一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法

摘要

本发明公开了一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法，采用构建目标基因的敲除质粒和携带I-SceI基因的诱导质粒，通过接合转移导入嗜酸性氧化硫硫杆菌中，使用抗性标记筛选单交换子，使用蓝白筛选初筛双交换子。本发明首次建立了嗜酸性氧化硫硫杆菌的无标记基因敲除方法，首次将β-半乳糖苷酶蓝白筛选应用于双交换子的筛选，不仅能快速、稳定、高效地敲除目标基因，而且克服了已有无标记基因敲除流程中因缺少选择压力造成的筛选困难这一瓶颈，缩短了双交换子筛选时间、提高了筛选效率、减少了筛选成本，为嗜酸性氧化硫硫杆菌稳定的遗传改造提供了便利的新方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于同源重组原理的无标记基因敲除方法和基于β-半乳糖苷酶活性的 双交换子菌落筛选方法，尤其涉及一种高效筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌（A.thiooxidans）无标 记基因敲除菌株的方法。

背景技术

嗜酸性氧化硫硫杆菌（Acidithiobacillus thiooxidans，简称A.thiooxidans）是一种极端嗜 酸性、革兰氏阴性、专性化能自养细菌，能利用各种还原性或部分还原性无机硫化物（RISCs） 获得生长繁殖所需的能量，通过卡尔文循环固定空气中的CO₂作为主要碳源。在细菌冶金、 煤的脱硫等方面发挥了重要作用，作为一种重要的浸矿微生物，与嗜酸性氧化亚铁硫杆菌（A. ferrooxidans）联合浸矿能显著提高后者对硫化矿的浸出效率。但是由于A.thiooxidans的营养 类型为专性化能自养菌，具有生长缓慢、代时长和细胞得率低的特点，且对矿物中所含的某 些重金属离子缺乏抗性，不仅限制了A.thiooxidans的基础研究，而且限制了A.thiooxidans 的实际应用。为了深入研究A.thiooxidans的基因功能、代谢途径及其各种抗逆机制，构建高 效浸矿工程菌，提高A.thiooxidans的应用效能，必须使用分子生物学方法对其进行遗传改造， 因此，构建能对A.thiooxidans进行稳定遗传改造的体系是当下亟待解决的问题。

发明人的实验室在国际上率先在A.thiooxidans中建立了基于接合转移原理的遗传转移系 统，将具有接合转移功能的广泛宿主范围质粒从大肠杆菌中转入A.thiooxidans中（Jin SM,Yan WM and Wang ZN，Appl.Environ.Microbiol.,1992,Vol.58.No.1,429-430），并成功实现了外 源基因在A.thiooxidans中的异源表达，提高了A.thiooxidans外源有机质的利用能力（Tian,KL,. Lin JQ,Liu XM,Liu Y,Zhang CK and Yan WM,Biotechnol.Lett.,2003,Vol.25,No.10, 749-754）。但是以质粒形式携带外源基因在A.thiooxidans中进行表达的遗传改造方法存在以 下不足：稳定性差，必需使用抗生素保证质粒稳定存在于A.thiooxidans中；质粒上携带的外 源基因有限，不能对同一种菌多个遗传性状进行改造。无标记基因敲除——这一染色体水平 稳定的遗传操作技术不仅能解决上述问题，还将为A.thiooxidans的遗传改造提供一种新方法。

基因敲除技术是深入研究基因的功能、生长代谢途径关键酶和稳定改良生物遗传性状的 重要遗传操作手段。发明人在嗜酸性硫杆菌属的嗜酸性氧化亚铁硫杆菌（Wang H,Liu X,Liu S, Yu Y,Lin J,Lin J,Pang X,Zhao J，Appl.Environ.Microbiol.，2012,Vol.78,No.6,1826-1835， 刘相梅，王慧妍，于洋洋，刘双双，林建群，林建强，庞昕，极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的 无标记基因敲除方法，国家发明专利，专利号ZL201110188474.X，授权公告日2013,01,09） 以及发明人的实验室在嗜酸性硫杆菌属的嗜酸性喜温硫杆菌（林建群，吴燕，张成家，林建 强，嗜酸性喜温硫杆菌的基因无痕敲除和整合方法，国家发明专利，申请号201210089108.3， 申请公布日2012,07,25）中已经建立了基于同源重组原理的无标记基因敲除方法,使用该方 法敲除靶基因后，染色体上不存在抗生素抗性基因的残留，可适合基因组中多基因敲除和置 换的研究。但是，在嗜酸性硫杆菌属的嗜酸性氧化硫硫杆菌中还没有无标记基因敲除技术的 报道，阻碍了该菌的遗传改造和应用研究，而且在嗜酸性氧化亚铁硫杆菌和嗜酸性喜温硫杆 菌已有的无标记基因敲除技术中，双交换子失去了抗生素抗性基因，由于缺少选择压力以及 同源重组频率低，存在双交换子筛选非常困难的问题，成为整个敲除流程中的瓶颈，需要通 过分离纯化获得大量的单菌落，并对每个单菌落逐一进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测筛 选和验证，不仅耗时、耗力、效率低，还增加了实验的成本。

