作为校准物。

图9显示如下的图：如RT-qPCR测定的，通过使用MHC-I阻断性抗体 (W6/32)本发明的RTT方法的灵敏度增加。将未加载的PBMC或加载有10 μg/ml EBV BZLF1的PBMC与体外预活化的BZLF1-特异性Th细胞在存在 和不存在10μg/ml MHC-I阻断性抗体W6/32的条件下共培养。在标示的时 间点移出2x10⁵个细胞，纯化RNA并使用RT-qPCR技术分析。根据2^-ΔΔCq方法分析RT-qPCR的数据，其中使用GAPDH作为参比基因。

图10在(A)至(E)中显示了如下的图：与(B)具有潜伏结核分枝杆菌感染 的供体、(C)具有经过治疗的TB感染的供体、以及(A)健康供体相比，(D)具 有活动结核病的供体展现在经过特异性刺激的PBMC中相比于未刺激的 PBMC的4-1BBL mRNA产生的相对诱导的可测量的增加。从(A)三名未感 染结核分枝杆菌的健康供体(p012,p010,p008)、(B)三名具有潜伏结核感染的 健康供体(p009,p006,p005)，(C)三名在检查之前最近6个月内由于活动结核 病而经过药物治疗的供体(p013,p014,p003)，以及(D)三名在病因性治疗开始 之前或刚开始之后具有活动结核病的供体(p001,p004,p007)的新鲜分离的肝 素化全血分离PBMC，并在有或无10μg/ml ESAT-6/CFP-10存在的条件下温 育。(E)作为对照，对选定的供体HIV血清阴性供体的PBMC用10μg/ml HIV p24壳体蛋白(p005,p008,p007,p006,p003)或牛血清白蛋白(p001)进行刺激。 在标示的时间点收集细胞，并通过RT-qPCR测定经刺激和未经刺激的细胞 中4-1BBL的表达。结果用2^-ΔΔCq方法分析。使用GAPDH作为参比基因。

图11在(A)至(C)中显示了如下的图：结核菌素PPD刺激的(A)具有活动 结核病的供体的PBMC，与(B)具有潜伏结核分枝杆菌感染的供体的PBMC 或(C)健康供体的PBMC相比，显示特异性刺激的PBMC中与未刺激的 PBMC相比的4-1BB mRNA产生的相对诱导增加。将(A)具有活动TB的供 体、(B)具有潜伏TB的供体、以及(C)未感染结核分枝杆菌的供体的1x10⁶个新鲜分离的PBMC/ml分别用10μg/ml ESAT-6/CFP-10或结核菌素PPD刺 激，或者作为阳性对照用1μg/ml PMA/伊屋诺霉素刺激。在标示的时间点移 出0.5x10⁶个细胞并保存在-80℃。从细胞分离总RNA并转录成cDNA，并 用RT-qPCR定量4-1BBL mRNA的含量。分析根据2^-ΔΔCq方法进行，使用 GAPDH作为参比基因，用未刺激的对照作为校准物。

图12在(A)和(B)中显示了如下的图：通过RT-qPCR测定的、在健康志 愿者的PBMC中，在(A)中用1μg/ml PMA/伊屋诺霉素，或(B)中用 PGE2/α-CD40刺激后，与未刺激对照相比4-1BBL mRNA产生的非特异性诱 导。将健康志愿者的新鲜分离的PBMC分别与1μg/ml PMA/伊屋诺霉素(A) 或5μg/mL PGE2与2μg/mLα-CD40(B)温育。在标示的时间点移出0.5x10⁶个细胞，离心沉降，并保存在-80℃直至进一步使用。从细胞分离总RNA并 转录成cDNA。然后在RT-qPCR中测定4-1BBL cDNA的量。分析根据2^-ΔΔCq方法进行，使用GAPDH作为参比基因，用未刺激的对照作为校准物。

图13显示了如下的图：不同的参比基因对通过RT-qPCR测量的经过 ESAT-6/CFP-10刺激的共培养物中相对于未经刺激的共培养物4-1BBL mRNA产生的测得的相对增加的影响；其中所述共培养物是ESAT-6/CFP-10 特异性活化T细胞与具有顽固结核病的供体的自体PBMC的共培养物。将 具有顽固结核病的供体的新鲜分离的PBMC与预活化的ESAT-6/CFP-10特 异性Th细胞在存在或不存在10μg/ml ESAT-6/CFP-10蛋白质的条件下温育。 在标示的时间点移出0.5x10⁶个细胞，离心沉降并保存在-80℃直到进一步 使用。从细胞分离总RNA并转录成cDNA。然后通过RT-qPCR测定4-1BBL cDNA的含量。分析根据2^-ΔΔCq方法进行，使用GAPDH、huP0和PBGD作 为参比基因，用未刺激的对照作为校准物。

图14显示用于鉴定对RTT方法合适的参比基因的实时PCR的扩增图。 在y轴上，对于一个样品一式三份地示例性展示了7种潜在的参比基因在4 种刺激条件下(未刺激、结核菌素(PPD)、ESAT6/CFP10、PMA/伊屋诺霉素) 的定量循环(Cq)。放大的部分显示12个数据点中每一个的刺激条件的序列。 在x轴上标示了在96孔板上的平板位置。18S：真核18S核糖体RNA;ALAS： 氨基乙酰丙酸，delta-，合酶1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；GUSB： 葡糖醛酸糖苷酶，beta；HMBS：羟甲基胆色烷合酶；HPRT1：次黄嘌呤磷 酸核糖转移酶1；Iono：伊屋诺霉素；PMA：佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸 酯；PPD：结核菌素PPD；RPLP0：核糖体蛋白质，大，P0；TAF1A:TATA 盒结合蛋白(TBP)-相关因子，RNA聚合酶I,A,48kDa；unstim：未刺激的。

图15显示在活动感染或潜伏感染的TB患者、以及接种了BCG的健康 志愿者或未接种BCG的健康志愿者的样品中在用结核菌素PPD刺激之后与 相应的未刺激样品相比，RTT标志物基因4-1BBL(又称TNFSF9)相对表达 的增加。数值相对于参比基因TAF1A(2^-ΔΔCq)标准化。每份样品5x10⁶个 PBMC在B细胞培养基中用10μg/ml结核菌素PPD刺激。活动：具有活动 结核病的患者；潜伏：具有潜伏结核病的患者；BCG：卡介苗，抗结核病减 毒活疫苗。

图16显示了不同细胞培养基对在用结核菌素PPD刺激之后与未刺激的 样品相比在具有潜伏TB的患者及健康志愿者的PBMC中IFN-γ(又称IFNG) 的表达信号的相对增加(针对TAF1A标准化)的影响。使用了B细胞培养基 (BZM+)、无IL-4的B细胞培养基(BZM-)、无血清UltraCULTURE^TM培养基 (Ultra)(LONZA)，以及的AIM V培养基(AIMV)(Invitrogen)。

图17显示了不同的细胞培养基对在用结核菌素PPD刺激之后与未刺激 的样品相比在具有潜伏TB的患者以及健康志愿者的PBMC中4-1BBL(又称 TNFSF9)的表达信号的相对增加(针对TAF1A标准化)的影响。使用了B细胞 培养基(BZM+)、无IL-4的B细胞培养基(BZM-)、无血清UltraCULTURE^TM培 养基(Ultra)(LONZA)，以及AIM V培养基(AIMV)(Invitrogen)。

图18显示了在三重(triplex)qPCR样品(左)中，与相应的二重(duplex)反 应(右)相比，对TNFSF9和IFNG表达的相对增加进行同时检测的结果(针对 作为参比基因的TAF1A标准化)。Unst.：未刺激的；PPD：结核菌素PPD； PMA:佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯/伊屋诺霉素。

图19显示在健康志愿者和具有潜伏TB的患者的样品中用结核菌素 PPC刺激之后与相应的未刺激样品相比基因FCGR1ABC,CXCL9,CXCL10, CXCL11的表达的相对增加。实时qPCR使用SYBR绿系统进行。各基因和 个体分别作图在x轴上。y轴显示表达(2^ΔCq)的相对增加。BCG：卡介苗，抗 结核病减毒活疫苗，CXCL9至11：趋化因子(C-X-C基序)配体9至11； FCGR1ABC：Fcγ受体1A,B,C。

在本发明的语境下，“T细胞群体”理解为具有特定表型的T细胞的确 定集团。

依据本发明的T细胞群体尤其是幼稚T细胞、活化T细胞、以及记忆T 细胞。

在本发明的语境中术语“T细胞”理解为指T淋巴细胞，诸如分别指 CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞、或CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的混合物。这里， CD4⁺T细胞类群涵盖T辅助细胞，诸如T辅助1(Th-1)细胞、T辅助2(Th-2) 细胞、T辅助17(Th-17)细胞、CD4⁺CD25⁺调节性T细胞(Treg),、Tr1细胞和 T辅助3(Th-3)细胞。CD8⁺T细胞类群包括CD4^-CD8⁺细胞毒性T细胞和显 示CD4⁺CD8⁺表型的T细胞(CD4⁺CD8^暗,CD4^暗CD8^亮或CD4^hiCD8^hi).

在本发明的语境中，“幼稚T细胞”(T cell)理解为这样的T细胞， 其展现特定抗原特异性，但尚未首次接触其抗原。幼稚T细胞，如CD4⁺T 细胞，在其表面上展现例如CD45RA作为其标志物。

在本发明的语境中，“活化T细胞”理解为这样的T细胞，其在首次抗 原攻击之前的幼稚状态的基础上藉由通过T细胞受体的首次抗原接触而被 刺激。T细胞受体识别MHC分子上呈递的肽，导致所谓的T细胞受体交联 (Crosslinking)。T细胞活化的另一个先决条件是第二种信号，该信号由共刺 激分子与它们在APC上以及T细胞上的配体之间的相互作用所介导。这种 活化导致T细胞内部的信号级联，最终导致增殖以及各种效应物功能的发 生。此外，活化的T细胞以瞬时表达CD40配体、4-1BB、CD69和/或CD25 等特征性表面分子为特征。幼稚T细胞在与专职性抗原呈递细胞表面上的抗 原初次接触后向活化T细胞的活化又被称为“初始化”(priming)。术语“活 化T细胞”与术语“效应物T细胞”同义，还包括通过与其抗原重新接触而 在体内被特异性再活化的记忆T细胞。

在本发明的语境中，“记忆T细胞”理解为这样的T细胞，其已经有过 特异性抗原接触。记忆T细胞以特殊的表面标记物如CD45RO、CD44和L- 选择蛋白为特征。

在本发明的语境中，术语“抗原呈递细胞”(APC)理解为指能够摄取多 肽，对它们进行加工，并将所述多肽的片段(所谓的表位)与MHC I和MHC II 蛋白组合呈递给免疫系统。术语“抗原呈递细胞”尤其包含所谓的专职抗原 呈递细胞，诸如树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、非专职APC，诸如B细 胞，还有血管内皮细胞、皮肤的成纤维细胞、胸腺或者甲状腺的上皮细胞， 脑的神经胶质细胞、胰腺的β细胞，以及血管内皮细胞。非专职性APC只 有在被细胞因子如IFN-γ活化之后才表达与T细胞相互作用所必需的I类和 II类MHC分子。此外，T细胞也可充当APC。这些APC T细胞是由于与 APC，尤其是树突细胞(DC)接触，MHC I类和II类分子以及共刺激分子例 如CD80,CD40配体(CD40L),OX40配体(OX40L)和4-1BB配体(4-1BBL, TNFSF9)发生细胞内转移而产生的。

在本发明的语境下，“APC的标志物”和“T细胞的标志物”分别理解 为RNA或DNA，或者核酸片段。此外，“APC的标志物”和“T细胞的标 志物”分别还理解为肽、寡肽、或蛋白质。根据本发明，考虑活化的T细胞 特异性识别APC上与MHC分子形成复合物的抗原后，APC中标志物的表 达可检测地增加或减少。因此，根据本发明，考虑APC的标志物被活化T 细胞的抗原特异性相互作用所诱导，并变得能够被检测和定量。

在本发明的语境中，标志物的“诱导”理解为该标志物的表达的变化。 当标志物是核酸时，“诱导”根据本发明理解为例如基因的mRNA的产生增 加或减少。此外，“诱导”根据本发明理解为基因的调节，例如通过甲基化 的调节。此外，在本发明的语境中“被诱导”理解为蛋白质的表达增加或减 少。此处，蛋白质的表达可以发生在细胞上以及细胞中，即胞内。

在本发明的语境中“抗原”特别理解为蛋白质、多肽或肽。抗原尤其是 这样的多肽序列，其被APC摄取、加工，且其片段(即所谓的表位)，在MHC 分子上被呈递给T细胞。抗原尤其还是这样的肽，其与MHC一起被呈递给 T细胞。此外，抗原理解为编码多肽的表达质粒、DNA、或RNA。

如本文所用的术语“表达质粒”或“表达载体”是指人工创建的用于在 细胞中导入并表达核酸的构建体。表达载体为例如细菌质粒和MIDGES，源 自病毒的质粒，噬菌粒、粘粒、细菌噬菌体、或人工产生的核酸诸如人工染 色体。载体还可以还有一种或多种选择标记。

在本发明的语境中术语“多肽”理解为氨基酸的任何长度的聚合物。短 语“多肽”还包括下列术语：靶表位、表位、肽、寡肽、蛋白质、多聚蛋白 质、以及多肽的聚集物。此外，表述“多肽”还涵盖这样的多肽，其展现翻 译后修饰诸如糖基化、乙酰化、磷酸化、氨基乙酰化、以及类似的修饰。此 外，表达“多肽”理解为还指这样的多肽，其展示一种或多种氨基酸类似物， 例如非天然氨基酸；具有替代的键连以及其他本领域已知的修饰的多肽，无 论其是否为天然存在的或来自非天然来源的。

如本文所用的术语“表位”指多肽的一部分，其展现抗原性性质，并且 例如充当T细胞或免疫球蛋白的识别位点。根据本发明，表位是例如多肽的 被免疫细胞识别的那些部分，所述的免疫细胞诸如例如CD4⁺T辅助细胞、 CD8⁺细胞毒性T细胞、CD4⁺CD8^暗细胞毒性T细胞、CD56⁺CD8⁺以及 CD56^-CD57⁺CD8⁺NKT细胞或CD4⁺CD25⁺调节性T细胞。表位可包含3个或 更多个氨基酸。通常，表位由至少5-7个氨基酸组成，或者，更常见的是， 由8-11个氨基酸组成，或由多于11个氨基酸组成，或由多于20个氨基酸 组成，较少见的是甚至由多于30个氨基酸组成。

在本发明的语境中“逆转录定量实时聚合酶链式反应，RT-qPCR”理解 为这样的方法，其基于常规的聚合酶链式反应(PCR)。此外，RT-qPCR除了 允许扩增之外，还允许对靶mRNA的定量。为此目的，从与抗原温育过的 要检查的材料分离总RNA，并且作为比较从未经刺激的材料或者与无关的 抗原温育的材料分离总RNA，然后在后续的逆转录反应中将总RNA转录成 cDNA。然后在qPCR中通过使用特异性引物将靶序列扩增。对于靶序列的 定量可以使用数种方法。

最简单的定量方法是使用插层荧光染料，例如SYBR绿或EVA绿。这 些染料自行插入到特定产物的延伸过程中产生的双链DNA分子中。检测总 是在延伸结束时通过检测荧光染料激发后的发射光来进行。随着PCR产物 量的增加更多的染料被掺入，从而荧光信号增加。

定量的另一种可能性是使用序列特异性探针。有水解(TaqMan)或杂交 (Light-Cycler)探针。水解探针在5’末端标记有荧光染料，在3’末端标记有所 谓的淬灭物。由于在空间上与报道染料接近，淬灭物导致荧光信号的淬灭， 并且在延伸期中在互补DNA的合成过程中被切去。一旦在延伸结束时用光 源激发荧光染料，则释放特定波长的光，该光可以被检测。

杂交探针系统由两个探针组成，这两个探针彼此相邻地结合靶序列。两 个探针均用荧光染料标记。用光源激发第一探针的5’末端的第一荧光染料。 然后发出的光通过荧光共振能量转移(FRET)被转移给第二探针的3’末端的 第二荧光染料。由此染料被激发，从而发射出特定波长的光，该光可以被检 测。如果在靶序列的互补链的延伸过程中第一探针被聚合酶所降解，FRET 不再会发生，然后荧光信号减少。与前述的方法相对照的是，这里定量总是 发生在延伸过程的开始。

经常使用的荧光染料是例如Fluophor1,Fluorphor2,氨基香豆素,氟化 荧光素,Cy3,Cy5,铕,铽,BODIPY,丹磺酰,萘(naphtalene),钌,四甲基罗 丹明,6-羧基荧光素(6-FAM),VIC,YAK,罗丹明和德克萨斯红(Texas Red)。 经常使用的淬灭物为例如TAMRA^TM,6-羧基四甲基罗丹明，甲基红，或黑暗 淬灭剂(dark quencher)。

术语“实时”是指在PCR的每个循环中，即在“实时”中的具体测量。 所谓的靶序列的增加在此与荧光在循环与循环之间的增加相关。在一次运行 (通常由数个循环组成)结束时，然后在PCR的指数期基于所得的荧光信号进 行定量。这里，扩增的测量通常通过Cq(定量循环)值来完成，Cq值描述荧 光第一次上升到显著高于背景荧光的循环。一方面测定靶核酸的Cq值，一 方面测定参比核酸的Cq值。这样就可能确定靶序列的绝对或相对拷贝数。

在本发明的语境中，表达参比基因可以理解为mRNA水平上，以及基 因组DNA水平上的序列。这些也可以是在依照本发明的刺激条件下非转录 活性的，或者它们对应于基因组的非编码DNA区域。根据本发明，参比基 因也可以是添加到靶基因样品的DNA或RNA。参比基因的最高标准是其在 刺激过程中不被改变，也不被本发明方法的条件改变。因此可以将实验结果 相对于不同样品中使用的模板的量进行标准化。因此参比基因容许确定靶基 因的相对表达。参比基因的实例有甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、huP0(人 酸性蛋白0)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、β-肌动蛋白、或微管蛋白。

在本发明的一个目的中设想提供一种检测、区分和定量T细胞群体的 方法，包括下述步骤：a)使第一等份的个体体液与至少一种抗原接触，其中 所述体液含有抗原呈递细胞(APC)和T细胞，b)将所述第一等份与所述至少 一种抗原温育一段确定的时间，c)通过利用逆转录定量实时聚合酶链式反应 (RT-qPCR)检测所述第一等份中以及未与所述至少一种抗原温育过的第二等 份的个体体液中由特定T细胞群体中的T细胞诱导的至少第一种APC标志 物来检测和区分T细胞群体，和d)通过确定检测到的第一等份的APC标志 物与第二等份的比例来检测和定量T细胞群体。

根据本发明，因此设想对特定T细胞群体的T细胞的检测、区分和定 量是通过利用RT-qPCR来检测和相对定量未经刺激的和/或未经特异性刺激 的以及经特异性刺激的细胞培养物样品的至少一种APC标志物而实施的。 本发明的方法设想，检测和定量之所以可能，特别是因为活化的T细胞通过 反馈机制而对抗原呈递细胞(APC)的成熟起贡献。在本发明的语境中，这种 反馈机制也成为逆向T细胞技术(reverse T cell technology(RTT))。由此，抗 原特异性的活化T细胞，尤其是T辅助细胞，通过藉由TCR识别加载有肽 的MHC分子且同时T细胞与APC进一步相互作用的介导，诱导例如(但不 限于)下述的活化：多种作为APC标志物的基因的启动子，mRNA分子的增 加的产生，以及这些标志物蛋白质的增加的表达。由于这些成熟过程，APC 获得增加的刺激病原体特异性或疾病特异性细胞毒性T细胞以及低亲和力T 辅助细胞的能力。

因此根据本发明考虑特异性T细胞群体的T细胞，诸如活化T细胞的 检测可以通过藉由APC标志物的间接检测来进行。不拘于任何理论，根据 本发明考虑，由于APC与抗原的温育，APC在其表面上将该抗原的片段与 MHC II类或I类分子一起呈递给活化T细胞。由此发生活化T细胞对呈递 有抗原的APC的结合。由于这种特异性的T细胞-APC相互作用，APC受 到特异性刺激。作为这种特异性刺激的结果，APC中发生标志物的诱导。通 过逆转录定量PCR(RT-qPCR)测定经过特异性刺激的APC中的标志物，容 许对以特异性T细胞群体形式存在的活化T细胞的检测、区分和定量。

本发明的方法容许对特异性T细胞群体的T细胞的(诸如幼稚T细胞、 活化T细胞或记忆T细胞)的灵敏、可靠的检测。该方法的灵敏度尤其是由 于这样的事实，即T细胞在APC中诱发以多数mRNA拷贝等形式存在的标 志物的刺激。此外，有讨论称有可能更大数目的APC被T细胞刺激，从而 T细胞从一个APC“跳跃”到另一个。总的说来这导致信号增强，从而增强 本发明方法的灵敏度。

因此本发明的方法使得特异性T细胞群体的检测和区分成为可能，并 从而尤其容许将活化T细胞与记忆T细胞区别。

在本发明的一个优选的实施方案中，所收集的实时PCR数据的标准化 使用固定的参比值来进行，该参比值不受实验条件的影响，以实现精确的基 因表达定量。为此目的，还测量参比基因的表达以便实施数量的相对比较。

根据本发明，设想为了测定APC的标志物，提供第一等份和第二等份 的个体体液。在本发明的语境中，“提供”理解为暗示某一等份的体液已经 存在于容器中。根据本发明，“提供”也可以意味着等份的体液是从患者直 接提供的，例如通过采取血样。本发明的方法设想用至少一种抗原刺激所述 第一等份，而第二等份保持为未刺激的。因此总的来说，设想第一等份和第 二等份除了与抗原接触之外是相同的。因此，所述第二未刺激的等份充当某 种校准物。定量因此相对于校准物进行。对于标志物的测定和定量，设想用 第一经刺激的等份中的标志物的量除以第二未刺激的等份中的标志物的量。 因此检出第一刺激等份中的标志物的量相对于校准物(即第二未刺激的等份) 的n-倍差异。本发明的方法是完全在离体状态下实施的方法。

本发明的方法相对于已知可用方法的优势之处是容许以更高的灵敏度、 速度、以及实验过程的可靠性来检测活化的T辅助细胞。此外，本发明的方 法尤其容许区别以及鉴别测定活化的T细胞与记忆T细胞。

在活动的微生物感染期间，并且特别是在自身免疫疾病和肿瘤疾病的过 程中可靠地检测活化T细胞的显著困难之一是由于循环中存在的疾病和病 原体特异性活化T细胞的数目非常低。T细胞通过在淋巴器官中与加载有抗 原的APC接触而被活化，增殖并然后通过血液或淋巴迁移到感染或疾病的 部位，它们通常留在该部位并发挥它们的效应物功能。

本发明基于T细胞可诱导性组分的检测；T细胞可诱导性组分诸如这样 的RNA分子或蛋白质：在与活化T细胞的抗原特异性接触后它们在APC中 的产生发生可测量的调节，即增加、减少或调整。

APC或含APC的培养物中T细胞诱导的成熟过程的测定通过先前已知 的方法进行，使用多种蛋白检测方法，如FACS、ELISpot或ELISA检测用 表达载体特异性刺激过的细胞培养物中以蛋白质的形式存在的标志物。然而 发现这些方法对于诊断应用中对活化T细胞的可靠检测而言适用性有限或 者不适用。

已知T细胞可诱导性标志物分子在许多不同疾病和微生物感染中在不 同的细胞群体中表达，因此，要检查的受试者或患者个体展现有时差异强烈、 并且在某种程度上说已经非常高的这些标志物蛋白的基础表达水平。此外， APC经常已经含有较大量的预先形成的，即已经表达的标志物分子，它们的 存在与活化T辅助细胞的抗原特异性刺激无关。此外，活化的T辅助细胞通 常仅分别刺激一个(one)或少数个APC，其中在细胞水平上仅能实现有限的 灵敏度增加。由于这些已知的情况，迄今为止人们推测，通过在蛋白质水平 上检测活化T细胞所刺激的APC中的特异性标志物来可靠地测定活化T细 胞是不可能在诊断上可靠的规模上实现的。

令人惊讶的是，可显示本发明的方法能够通过测定例如作为APC中的 标志物的mRNA分子的T细胞诱导的产生来实施。由于前述的关于特定标 志物分子的差异表达的困难，本发明的在RNA水平上对APC的标志物的检 测容许对抗原特异性活化T细胞的可靠且灵敏的测定必须视为是预料不到 的。例如，活化T细胞与APC的接触诱导非常高量的mRNA分子的产生， 这导致标志物的强烈扩增，从而导致本发明的方法的灵敏度显著增加。

然而，迄今为止对于使用APC中的T细胞可诱导标志物，例如mRNA 分子的产生，作为手段来检测活化的抗原特异性T细胞作为活动疾病事件的 标志存在根本性的技术偏见。这些技术偏见特别是基于这样的事实，即APC 中的特异性标志物在个体之间显示波动性非常大的基础表达。然而，为了确 定对于有意义的测试结果而言可靠的阈值水平，对这些波动进行补偿是必不 可少的。

这些技术偏见在本发明的方法中得以克服，尤其是通过下述手段：通过 检测用至少一种抗原刺激的第一等份的个体体液和未经刺激的第二等份的 个体体液中的APC标志物，并确定所述第一等份相对第二等份的比例，检 测标志物表达的相对增加。

在本发明的一个优选的实施方案中设想一种方法，其中在步骤c)中额外 地在所述第一和第二等份中检测至少第二种标志物，其中所述第二种标志物 是T细胞本身的被诱导的标志物，并且步骤d)包括通过确定所述第一等份中 检测到的所述第一种APC标志物及第二种T细胞标志物相对于第二等份的 比来检测和定量T细胞群体。

根据本发明，设想对于这种方法，将幼稚T细胞、活化T细胞和记忆T 细胞区分为个别的T细胞群体成为可能。由此本发明提供了在特定的疾病中 进行鉴别诊断的可能性。例如，对于结核性疾病，有可能通过这种鉴别诊断 将具有活动的疾病并同时需要治疗的患者、具有潜伏感染而无特别的治疗需 要的患者、以及健康个体区分开来。这种鉴别诊断通过检测第一种和第二种 标志物而得以实现。这里，第一种标志物是APC的T细胞诱导的标志物。 这种标志物只有在活动的疾病事件过程中才被诱导。第二种标志物是T细胞 自身的标志物。该第二种标志物是在方法样品中的活化和记忆T细胞的存在 下形成的。

在本发明的又一个优选的实施方案中设想一种方法，其中所述方法在步 骤a)中进一步包含步骤a’)使所述第二等份接触至少一种抗原，并且在步骤 b)中还包含步骤b’)将所述第二等份与抗原温育一段确定的时间，其中步骤b’) 中的这段时间与步骤b)中的这段时间不同；此外，包含步骤c’)通过RT-qPCR 检测第一和第二等份中的第一种标志物来检测和区分T细胞群体，以取代步 骤c)；以及步骤d)。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，设想步骤b’)中温育的时间段 是0分钟。在本发明的另一个特别优选的实施方案中所述时间段是0至60 分钟，更优选0至45分钟，更优选0至30分钟，更优选0至20分钟，更 优选0至15分钟，更优选0至10分钟，特别优选0至5分钟。根据本发明， 设想所述第二等份与抗原接触的时间段与所述第一等份的温育的时间段相 比显著更短，乃至所谓的“零样品”，即持续时间为0分钟。因此，设想在 所述第二等份的温育期间内尚未有标志物形成，或者到那时为止只有非常低 量的标志物存在。根据本发明尤其设想步骤b’)中的时间显著短于步骤b)中 的时间。由此，根据本发明，步骤b’)中第二等份与抗原的温育仅在数秒乃 至持续0分钟的时间段的范围内发生，或者至少发生的时间不长。

在本发明的另一个优选的实施方案中，设想所述第二等份在步骤a’)中 与无关抗原接触，并在步骤b’)中与无关抗原温育。根据本发明，无关抗原 理解为这样的抗原：个体不具有针对该抗原的活化或记忆T细胞。这样的无 关抗原可以是例如白蛋白或者HIV血清阴性人体中的HIV蛋白。

在本发明的一个优选的实施方案中设想一种方法，其中步骤c’)包括通 过检测所述第一种标志物和第二种标志物来检测和区分T细胞群体。

在本发明的另一个优选的实施方案中设想一种方法，其中将所述体液的 等份分离成仅含APC的等份A和含有T细胞的等份B，且其中步骤a)包括 步骤a1)使等份A接触至少一种抗原，以及后续的步骤a2)使接触过所述至 少一种抗原的所述等份A接触等份B。

根据本发明，考虑在添加T细胞之前首先用抗原加载APC。根据本发 明优选设想含有T细胞的等份B还含有未加载的APC，即未有在先抗原接 触的APC。

根据本发明，设想T细胞群体含有幼稚T细胞、活化T细胞或记忆T 细胞。

在本发明的一个优选的实施方案中，设想T细胞群体的T细胞是CD4⁺T细胞，尤其是Th-1细胞，Th-2细胞，Th-17细胞，CD4⁺CD25⁺调节性T 细胞,Th-3细胞，CD8⁺T细胞，尤其是CD4^-CD8⁺细胞毒性T细胞,CD4⁺CD8⁺T细胞，CD161⁺NKT细胞和/或多种T细胞的混合物。

根据本发明还优选设想所述体液是血液，脑脊液，淋巴、心包液、支气 管灌洗液、骨髓抽吸物、淋巴组织悬液或纯化的PBMC群体。

在本发明的语境中，“淋巴组织”理解为淋巴结、脾、扁桃体、以及胃 肠道粘膜的淋巴组织，例如派伊尔氏淋巴结，呼吸器官以及尿道的淋巴组织。

在本发明的另一个优选的实施方案中，设想所述体液还包含另一分别的 (separated)APC群体。此外，根据本发明，优选以所谓的棕黄层作为体液。

在本发明的另一个优选的实施方案中，设想所述抗原是肽、寡肽、多肽、 蛋白质、RNA或DNA。

在另一个优选的实施方案中，所述抗原是表达质粒。

根据本发明，还优选抗原是寡肽、多肽、蛋白质、RNA或DNA的片段、 切割产物或碎片。

根据本发明，设想抗体优选为来自细菌、病毒、植物、动物、真菌或寄 生物的抗原。

在本发明的另一个优选的实施方案中，设想抗原是下述的多肽：巨细胞 病毒(CMV)、埃巴二氏病毒(EBV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、细小病毒B19、水痘带状疱疹病毒(VZV)、 痘苗病毒、腺病毒、JC-和BK-病毒、甲、乙、丙型流感病毒、结核分枝杆 菌、疏螺旋体属、弓形虫(Toxoplasma gondii)或曲霉(aspergilli)、或肿瘤或自 身抗原。

根据本发明，抗原优选是来自具有对人致病的性质的病毒的抗原。下面 给出了此类抗原的依照本发明的实例。该列表在本发明的语境中不应视为限 制性的，而应该仅视为实例。脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、肠 病毒、鼻病毒、正粘病毒，尤其是甲、乙、丙型流感病毒，副粘病毒，尤其 是副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒(RS-病毒)，冠状 病毒属，黄病毒，尤其是黄热病病毒、登革热病毒、日本乙型脑炎病毒、蜱 传脑炎(TBE)病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、披膜病毒类，尤其是α-病毒和风 疹病毒、布尼亚病毒类，尤其是布尼亚病毒、汉坦病毒、尼罗河病毒、白蛉 病毒属、和番茄斑萎病毒属，generaviruses,风疹病毒、狂犬病毒、沙粒病 毒，尤其是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)和拉沙热病毒、胃肠炎病 毒，尤其是轮状病毒、腺病毒、嵌杯样病毒属、星状病毒、冠状病毒属、逆 转录病毒，尤其是甲型、乙型、丙型和丁型逆转录病毒，慢病毒，尤其是人 免疫缺陷病毒1型(HIV-1)和2型(HIV-2)，猿免疫缺陷病毒(SIV),猫免疫缺 陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV),泡沫病毒、人T细胞白血病病毒1型 (HTLV-1)和2型(HTLV-2)、细小病毒，尤其是细小病毒B19和腺伴随病毒 (AAV)，乳多空病毒，尤其是乳头瘤病毒属、进行性多灶性白质脑病(PML) 的病毒，BK-病毒，腺病毒，疱疹病毒，尤其是单纯疱疹病毒1型(HSV-1) 和-2型(HSV-2)，水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)和埃巴二氏 病毒(EBV)，人类疱疹病毒6、7和8(HHV6、7和8)，肝炎病毒，尤其是 甲型肝炎病毒(HAV)，乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，丁型肝 炎病毒(HDV)，戊型肝炎病毒(HEV)，和庚型肝炎病毒(HGV)，以及输血转 染的病毒(TTV)和痘病毒，尤其是正痘病毒属，诸如人痘病毒，痘苗病毒， 牛痘病毒，和副痘病毒。此外，多肽可以源自少见病、亚急性病或慢性病的 病毒病原体，尤其是马尔堡病毒和埃博拉病毒，以及博尔纳病毒属。

根据本发明，所述抗原特别优选是人免疫缺陷病毒(HIV)的多肽，例如 gp120,gp160,p17,p24,Pr55^gag,聚合酶(Pol),逆转录酶(RT)和nef。

此外，根据本发明所述抗原特别优选为埃巴二氏病毒(EBV)的多肽，诸 如EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B(EBNA4)、EBNA3C(EBNA-6) BZLF1、BMLF1、BMRF1、BHRF1、BARF0、BRLF1、BI’LF4、gp85、gp110、 gp220/350、VCA p150、EBNA-LB、LMP1和LMP2(例如编集于Khanna et al. (2000)、Annu.Rev、Microbiol.54:19-48中)。

此外，根据本发明所述抗原特别优选为巨细胞病毒(CMV)的多肽，诸如 UL123(IE1)、UL122(IE-2)、UL83(pp65)、UL82、HL99、UL28、UL33、 UL37、US3、UL94、UL16、UL55(gB)、UL85、UL25、US18、UL45和UL32 (pp150)(例如编集于Crough et al.(2009)Clin Microbiol Rev.22:76-98中的)。

此外，根据本发明，所述抗原特别优选为水痘带状疱疹病毒(VZV)的多 肽，诸如ORF1,ORF4,ORF10,ORF14,ORF29,ORF62和ORF68(gE)。

此外，根据本发明，所述抗原特别优选为乙肝病毒的多肽，诸如HBsAg 和HBcAg。

此外，根据本发明，所述抗原特别优选为腺病毒的多肽，诸如AdV5六 位体蛋白质。

此外，根据本发明，所述抗原优选为如下表所列的对动物致病的抗原。 该列表在本发明的语境中不应视为限制性的，而应视为仅为示例。马麻疹病 毒(EMP),小RNA病毒，尤其是肠病毒，口疮病毒及口蹄疫(FMD)的病原体， 水泡性口炎病毒，副粘病毒，尤其是麻疹病毒，禽副粘病毒，痘病毒，尤其 是山羊痘病毒属，布尼亚病毒，呼肠孤病毒，尤其是环状病毒属，黄病毒， 尤其是瘟病毒(pestiviruses)，正粘病毒，尤其是甲型流感病毒，疱疹病毒， 尤其是α疱疹病毒，狂犬病毒，逆转录病毒，尤其是慢病毒和C型逆转录病 毒，披膜病毒类，弹状病毒,双RNA病毒，冠状病毒，和嵌杯样病毒属。

例如，国际病毒分类学委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses(ICTV))编集上当前描述的病毒的综合列表，该列表可以通过互联 网访问(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Un def&name=Viruses&lfl=3&srchmode=1&keep=1&unlock)。

此外，根据本发明，所述抗原优选是细菌的抗原。根据本发明，特别优 选的是人致病性细菌的抗原。下面列出了依照本发明的此类细菌的例子。该 列表在本发明的语境中不应视为限制性的，而应视为仅为示例。葡萄球菌属、 链球菌属、肠球菌属、奈瑟氏菌属、肠杆菌科，尤其是大肠杆菌(E.coli)， 包括对婴儿致病的大肠杆菌菌株(EPEC),肠聚集性大肠杆菌菌株(EAggEC)， 克雷伯氏菌属，肠杆菌属，沙雷氏菌属，变形杆菌属，柠檬酸杆菌属和伤寒 沙门氏菌(typhoid Salmonella)、肠炎沙门氏菌(Enteritis Salmonella)、志贺氏 菌属，耶尔森氏菌属，弧菌属，尤其是霍乱弧菌和爱尔托弧菌(Vibrio ElTor)， 假单胞菌属，伯克霍尔德氏菌属，Stenotrophomas，不动杆菌属，弯曲杆菌 属，螺杆菌属，尤其是幽门螺杆菌，嗜血杆菌属，博德特氏菌属，军团菌属， 利斯特氏菌属，布鲁氏菌属，弗朗西丝氏菌属，丹毒丝菌属，棒状杆菌属， 芽孢杆菌属，梭菌属，拟杆菌属，普雷沃氏菌属，卟啉单胞菌属，棱杆菌属， 厌氧螺菌属,棍状厌氧菌属,厌氧弧菌属,丁酸弧菌属,蜈蚣菌属 (Centripedia),脱硫单胞菌属,偶蹄形菌属，丝状杆菌属，纤毛菌属 (Leprotricha),巨单胞菌属,光岗菌属,立克菌属,塞巴鲁德菌属，月单胞菌 属，琥珀酸弧菌属，琥珀酸单胞菌属，替策氏菌属，分枝杆菌属，尤其是结 核分枝杆菌，非典型分枝杆菌(MOTT)和麻风分枝杆菌，诺卡氏菌属，密螺 旋体属，尤其是苍白密螺旋体和品他病密螺旋体，疏螺旋体属，尤其是广义 博氏疏螺旋体，嘎氏疏螺旋体，阿氏疏螺旋体，B.valaisiana，B.lusitaniae 和B.spielmani/A14S和回归热疏螺旋体，钩端螺旋体属，立克次氏体属，柯 克斯氏体属，埃里希氏体属，巴尔通氏体属，支原体属，尤其是肺炎支原体 和人型支原体，脲原体属，放线菌(Actinomyceta)，衣原体属。此外，根据 本发明，所述抗原可优选源自其他医学上相关的细菌，诸如Tropheryma,巴 斯德菌属，布兰汉氏球菌属，链杆菌属，螺菌属，和加德纳菌属。

此外，根据本发明，所述抗原更优选为结核分枝杆菌的多肽，诸如 CFP-10,ESAT-6,TB7.7,TB37.6和MPT63或多肽混合物，例如结核菌素PPD。

此外，根据本发明，所述抗原特别优选为疏螺旋体属物种的多肽，诸如 VlsE、p58(OppA-2)、BBK32、p14、p20(BBQ03)、p21-24(OspC)、p37-38 (FlaA)、p41(Flagellin、FlaB)、p19(OspE)、p18、Crasp3、BBA36、BB0323、 p26(OspF)、p28(OspD)、p30、p39、(BmpA)、p60-65(共有抗原，Hsp60)、 p83-100、p17(Osp17)、p31-32(OspA)和p34(Osp B)，或疏螺旋体属脂质或 疏螺旋体属菌株的裂解物。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所述抗原是对动物致病的细菌的 抗原。下面列出了依照本发明的此类细菌的例子。该列表在本发明的语境中 不应视为限制性的，而应视为仅为示例。支原体属，芽孢杆菌属，尤其是炭 疽芽孢杆菌，布鲁氏菌属，分枝杆菌属，尤其是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌， 弯曲杆菌属，三毛滴虫属，钩端螺旋体属，立克次氏体属，沙门氏菌属，梭 菌属，放线杆菌属，衣原体属(Clamydia)，棘球蚴,利斯特氏菌属，耶尔森 氏菌属，棒状杆菌属和弗兰西丝氏菌属。当前描述的细菌的综合列表可在互 联网上http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=R oot访问。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所述抗原是真菌抗原。在本发明 的一个特别优选的实施方案中所述抗原源自对人类致病的真菌。下面列出了 依照本发明的此类真菌的例子。该列表在本发明的语境中不应视为限制性 的，而应视为仅为示例。酵母，尤其是假丝酵母属，隐球菌属，Malassetia， 丝孢纲(Hyphomycetes)，尤其是曲霉属，Trichphyton,小孢子菌属,和表皮癣 菌属(Epidermophyton)，双态性真菌，尤其是组织胞浆菌属(Histoplasma)，芽 生菌属(Blastomyces),球孢子菌属(Coccidioides),副球孢子菌属 (Paracoccidioides),孢子丝菌属(Sporothrix),和肺囊虫属(Pneumocystis)。

在本发明的另一个实施方案中所述抗原是寄生物的抗原。在本发明的一 个优选的实施方案中所述抗原源自对人类致病的寄生物。下面列出了依照本 发明的此类寄生物的例子。该列表在本发明的语境中不应视为限制性的，而 应视为仅为示例。原生动物，诸如锥虫属、利什曼原虫属、毛滴虫属 (Trichomona)，贾第虫属、阿米巴原虫(Amoebae)、疟原虫、弓形体属、隐孢 子原虫(Cryptosporidia)、微孢子目(Microsporidia)。吸虫纲(Trematoda)，诸如 血吸虫属(Schistosoma)，以及多节绦虫亚纲，诸如绦虫和棘球蚴，以及线虫 纲(Nematoda)，诸如鞭虫属，毛线虫属,类圆线虫属,钩虫属(Ancyclostoma), 板口线虫属,蛲虫属,蛔虫和丝虫目。在本发明的另一个优选的实施方案中 所述抗原是对动物致病的寄生物的多肽。下面列出了依照本发明的此类对 动物致病的寄生物的例子。该列表在本发明的语境中不应视为限制性的，而 应视为仅为示例。原生动物，尤其是原单胞菌(Protomonas),双滴虫 (Diplomonas),Polymastigidia,阿米巴原虫，弓形体属和球虫类(Coccisidia), 微孢子门(Microspora),蠕虫(Helminthes),吸虫纲(Trematora),多节绦虫亚纲 (Cestoda)和线虫纲。

在本发明的一个优选的实施方案中，设想所述抗原是肿瘤抗原或自身抗 原。在本发明的语境中，“自身抗原”理解为这样的抗原，其显示肽片段形 式的结构，代表身体自身的结构。在存在对此类自身抗原展现反应性的T细 胞的情况下，自身免疫疾病的存在是可能的。自身抗原又称自体抗原(self antigens)或自身免疫抗原(autoimmune antigens)。

在本发明的语境中，设想可以通过与肿瘤相关抗原或自身免疫抗原一起 温育来检测分别指示肿瘤疾病或自身免疫疾病的活化的T细胞。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述抗原是人类肿瘤抗原。根据本 发明，特别优选的是前列腺特异性抗原(PSA)、HER-2/neu,黏蛋白-1,过表 达的野生型p53以及显示点突变的p53，MAGE抗原和CEA(癌胚抗原).

在一个优选的实施方案中，所述抗原是自身免疫抗原。根据本发明，优 选的是多发性硬化(MS)的自身免疫抗原，诸如髓鞘碱性蛋白(MBP)，髓鞘少 突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂、MBP/PLP融 合蛋白(MP4)、少突胶质细胞的髓鞘相关碱性蛋白(MOBP),少突胶质细胞特 异性蛋白(OSP)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)以及糖蛋白P0、外周髓鞘蛋白22 (PMP-22/PAS-II)、p170k/SAG(施旺细胞膜糖蛋白)、少突胶质细胞髓鞘糖蛋 白(OMgp)、施旺细胞髓鞘蛋白(SMP)、转醛醇酶、S100β、αB晶体蛋白、2’, 3’-环核苷酸3’磷酸二酯酶(CNP)，睫状神经营养因子(CNF)和胶质纤维酸性 蛋白(GFAP)。

此外，根据本发明，1型糖尿病(青少年糖尿病)的自身免疫抗原，诸如 胰岛素B、前胰岛素(PPI)、酪氨酸磷酸酶IA-2，谷氨酸脱羧酶65(GAD65)， 热休克蛋白Hsp60，胰岛细胞蛋白ICA69，IGRP，cd4，嗜铬粒蛋白A(ChgA)(另 见Velthuis et al.(2010)Diabetes)是优选的。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述抗原选自下组：PSA、 HER-2/neu、黏蛋白-1、MAGE、CEA、髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘少突胶质 细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂、胰岛素B、前胰岛 素原、IA-2、GAD65、Hsp60、ESAT-6、CFP-10、TB7.7、TB37.6、MPT63、 结核菌素PPD、p14、OspC、p37-38(FlaA)、p41、OspE、OspF、OspD、p39、 Osp17、OspA、OSP B、Pr55^gag、p24、p17、POL、RT、nef、pp65、IE1、IE2、 BZLF1、EBNA3、EBNA2、EBNA6、BMLF1、EBNA1、ORF1、ORF4、PRF62、 ORF68、HBsAg、HBcAg和AdV5。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所述抗原选自含有T辅助细胞 的表位的多肽。

在本发明的另一个优选的实施方案中，设想用于步骤a)中接触和步骤 b)中温育的时间段为0小时至72小时，优选4、6或8小时。此外，设想优 选的是，步骤a)和/或步骤b)中的所述时间段为0小时至72小时，优选4、6 或8小时。此外，优选根据本发明步骤a)和/或步骤b)中的所述时间段为0 至48小时，更优选0至36小时，更优选0至34小时，更优选0至32小 时，更优选0至30小时，更优选0至28小时，更优选0至26小时，更优 选0至24小时，更优选0至22小时，更优选0至20小时，更优选0至18 小时，更优选0至16小时，更优选0至15小时，更优选0至14小时，更 优选0至12小时，更优选0至10小时，更优选0至9小时，更优选0至8 小时，更优选0至7小时，更优选0至6小时，更优选0至5小时，更优选 0至4小时，更优选0至3小时，更优选0至2小时，且更优选0至1小时。 在本发明的另一个优选的实施方案中步骤a)和/或步骤b)中的所述时间段为 0至60分钟，更优选0至50分钟，更优选0至40分钟，更优选0至30分 钟，更优选0至20分钟，更优选0至15分钟，更优选0至10分钟且更优 选0至5分钟。

根据本发明，还设想优选的是所述第一种APC标志物和第二种T细胞 标志物是核酸或蛋白质，尤其是RNA、DNA、核酸片段、肽或肽片段，并 且通过与所述至少一种抗原接触和温育而被诱导。

在本发明的另一个优选的实施方案中，设想所述APC标志物为4-1BB 配体(4-1BBL),OX40配体(OX40L),TNFSF(CD70),B7.1(CD80),B7.2 (CD86),FcγRIII(CD16),FcγRII(CD32),FcγRI(CD64)或TNF/TNF-受体和/或 免疫球蛋白超家族的另一个代表或CXCL家族的成员，例如CXCL9, CXCL10,CXCL11或趋化因子(C-C基序)配体家族的成员，例如CCL2,CCL7, CCL8,CCL10或IL1RN。

在本发明的另一个优选的实施方案中，设想所述T细胞标志物为IFN-β、 INF-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、GM-CSF、 TGF-β、MIP1a、MIP1b、4-1BB、CD25、穿孔蛋白和/或颗粒酶。此外，根 据本发明，设想所述T细胞标志物是由活化的T细胞或再活化的记忆T细 胞产生的另一种细胞因子或趋化因子。

根据本发明的优选的标志物尤其是这样的核酸：在T细胞对APC的表 位特异性识别后所述APC中该核酸的产生天然地可检测地增加。这类作为 本发明的APC标志物的核酸的例子有4-1BB配体(4-1BBL)及OX40配体 (OX40L)的mRNA分子(Oshima et al.1997,J.Immunol.159,3838-3848;den Haan and Bevan;2000,PNAS97,12950-12952)。此外，根据本发明优选的是 共刺激蛋白B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、以及Fas配体(FasL)、以及其他 TNF/TNF受体家族和免疫球蛋白超家族的蛋白、以及各种Fc-受体及细胞因 子和趋化因子的mRNA分子。此外，根据本发明，优选的是任何这样的多 肽的核酸，该多肽在APC中的产生由于活化的T细胞特异性识别APC的表 面上与MHC蛋白一起呈递的多肽而可检测地增加或减少。

在本发明的另一个优选的实施方案中，设想步骤c)和d)中的检测和定 量还通过PCR、定量PCR(qPCR)、微阵列、FACS、ELISpot和/或ELISA来 实施。

本发明的另一个目的涉及一种用于实施本发明方法的试剂盒，包括至少 一种抗原和用于扩增所述第一种标志物的引物对。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括用于扩增所述 第二种标志物的引物对。在另一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括用 于扩增参比基因的引物对。此外，根据本发明，如果该试剂盒含包含探针和 细胞培养基则是优选的。

在依照本发明的另一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括RNA稳 定化试剂，RT主预混物(RT-master mix)、qPCR主预混物、阳性对照、和阳 性试剂。根据本发明，“阳性对照”理解为确定量的待扩增的标志物DNA。 根据本发明，“阳性试剂”理解为这样的试剂，其即使在没有活化T细胞存 在时也能非特异性地刺激所述APC的标志物。本发明的“阳性试剂”的例 子有PMA/伊屋诺霉素或活化性抗CD40抗体与前列腺素E2(PGE₂)的组合。

在本发明的一个优选的实施方案中，设想所述试剂盒还包括这样的引 物，其容许通过PCR、qPCR或微阵列来检测所述APC的标志物。

下面通过下述的实施例来例示本发明。这些实施例应该是为本发明的具 体实施方案而不应视为限制性。

为了建立用于检测、区分和定量特异性T细胞群体(诸如活化T细胞) 的方法，分析了抗原呈递细胞(APC)中T细胞诱导的成熟过程。为此目的， 开发了一种基于加载有抗原的APC与离体扩增的活化的抗原特异性T辅助 细胞的共培养物的细胞培养模型。在该模型系统中(i)未加载的APC或加载 有无关抗原的APC与预活化的抗原特异性T辅助细胞的共培养物和(ii)加载 有抗原的APC与非特异性活化的T细胞或具有对无关抗原的特异性的活化 的T辅助细胞的共培养物充当阴性对照。该系统中，通过使用逆转录定量 实时聚合酶链式反应(RT-qPCR)对特异性活化的及未活化的培养物样品中的 标志物mRNA产生进行比较性定量，来检测抗原特异性T辅助细胞(Th细 胞)。

a)抗原特异性Th细胞的离体扩增

为了生成ESAT-6/CFP-10-特异性的活化Th细胞，将具有潜伏的结核分 枝杆菌感染的供体的CD4⁺T细胞在体外扩增3-4周时间。为此目的，将供 体的血液抽取到肝素化注射器中，用PBS_无(不含二价离子的磷酸盐缓冲盐 水，Lonza)稀释，然后使用Pancoll(Pan Biotech)20℃、800x g密度梯度离 心30min根据血细胞的密度来分离血细胞。然后从梯度分离出PBMC，并 使用PBS_无以300x g10min洗涤两次。然后使用MACS技术(CD4⁺T细胞 分离试剂盒II，Miltenyi)分离CD4⁺T细胞，并在完全R5培养基(RPMI1640 (Pan Biotech),5%人AB血清(从AB血型供体的血液产生),1%青霉素/链霉 素(PAN Biotech))中培养，每周一次用加载有ESAT-6/CFP-10融合蛋白(AG Lindner,Institute for medical Microbiology and Hygiene,University Hospital Regensburg)的自体APC(成熟树突细胞，PBMC)以1:3的比例(Th细胞:APC) 进行刺激。为此目的，在完全R5培养基中，37℃含5%CO₂的湿润气氛下 用10μg/ml的ESAT-6/CFP-10融合蛋白、1x10⁷细胞/ml的浓度，加载APC 3小时(h)，并进行30Gy的γ辐射，然后将它们与分离的Th细胞一起培养。 为了Th细胞的最优增殖，向培养物中加入50U/mL的重组IL-2(Proleukin S, Novartis)。每周一次通过用血细胞计数器检测总活细胞数来测定Th细胞的 增殖。同样每周一次通过检测用加载有ESAT-6/CFP-10的经辐射的PBMC 进行刺激后INF-γ和CD40L阳性细胞的数量来测定培养物的特异性。为此 目的，将扩增培养物的Th细胞以1:1的比例与新鲜分离的自体PBMC在37℃ 5%CO₂、且存在10μg/ml ESAT-6/CFP-10的条件下温育6小时。温育2小时 后，加入布雷菲德菌素A来消除来自细胞的细胞因子释放。分别使用每次 用1μg/ml PMA/伊屋诺霉素刺激的样品，以及未刺激的样品作为阳性和阴性 对照。向每个刺激样品中加入1μg/ml共刺激性单克隆抗-CD49d和抗-CD28 抗体。温育之后接着是一个洗涤步骤。为此目的，向细胞中加入9ml PBS_无， 并在4℃300x g将细胞离心8分钟。弃去上清并将细胞重悬于回流液(reflux) 中。然后分别用5μl的下列荧光团缀合的抗体标记表面分子：抗CD3别藻 蓝蛋白-H7(BD),抗CD4别藻蓝蛋白(BD),抗CD8多甲藻黄素叶绿素蛋白 (BD)。表面染色在暗处室温下进行20min。然后洗涤细胞，并在PBS_无中用 500μl2%多聚甲醛(PFA)(Sigma Aldrich)在暗处室温固定细胞10min。再经 过一个洗涤步骤后，在用于透化细胞的10μl2%皂苷(Carl Roth)存在下，在 PBS_无中用1μl抗IFN-γ-荧光素异硫氰酸酯(BD)和10μl抗CD40L R-藻红蛋 白(BD)在暗处室温进行对细胞内INF-γ和细胞内CD40L的染色30min。然 后用含0.1%皂苷的PBS_无洗涤细胞两次，将细胞重悬在300μl含1%PFA的 PBS_无中。在FACS CANTO II流式细胞计(BD)中分析经染色的细胞。为此目 的首先根据前散射光和侧散射光分离细胞群体。然后针对淋巴细胞群体分析 它们的CD3表达。然后对所有CD3⁺细胞分析它们的CD4和CD8蛋白表达。 然后针对CD4⁺T细胞分析它们的IFN-γ和CD40L表达。

为此目的，根据IFN-γ和CD40L的表达来测定活化的ESAT-6/CFP-10 特异性T辅助细胞的百分比(数据未显示)。在扩增培养物中，可观察到T辅 助细胞的持续增殖，该增殖伴随着ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞的增加。 因此，在3-4周后，在扩增培养物中可以产生5至18%的特异性Th细胞。 按照与前文所述的实验步骤类似的实验步骤，分别使用EBV-和CMV-血清 阳性供体的血液样品来进行EBV-(BZLF1)和CMV-(pp65)特异性Th细胞的 生成和表征。

b)离体预活化的ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞与新鲜制备的加载用ESAT-6/CFP-10融合蛋白的自体PBMC的共培养。

将新鲜制备的具有潜伏结核病的供体的PBMC在B细胞培养基(Iscove 氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM)(Lonza),10%人AB血清，6ng/ml IL-4 (Miltenyi Biotech)，50ng/ml转铁蛋白(Roche),5μg/ml胰岛素(Roche))中以1:1 比例与总细胞数为1x10⁶细胞/ml的所述扩增培养的离体预活化的 ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞在存在或不存在10μg/ml ESAT-6/CFP-10融合 蛋白的条件下共培养。将细胞在37℃5%CO₂中温育10h，其中在不同时间 点(例如0；0.5;1;2;3;4;6;8和10h后)每次移出2x10⁵个细胞的样品。将 这些迅速离心，弃去上清，然后将离心沉淀立即在液氮中冷冻。将样品保存 在-80℃直到进一步处理。预先在一个新鲜制备的PBMC与自体离体预活化 的Th细胞的共培养物中，在用ESAT-6/CFP-10刺激之后随时间分析Th细胞 表面上的活化标志物CD40L的存在。这些分析显示特异性地体外再刺激的 Th细胞在它们的表面上展现瞬时CD40L表达，其中在与加载抗原的APC 共培养6小时之后可以观察到最高数目的表达CD40L的细胞(数据未显示)。

c)利用RT-qPCR定量PBMC中的4-1BBL mRNA作为抗原特异性活化Th细胞的间接检测

使用peqLab peqGOLD总RNA试剂盒(peqLab)，从细胞样品分离总 RNA。使用peqGOLD DNA酶I消化试剂盒(peqLab)去除DNA污染。将总 RNA溶出于60μl DEPC水(1L蒸馏水加1ml焦碳酸二乙酯(Sigma))中；37 ℃温育1h，然后121℃高温蒸汽灭菌15min。

为了逆转录(RT-PCR)成cDNA，将10μl溶出的RNA与10μl RT-PCR 主预混物混合。RT-PCR主预混物含有溶于DEPC水的50mM缓冲液A (TaqMan1000RXN Gold与缓冲液A(Applied Biosystems),5mM MgCl₂(TaqMan1000RXN Gold与缓冲液A(Applied Biosystems)),2.5mM随机化 六聚体引物(MWG Operons/Eurofins),5mM dNTP,2.5U/μl MuLV逆转录酶 (Applied Biosystems),1U/μl RNA酶抑制剂(Applied Biosystems)。逆转录为 23℃15min、95℃5min、42℃30min，使用PTC-200Peltier热循环仪(MJ Research)进行。然后将24μl qPCR主预混物(50mM缓冲液A,6.875mM MgCl₂,0.308μM4-1BBL正向引物GAGGGTCCCGAGCTTTCG，Biomers,在 SEQ ID NO:1中显示;0.308μM41BBL反向引物 GCCCATCGATCAGCAGAAC,Biomers,在SEQ ID NO:2中显示;0.2525μM 41BBL探针FAM-CCACCAGCTGCGCAAACATGC-TMR,TIB Molbiol,在 SEQ ID NO:3中显示;0.308μM GAPDH正向引物 GAAGGTGAAGGTCGGAGTC,Biomers,在SEQ ID NO:4中显示;0.308μM GAPDH反向引物GTAAACCATGTAGTTGAGGTC,Biomers,在SEQ ID NO:5中显示;0.2525μM GAPDH探针 YAK-TCATTGATGGCAACAATATCCACT-TMR,TIB Molbiol,由SEQ ID NO:6所示;0.003125U/μl TaqGold聚合酶(溶于DEPC水)与6μl产生的cDNA 混合。qPCR的温度曲线包括一步95℃10分钟，然后50个由95℃15s和 60℃1min组成的循环；qPCR用StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems)来进行。

组成型表达4-1BBL mRNA的THP-1细胞作为阳性对照和参比。在测试 中以与样品相同的方式处理它们。然后，使用类似地预先扩增的甘油醛3- 磷酸脱氢酶(GAPDH)作为参比基因根据下面的公式进行4-1BBL mRNA的相 对定量：

R=2^-ΔΔCq

ΔΔCq=[(Cq4-1BBL(S)–Cq GAPDH(S)]-[(Cq4-1BBL(NK)–Cq GAPDH(NK)]

结果以经刺激的样品的标志物mRNA产生与相应的阴性对照(已经预先 用GAPDH标准化)的比例来给出。对于每个样品，分析一式三份进行。

这些分析显示，与未加载的PBMC相比，与加载有ESAT-6/CFP-10蛋 白的自体PBMC共培养的ESAT-6/CFP-10特异性预活化Th细胞显示了可测 量的4-1BBL mRNA产生增加(图3)。

实施例2:加载有ESAT-6/CFP-10蛋白的PBMC的共培养物中4-1BB 配体mRNA产生的诱导与离体扩增的ESAT-6/CFP-10蛋白特异性Th细胞 的数目之间的关联

如实施例1a)项下所述将潜伏感染了结核分枝杆菌的受试者的 ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞离体扩增，然后如实施例1中b)项下所述与 新鲜制备的自体PBMC共培养。在该过程中，在半对数浓度系列(浓度梯级： 0、117、370、1170、3700、11700、37000、117000个预活化的Th细胞/1×10⁶个PBMC)中滴定与1×10⁶个PBMC共培养的ESAT-6/CFP-10特异性Th细 胞的数目。在0;0.5;1;2;3;4;6;8和10小时温育后，移出2×10⁵个细胞， 300g离心沉降5min，将沉淀物立即冷冻在液氮中。将细胞保存在-80℃直 到进一步使用。根据实施例1c)项下的规程分离总RNA，并在RT-qPCR中 对其分析4-1BBL mRNA产生。

在这些分析中可以观察到预活化的ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞的数 目与标志物(4-1BBL mRNA的增加的产生)的信号强度有清楚的相关性(图 4)。

实施例3:在未刺激的PBMC、用ESAT-6/CFP-10刺激过的PBMC以 及自体离体预活化的结核分枝杆菌ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞的共培养 物中4-1BBL及IFN-γmRNA产生的诱导

如实施例1a)项下所述离体扩增潜伏感染结核分枝杆菌的患者的 ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞，然后如实施例1b)项下所述将其与新鲜制备 的自体PBMC共培养。在该过程中将50,000个离体预活化的ESAT-6/CFP-10 特异性Th细胞与1×10⁶个PBMC共培养。在0-32小时的时间段内每隔2小 时从培养样品中移出2×10⁵个细胞，300x g离心沉降5分钟，然后立即将沉 降物在液氮中冷冻。将细胞保存在-80℃直到进一步使用。根据实施例1c) 项下的规程分离总RNA，并在RT-qPCR中对其分析4-1BBL mRNA的产生。 此外，同样地如实施例1c)项下所述分析细胞因子IFN-γ(其在APC与特异 性T细胞的抗原特异性接触之后由T细胞释放)的mRNA的产生。为此目的， 使用下述引物探针系统，其中同样使用GAPDH作为参比基因：IFN-γ正向 引物GTGGAGACCATCAAGGAAGACAT,Biomers,由SEQ ID NO:7所示; IFN-γ反向引物GGCGACAGTTCAGCCATCA，Biomers，由SEQ ID NO:8 所示；IFN-γ探针FAM-TTCATGTATTGCTTTGCGTTGGACATTCAA-TMR， 由SEQ ID NO:9所示。

在结核分枝杆菌潜伏感染的人中，结核分枝杆菌特异性Th细胞存在于 PBMC混合物中，还部分地展现对ESAT-6/CFP-10的特异性。与之相对照的 是，活化的ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞在急性病期间瞬时出现，然后仅 见于PBMC混合物中。通过滴定将离体预活化的ESAT-6/CFP-10特异性Th 细胞加入PBMC来模拟急性结核分枝杆菌感染。这些分析显示，除了4-1BBL mRNA的产生的增加之外，在离体预活化的ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞 与具有潜伏结核病的供体的自体PBMC的共培养物中还可检测到IFN-γ mRNA的相对增加(图5A和5B)。

实施例4:在加载有ESAT-6/CFP-10PBMC的PBMC与 ESAT-6/CFP-10特异性活化的Th细胞或非特异性地预活化的Th细胞的共 培养物中4-1BBL mRNA产生的诱导

为了验证RTT方法的抗原特异性，将具有潜伏结核病的供体的PBMC 在有和没有ESAT-6/CFP-10蛋白存在下用预活化的ESAT-6/CFP-10特异性活 化Th细胞或与对ESAT-6/CFP-10非特异性的活化Th细胞进行刺激，并在不 同的时间点使用RT-qPCR技术测定ESAT-6/CFP-10刺激过的细胞培养物中 相比于未刺激的细胞培养物4-1BBL产生的相对增加。为此目的，如实施例 1a)项下所述的那样分离Th细胞，并将如此获得的Th细胞与可商购的T细 胞扩增珠子(Dynabeads,Invitrogen)按2:1的比例在R5培养基中在37℃、5% CO₂湿润气氛下一起培养14天。通过用流式细胞术监测CD40L的表达来测 定T细胞的活化。该分析证明，在用扩增珠子刺激14天后，超过40%的Th 细胞在它们的表面上展现CD40L(数据未显示)。

然后将1×10⁶个新鲜制备的自体PBMC/ml在存在和不存在10μg/ml ESAT-6/CFP-10的条件分别与0,210,6636或66360个离体预刺激的 ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞(如实施例1a)项下所述产生的)或非特异性活 化的Th细胞(如实施例1b)项下所述产生的)共培养。在0;0.5;1;2;3;4;6和 8小时之后分别从共培养物移出2×10⁵个细胞，并如实施例1c)下所述在 RT-qPCR中对其分析4-1BBL mRNA的产生。

这些实验显示预活化的ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞的数目与4-1BBl 表达在特异性刺激的共培养物样品中相对于未刺激的共培养物样品的相对 增加之间的直接相关性。相比之下，在与非特异性预活化的Th细胞的共培 养物样品中可以观察到4-1BBL mRNA产生的相对增幅显著降低(图6)。

实施例5:来自选定的结核分枝杆菌-、EBV-、以及CMV-阳性供体的 PBMC与离体预活化的结核分枝杆菌-、ESAT-6/CFP-10-、EBV BZLF1-、 或CMV pp65-特异性Th细胞在存在和不存在ESAT-6/CFP-10、BZLF1或 pp65的条件下的共培养物中4-1BBL mRNA产生诱导的特异性

在另一个实验中，分析了是否(i)用结核分枝杆菌ESAT-6/CFP-10、EBV BZLF1和CMV pp65蛋白质本身加载PBMC可诱导4-1BBL mRNA的非特 异性活化，以及是否(ii)RTT标志物的诱导由于APC以抗原特异性的方式与 活化Th细胞的相互作用而发生。为此目的，通过使用具有结核分枝杆菌潜 伏感染的EBV-和CMV-血清阳性供体的分离的Th细胞如实施例1a)项下所 述离体扩增和预活化。然后将70000个离体扩增的T辅助细胞在存在和不存 在10μg/ml ESAT-6/CFP-10,BZLF-1或pp65的条件下分别与1x10共培养。 在温育0;0.5;1;2;3;4;6;8和10小时之后，分别从共培养物中移出2×10⁵个细胞，300x g离心沉降5分钟，并立即将沉降物在液氮中冷冻。细胞保 存在-80℃直到进一步使用。根据实施例1c)项下的规程分离总RNA，并使 用RT-qPCR技术对其分析4-1BBL mRNA产生。

这些分析证明，用各种刺激物抗原刺激含有APC的PBMC不引发 4-1BBL mRNA的非特异性活化。此外，这些分析证明，APC中4-1BBL mRNA 产生的增加仅在活化Th细胞与APC的抗原特异性接触之后发生。如果将结 核分枝杆菌特异性Th细胞与自体PBMC共培养，它们只有在ESAT-6/CFP-10 存在下引发4-1BBL mRNA产生的诱导，而在BZLF1或pp65存在下，或无 抗原存在下则不然(图7和8a)。除此之外，体外预活化的BZLF1-和pp65- 特异性Th细胞分别仅在那些已经加载了各个活化T细胞的相应的靶结构的 自体PBMC的培养物中才诱导了4-1BBL mRNA的产生增加(图8b和8c)

此外，所实施的分析提示，4-1BBL mRNA诱导的效率与PBMC中存在 的抗原特异性CTL的数目成逆相关。在TB患者的血液中通常能找到的 ESAT-6/CFP-10特异性CTL极少，而在CMV血清阳性，尤其是EBV血清 阳性的受试者中，分别有显著比例，或者主要比例的现有记忆T细胞可归于 细胞毒性T细胞(CTL)亚群。在ESAT-6/CFP-10特异性的预活化Th细胞与 加载有ESAT-6/CFP-10的PBMC的共培养物中可观察到最强的4-1BBL活 化，而在BZLF1特异性的预活化Th细胞与加载有BZLF1的PBMC的共培 养物中可观察到最低的4-1BBL活化。该现象可以用特异性CTL对给出信号 的APC的裂解来解释。

实施例6:阻断性抗MHC1类抗体的添加对加载有BZLF1的PBMC 与离体活化的BZLF1特异性Th细胞的共培养物中4-1BB配体mRNA的 诱导的调节

结核分枝杆菌感染主要由Th细胞控制。此外，细胞毒性T细胞(CTL) 也通过识别和破坏被病原体侵染的细胞而在与病原体的对抗中起作用。在特 定的感染中，例如在埃巴二氏病毒(EBV)感染中，CTL是主要的T细胞群体。 在本发明的方法中，基于所谓的反向T细胞技术(reverse T cell technology， RTT)，CTL也可能识别和破坏加载有病原体特异性结构的APC，甚至在它 们表达APC的标志物，RTT标志物之前。这样一来，可能的释放信号的APC 数目降低，从而测试的灵敏度降低。为了考察细胞毒性T细胞对RTT方法 的灵敏度的影响，在存在和不存在MHC-I阻断性抗体(10μg/ml)(HLA ABC 抗体，批号MCA81EL;克隆W6/32AbD Serotec)的条件下，进行与体外预活 化的BZLF1特异性Th细胞(如实施例1a)项下所述产生)与用BZLF1加载的 自体PBMC的共培养实验，如实施例1b)项所述。由于抗体结合抗原呈递细 胞上的MHC-I分子，阻止CTL对所述细胞的识别，结果不发生对加载有蛋 白的APC的杀灭。将1×10⁶个细胞/ml在BZM中共培养，其中每1×10⁶个 PBMC使用70000个BZLF1特异性预活化的Th细胞。在0,1,2,3,4,6,8和 10h的时间点每份样品分别移出2×10⁵个细胞，离心沉降，并立即冷冻于液 氮中。将样品保存在-80℃直到进一步使用。然后在RT-qPCR中分析4-1BBL mRNA的含量，如实施例1中c)项下所述。

通过使用MHC-1阻断性抗体，有可能在这些实验中显著增加BZLF1 特异性Th细胞与加载有BZLF1的PBMC的共培养物中4-1BBL mRNA的诱 导(图9)。

实施例7:对具有活动和潜伏结核病的患者、以及健康供体的PBMC 中4-1BB配体mRNA产生的特异性诱导的分析，以便间接检测活化Th细 胞

为了阐明本发明的方法，即RTT方法，是否能用于鉴定具有活动结核 病的患者，以及用于将他们与潜伏结核病和健康供体区别，从(i)未感染结核 分枝杆菌的健康供体(p012、p010、p008)；(ii)具有潜伏结核病的健康供体 (p009、p006、p005)；(iii)在分析前最近6个月内因为活动结核病接受过药物 治疗的供体(p013、p014、p003)；以及(iv)在病因性治疗开始之前或刚开始之 后具有活动结核病的供体(p001、p004、p007)各三人采取血液到肝素化注射 器中，从中新鲜分离出PBMC。然后分别将1×10⁶个细胞/mL与10μg/mL ESAT-6/CFP-10在37℃、5%CO₂条件下在湿润气氛中温育。此外，将选定 的供体的PBMC与对照抗原，HIV p24(壳体蛋白)(健康：p008；潜伏：p005 和p006；处理的：p003；活动的：p007和p001)或牛血清白蛋白(p001)温育， 或者作为另一阴性对照，在没有任何抗原的存在下温育。在温育0.5;1;2;3; 4;6;8和10小时后分别取出2×10⁵个细胞，离心沉降并立即在液氮中冷冻。 将细胞保存在-80℃直到进一步加工。如实施例1c)项下所述，然后在 RT-qPCR中分析4-1BBL mRNA的含量。

显示在健康供体的PBMC中用ESAT-6/CFP-10刺激未导致4-1BBL mRNA的诱导(图10a)。类似地，在结核分枝杆菌潜伏感染的受试者的PBMC 中(图10b)或在分析之前6个月由于活动性结核病而接受了药物治疗的受试 者的PBMC中(图10c)，无法测量到4-1BBL mRNA的诱导。只有在病因性 治疗开始之前或开始之后不久急性发病的受试者的PBMC中才有可能在用 ESAT-6/CFP-10刺激之后观察到4-1BBL mRNA在特异性刺激的细胞培养物 中相比于未刺激的细胞培养物有显著增加的诱导(图10d)。用无关抗原BSA 和p24刺激PBMC同样未导致4-1BBL mRNA的增加的诱导(图10e)。

实施例8:在具有急性和潜伏结核病的供体以及具有结核菌素PPD的 健康受试者的PBMC中4-1BBL mRNA产生的诱导

为了考察通过使用更宽的抗原谱能够增加急性结核病患者的PBMC中 4-1BBL mRNA的诱导，从具有急性和潜伏结核病的患者，以及健康供体分 别取血到肝素化注射器中，并从中新鲜分离PBMC。然后将1×10⁶个细胞/mL 与10μg/mL ESAT-6/CFP-10或结核菌素PPD(Statens Serum Institut,Denmark) 在湿润气氛中37℃、5%CO₂条件下温育。此外，将等份的PBMC在无抗原 条件下温育作为阴性对照，以及分别与1μg/mL佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13- 乙酸酯(PMA)(Sigma Aldrich)和伊屋诺霉素(Sigma Aldrich)温育，作为 4-1BBL mRNA产生诱导能力的阳性对照。在温育0、2、4、6、8、和10小 时后移出2×10⁵个细胞，离心沉降并立即在液氮中冷冻。将细胞冷冻在-80 ℃直到进一步处理。如实施例1中c)项下所述，然后在RT-qPCR中分析 4-1BBL mRNA的含量。

可以显示，用结核菌素PPD刺激在具有急性结核病的患者的PBMC中 引发的4-1BBL mRNA产生诱导比ESAT-6/CFP-10高许多倍(图11a，上图)。 同时，在潜伏感染的受试者以及健康受试者的PBMC中在用结核菌素PPD 以及用ESAT-6/CFP-10刺激之后均未能观察到显著增加的4-1BBL mRNA产 生诱导(图11b和11c，上图)。此外，在所有三个受试者的用PMA/伊屋诺霉 素刺激的PBMC等份中，与未刺激的PBMC等份相比，可以观察到4-1BBL mRNA产生的显著增加，从而证明了所述PBMC产生这种RTT标志物的功 能(图11a-c，下图)。

实施例9:在健康供体的PBMC中用PMA/伊屋诺霉素或PGE2/抗 CD40的组合刺激之后4-1BB配体表达的诱导的时间过程

为了鉴定本发明的RTT方法用于检测活化T细胞的阳性对照，考察了 PMA/伊屋诺霉素或PGE2/抗CD40的组合是否引发4-1BBL mRNA表达的非 特异性诱导，并且引发的强度如何。为此目的，将健康供体的1×10⁶个 PBMC/mL分别与1μg/mL PMA及伊屋诺霉素、或者5μg/mL PGE₂(Alexis Biochemicals)及2μg/mL CD40-抗体(LEAF-抗CD40;Biozol)的组合温育。用 未经刺激的PBMC作为阴性对照。在温育0、2、4、6、8、和10小时后移 出5×10⁵个细胞，离心沉降并立即在液氮中冷冻。将细胞冷冻在-80℃直到进 一步使用。如实施例1中c)项下所述，然后在RT-qPCR中分析4-1BBL mRNA 的含量。

这些分析显示，PMA和伊屋诺霉素(图12a)是比PGE2与CD40抗体的 组合(图12b)显著更高效的4-1BBL mRNA产生的非特异性诱导物。

实施例10:使用不同的参比基因在未经刺激以及经ESAT-6/CFP-10刺 激的体外预活化结核分枝杆菌特异性Th细胞与自体PBMC的共培养物中 4-1BBL mRNA产生的相对诱导的比较性测定

为了鉴定出本发明的RTT方法的合适的参比基因，通过使用相应的引 物/探针系统扩增了实施例3所述的cDNA样品中的参比基因GAPDH、huP0 和PBGD，以便将4-1BBL mRNA的量标准化。为此目的，根据实施例1c) 项下所描述的RT-qPCR条件使用了用于扩增这些基因的引物/探针系统。

为此目的使用了下述引物/探针系统：

huP0正向引物GTGGTGCTGATGGGCAAGA,Biomers,由SEQ ID N O:10所示;huP0反向引物GCAGCAGTTTCTCCAGAGCTG，Biomers，由 SEQ ID NO:11所示;huP0探针FAM-ACCATGATGCGCAAGGCCATCC- TMR，TIB Molbiol，由SEQ ID NO:12所示;PBGD正向引物CCAGCTCC CTGCGAAGAG，Biomers，由SEQ ID NO:13所示;PBGD反向引物CAC TGAACTCCTGCTGCTCG，Biomers，由SEQ ID NO:14所示;PBGD探 针FAM-CCCAGCTGCAGAGAAAGTTCCCGC-TMR，TIB Molbiol，由SE Q ID NO:15所示。该分析根据2^-ΔΔCq方法进行，使用GAPDH、huP0和PB GD作为参比基因，未刺激的对照作为校准物。

这些分析揭示4-1BBL mRNA的含量可以用所有三种参比基因标准化 而不会显著影响最后的结果(图13)。虽然用三种参比基因进行标准化时可以 观察到诱导4-1BBL mRNA的强度的差异，但趋势是近似的。

实施例11:通过流式细胞术在ESAT-6/CFP-10加载的PBMC以及离体 扩增的ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞的共培养物中测定4-1BB配体表达

将体外扩增的活化ESAT-6/CFP-10特异性Th细胞(如实施例1中a)项所 述产生)以1:1与自体PBMC混合，并在有和无重组ESAT-6/CFP-10存在下 以1×10⁶个细胞/ml在R5中共培养28h。在最后26h中用布雷菲德菌素A 抑制蛋白质分泌。然后根据实施例1中a)项下的规程细胞内标记4-1BBL在 B细胞中的蛋白表达，再通过流式细胞术测定。表面染色使用5μl抗CD19R- 藻红蛋白花青7(PeCy7)(BD)；4-1BBL的胞内染色使用20μl抗4-1BBL PE (BD)

这些分析显示，未刺激的B细胞已经显示非常高含量的细胞内存在的 4-1BBL；因此在用ESAT-6/CFP-10刺激之后无法检测到蛋白质水平上的 4-1BBL表达的进一步诱导(图2)。这些分析证明，在蛋白质水平上检测T细 胞诱导的成熟过程只有当使用流式细胞术或ELISA和ELISpot技术时方有可 能并且受到限制，这是由于RTT标志物含量是可变的，而且从某种程度上 说非常高。

实施例12:用于RTT方法的用于标准化RT-qPCR的参比基因的鉴定。 在不同反应混合物中表达水平的非由细胞中的表达的生物学改变所造成的 变化需要加以校正。

为了鉴定适于在RTT方法中用于分析临床样品的参比基因，在三种不 同条件下刺激了不同受试者组的PBMC样品，并将参比基因的RT-qPCR结 果与相应的未刺激样品进行比较。对两名TB活动感染的患者、一名TB潜 伏感染的患者、以及一名健康受试者和一名健康的BCG接种受试者的肝素 钠血液样品进行处理。为此目的，如实施例1a)项下所述分离PBMC。然后， 将每6ml样品6x10⁶个PBMC在B细胞培养基中进行刺激。用 ESAT-6/CFP-10(10μg/ml)、结核菌素PPD(10μg/ml)刺激、或者用PMA/伊 屋诺霉素非特异性地刺激(分别(in each case)1μg/ml)，在湿润气氛中37℃、 5%CO₂条件下进行6h时间。温育之后300x g10min离心沉降细胞，弃去 上清，用RLT缓冲液(QIAGEN)和1%β巯基乙醇溶解离心沉淀，然后马上 在液氮中冷冻。根据制造商的说明用RNeasy小提试剂盒(QIAGEN)分离 RNA，包括在柱上进行DNA酶消化。用QIAGEN的QuantiTect逆转录试剂 盒进行cDNA合成。使用定制基因表达阵列96孔快速平板(Gene Expression Array96-Well Fast Plates)(Applied Biosystems)和TaqMan快速通 用主预混物(Fast Universal Master Mix)(Applied Biosystems)根据制造商的说 明实施qPCR。

良好适用于RT-qPCR的参比基因的表达水平在所有适用的实验条件 下，以及在本文中考虑的刺激之下，都应该保持恒定。此外，参比基因的表 达水平应当与靶基因的表达水平相应。同样，qPCR效率应该与靶基因的相 似。对于所有五个样品，比较并分析了结果。

结果描绘于图14。对于不同的刺激条件，RTT标志物基因TNFSF9和 IFNG的表达在C_q20和C_q30之间检出(未显示)。由于在所有刺激条件下的恒 定表达，由于表达水平在C_q28-C_q29，并且由于与靶基因之一的RT-qPCR效 率相似(未显示)，因此基因TAF1A和HMBS作为RTT标志物4-1BBL(又称 TNFSF9)以及IFN-γ(又称IFNG)的RNA的参比基因是合适的。对于具有更 高表达的备选标志物，HPRT1或RPLP0可以视为合适的参比基因。

因此总的来说，在这些分析中可以鉴定出数种合适的参比基因，它们的 表达水平在所有实验条件下保持恒定。基于RTT标志物基因TAF1A的表达 水平，HMBS可以用作用于低表达的参比基因，HPRT1可用作用于中等表达 的参比基因，或者RPLP0可用作用于高表达的参比基因。对于标志物TNFSF9 和IFNG，TAF1A适合用作参比基因。

实施例13:在来自不同受试者的结核菌素PPD刺激的PBMC中，相比 于未刺激的样品测定4-1BBL(又称TNFSF9)的表达，以确定RTT标志物的 背景表达，并确定用于区分具有活动TB感染的患者与正常人的阈值

对21名受试者的血液样品实施本发明的RTT方法，以便获得关于RTT 标志物4-1BBL(又称TNFSF9)在健康受试者以及具有潜伏TB的患者中的平 均背景表达的信息。为此目的，如实施例1中a)项下所述分离PBMC。对每 份样品将5x10⁶个PBMC在B细胞培养基中、在有和无10μg/ml结核菌素 PPD存在下、37℃、5%CO₂湿润气氛中温育6h时间。刺激以一式二份进 行，且独立地进行处理。温育后离心沉降细胞，在含40mM DTT的RLT缓 冲液(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)中裂解，并将裂解物立即冷冻于液 氮中。根据制造商的说明用RNeasy小提试剂盒(QIAGEN)分离RNA，包括 在柱上进行DNA酶消化。分别使用1μg RNA利用QuantiTect逆转录试剂盒 (QIAGEN)按照制造商的说明进行cDNA合成。qPCR使用1μl cDNA，总反 应体积10μl，使用Applied Biosystems的快速通用主预混物。主预 混物具有下述组成：300nM TNFSF9正向引物GAGGGTCCCGAGCTTTCG， 由SEQ ID NO:1所示;300nM TNFSF9反向引物 GCCCATCGATCAGCAGAAC，由SEQ ID NO:2所示;200nM TNFSF9探针 FAM CCACCAGCTGCGCAAACATGC-TMR，由SEQ ID NO:3所示;1x 快速通用PCR主预混物，1x 基因表达测定TAF1A VIC 染料标记的MGB探针(引物限定的)(Applied Biosystems)。qPCR的温度曲线 包括95°C变性20s，然后40个由95°C3s和60°C30s组成的循环。qPCR 在StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行。对于21个样品， 分别来自两次独立刺激的比较性Cq分析(2^-ΔΔCq)结果的平均值示于图15。

这些分析显示，对于具有潜伏TB的受试者、健康个体、以及BCG接 种的健康个体，RTT标志物TNFSF9的表达在刺激后的相对增加均低于或最 多为2倍，而活动感染的TB患者显示表达增加多于2倍。因此，可以确定 初步的阈值为2^-ΔΔCq=2.0。因此该RTT方法可能分别区分活动感染的TB患 者，与健康个体或潜伏TB的受试者。

实施例14:使用替代的部分合成的无血清培养基改进IFN-γ(又称 IFNG)的表达

为了研究使用替代的细胞培养基是否可增加IFN-γ(又称IFNG)信号，测 试了数种部分合成的培养基。常规使用的B细胞培养基含有IL-4，其可能导 致IFNG信号的抑制。此外，该培养基含有自制的AB血清，这意味着无法 最优地保持标准条件，即质量无变异的恒定条件。使用三名具有潜伏TB的 受试者以及3名健康个体的血液样品实施了本发明的方法。为此目的如实施 例1a)项下所述分离了PBMC。对每份样品将5x10⁶个PBMC在2.5ml不 同的细胞培养基中分别在有或无10μg/ml结核菌素PPD的存在下在37℃、 5%CO₂的湿润气氛中温育6h。测试了下列培养基：B细胞培养基(BZM+)， B细胞培养基无IL-4(BZM-)，无血清UltraCULTURE^TM培养基(Ultra) (LONZA)和AIM V培养基(AIMV)(Invitrogen)。细胞裂解、RNA提取、cDNA 合成和qPCR均如实施例13描述进行。评估了IFNG和4-1BBL(又称TNFSF9) 的表达增加(见图16和图17)。IFNG的主预混物具有下述组成：300nM IFNG 正向引物GTGGAGACCATCAAGGAAGACAT(Biomers)，由SEQ ID NO:7 所示；300nM IFNG反向引物GGCGACAGTTCAGCCATCA(Biomers)，由 SEQ ID NO:8所示；200nM IFNG探针 FAM-TTCATGTATTGCTTTGCGTTGGACATTCAA-TMR(TIB MOLBIOL)， 由SEQ ID NO:9所示；1x快速通用PCR主预混物，1x基因表达测定TAF1A VIC探针标记的MGB探针(探针限定的)(Applied Biosystems)。TNFSF9的主预混物具有下述组成：300nM TNFSF9正向引物 GAGGGTCCCGAGCTTTCG(Biomers)，由SEQ ID NO:1所示；300nM TNFSF9反向引物GCCCATCGATCAGCAGAAC(Biomers)，由SEQ ID NO:2 所示；200nM TNFSF9探针FAM-CCACCAGCTGCGCAAACATGC-TMR (TIB MOLBIOL)，由SEQ ID NO:3所示；1x快速通用PCR主预混 物，1x基因表达测定TAF1A VIC探针标记的MGB探针(探针限定 的)(Applied Biosystems)。qPCR的温度曲线包括95℃变性20s，然后40个 由95℃3s和60℃30s组成的循环。qPCR在StepOnePlus实时PCR系统 (Applied Biosystems)上进行。

在UltraCULTURE^TM和AIM V培养基中刺激后IFNG表达(2^-ΔΔCq)的相对 增加显著强于常规的BZM+。从B细胞培养基中去除IL-4(BZM-)没有导致 信号增强(图16)。对于在UltraCULTURE^TM中的刺激，在潜伏TB患者的样 品和健康受试者的样品中检测不到TNFSF9表达的相对增加。相比之下，在 AIM V培养基中的刺激导致分别相比于B细胞培养基和UltraCULTURE^TM培养基的强的TNFSF9RNA表达的非特异性诱导(图17)。

这些分析显示，培养基的选择对于RTT标志物基因的相对表达可能具 有强的影响。使用LONZA的无血清UltraCULTURE^TM培养基导致潜伏TB 受试者的样品中在RTT标志物基因TNFSF9的恒定背景表达下IFNG信号的 显著增强。

实施例15:使用三重qPCR同步检测两种RTT标志物基因且同时针对 参比基因标准化

为了本发明RTT方法的简化和改善实施性能，同时为了扩展本发明RTT 方法的应用范围，开发了一种三重RT-qPCR，其容许在一个反应样品中同时 检测RTT标志物4-1BBL(又称TNFSF9)以及用于检测潜伏TB感染的标志物 IFN-γ(又称IFNG)，并且还容许使用参比基因来将信号标准化。如实施例12 所述按照本发明的方法处理具有潜伏TB的受试者的样品。qPCR用1μl cDNA，总反应体积为10μl，使用快速通用PCR主预混物(Fast Universal PCR Master Mix)(Applied Biosystems)来进行。主预混物具有下面 的组成：150nM TNFSF9正向引物GAGGGTCCCGAGCTTTCG(Biomers), 如SEQ ID NO:1所示；150nM TNFSF9反向引物 GCCCATCGATCAGCAGAAC(Biomers),由SEQ ID NO:2所示；200nM TNFSF9探针FAM-CCACCAGCTGCGCAAACATGC-BBQ(TIB MOLBIOL), 由SEQ ID NO:3所示；300nM IFNG正向引物 GTGGAGACCATCAAGGAAGACAT(Biomers)，如SEQ ID NO:7所示；300 nM IFNG反向引物GGCGACAGTTCAGCCATCA(Biomers)，由SEQ ID NO: 8所示；200nM IFNG Sonde BoTMR-TTCATGTATTGCTTTGCGTTGGACAT TCAA-BBQ(TIB MOLBIOL)，由SEQ ID NO:9所示；1x 快速通用 PCR主预混物，1x 基因表达测定TAF1A VIC染料标记的MGB探 针(引物限定的)(Applied Biosystems)。qPCR的温度曲线包括95℃变性20s， 然后40个由95℃3s和60℃30s组成的循环。qPCR在StepOnePlus实时 PCR系统(Applied Biosystems)上进行。在图18中描绘了对于具有潜伏性TB 的受试者的一个样品的比较性Cq分析(2^-ΔΔCq)的结果。给出的是三重qPCR 的结果(左)以及作为比较的相应二重qPCR的结果(右)。该二重qPCR的样品 是如实施例14中所述制备的。

这些比较性分析显示，在多重反应中检测RTT标志物，同时利用参比 基因将数值标准化，在理论上是可能的。

实施例16:两名受试者的结核菌素PPD刺激的PBMC中与未刺激样品 比较其他本发明RTT方法的标志物基因的表达的测定

为了实现本发明RTT方法的更高的灵敏度，使用SYBR绿系统进行 RT-qPCR测试了其他标志物基因。为此目的，分别根据如实施例12中描述 的本发明的方法处理潜伏TB患者以及健康受试者的样品。qPCR以1μl cDNA，总反应体积20μl，使用Brilliant III超快速SYBR绿QPCR主预混 物(Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix，Agilent Technologies 产)进行。主预混物具有下列组成：300nM正向引物，300nM反向引物，1x Brilliant III超快速SYBR绿QPCR主预混物，300nM参比染料。使用下列 引物对：FCGR1A/B/C正向引物GAAGGGGTGCACCGGAA(TIB MOLBIOL)，由SEQ ID NO:16所示;FCGR1A/B/C反向引物 CTCACGGGGAGCAAGTGG(TIB MOLBIOL)，由SEQ ID NO:17所示; CXCL9正向引物GAGTGCAAGGAACCCCAGTAGT，由SEQ ID NO:18所 示;CXCL9反向引物GGTGGATAGTCCCTTGGTTGGT，由SEQ ID NO:19 所示;CXCL10正向引物TCCACGTGTTGAGATCATTGC，由SEQ ID NO:20 所示;CXCL10反向引物TCTTGATGGCCTTCGATTCTG，由SEQ ID NO:21 所示;CXCL11正向引物CAAGGCTTCCCCATGTTCA，由SEQ ID NO:22所 示;CXCL11反向引物CCCAGGGCGTATGCAAAGA，由SEQ ID NO:23所 示(所有CXCL引物均来自Theresa Knoblach的博士论文，2010，Das Cytomegalievirus IE1-Protein als Regulator des humanen Transkriptoms und Zielstruktur RNAi-basierter Therapiestrategien，University of Regensburg)。 qPCR的温度曲线包括95°C变性3分钟，40个由95℃5s和60℃10s组成 的循环。qPCR在StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行。 图19中给出了两个样品的比较性C_q分析(2^ΔCq)的结果。

本项对潜伏TB感染患者和健康个体分别的经刺激和未刺激的样品的比 较分析提示这些基因可能适合作为检测潜伏TB疾病的标志物。