发明内容

针对以上嗜酸性氧化硫硫杆菌中尚未建立无标记基因敲除技术以及嗜酸性氧化亚铁硫杆 菌和嗜酸性喜温硫杆菌已有的无标记基因敲除技术中存在筛选效率低和工作量大的问题，本 发明提供了一种高效筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌（A.thiooxidans）无标记基因敲除菌株的方法。

本发明所述筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌（A.thiooxidans）无标记基因敲除菌株方法的技术 方案是：

构建含有大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ、酵母核酸内切酶I-SceI特异识别作用位点、 oriColE1复制原点、能进行接合转移的敲除质粒骨架，分别选择目标敲除基因上、下游长度 为0.5～2.0kb的同源序列作为上、下游同源臂，设计引物进行PCR扩增，经限制性内切酶酶 切后，按照在基因组上的方向分别克隆到敲除质粒骨架的多克隆位点中，构建目标基因的敲 除质粒，将目标基因的敲除质粒转化具有接合转移功能的E.coli S17-1λpir作为供体菌，通过 接合转移进入A.thiooxidans受体菌中，在含卡那霉素的平板上获得发生第一次同源重组使质 粒整合到受体菌染色体上的A.thiooxidans单交换子，通过以X-gal作为底物，对单交换子进 行蓝色菌落验证，进一步设计引物对蓝色菌落的单交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检 测验证，构建含有酵母核酸内切酶I-SceI基因、链霉素抗性基因以及接合转移功能的广泛宿 主范围特性的质粒作为诱导质粒，将诱导质粒转化具有接合转移功能的E.coli S17-1λpir作为 供体菌，通过接合转移导入A.thiooxidans单交换子中，在含链霉素的平板上获得导入诱导质 粒的接合转移子，I-SceI基因的表达产物I-SceI核酸内切酶能够切断染色体上的I-SceI位点， 诱导第二次同源重组，以X-gal作为底物，对获得的接合转移子进行白色菌落初筛，进一步 设计引物对白色菌落的双交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，筛选和验证发生了双交换 的突变株，对验证的目标基因敲除突变株在不添加抗生素的无选择压力条件下转接3～5次连 续传代培养，获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株。

上述敲除质粒骨架携带大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ，用于双交换子的高效筛选；携 带酵母核酸内切酶I-SceI特异识别作用位点，用于诱发第二次同源重组；携带多克隆位点 MCS，便于同源臂的插入；携带接合转移所需的元件oriT区，使得质粒能够通过接合转移进 入A.thiooxidans细胞中；携带酸性条件下对A.thiooxidans稳定有效的卡那霉素抗性基因，用 于单交换子筛选；携带oriColE1复制原点，能在大肠杆菌中复制、而不能在A.thiooxidans中 复制。

上述目标基因的敲除质粒是通过将要敲除目标基因上、下游长度为0.5～2.0kb的上、下 游同源臂，按照在基因组上的方向分别克隆至敲除质粒骨架的多克隆位点MCS中获得。

上述目标基因的敲除质粒是通过细菌转化方法转入具有接合转移功能的大肠杆菌E.coli S17-1λpir作为供体菌，通过接合转移的方法进入A.thiooxidans受体菌中。

上述含目标基因敲除质粒的供体菌与A.thiooxidans受体菌接合培养条件选28～32℃，5～ 9天，筛选发生了第一次同源重组的A.thiooxidans单交换子选含80～150ug/mL卡那霉素的 Starkey-Na₂S₂O₃固体培养基平板，28～32℃培养10～15天。

上述验证A.thiooxidans单交换子的方法是向卡那霉素抗性平板上的单菌落表面滴加 0.5～1.5uL浓度为5～20mg/mL的无菌X-gal溶液，28～35℃孵育20～40min；挑取蓝色菌落 至10～20uL无菌水中，取0.5～1.5uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电 泳检测验证。

上述诱导质粒携带酵母核酸内切酶I-SceI基因，能在A.thiooxidans中表达出有活性的 I-SceI，用于切割A.thiooxidans单交换子染色体上的I-SceI特异识别作用位点，诱发第二次 同源重组；携带广泛宿主范围特性的复制原点，能在大肠杆菌和A.thiooxidans中高拷贝自主 稳定复制，增加I-SceI酶的表达量，提高第二次同源重组的频率；携带接合转移必需的oriT 区，能通过接合转移导入A.thiooxidans中；携带在酸性条件下对A.thiooxidan稳定有效的链 霉素抗性基因，便于导入诱导质粒接合转移子的筛选。

上述诱导质粒是通过细菌转化方法转入具有接合转移功能的大肠杆菌E.coli S17-1λpir 作为供体菌，通过接合转移的方法进入A.thiooxidans单交换子中。

上述含诱导质粒的供体菌与A.thiooxidans单交换子受体菌接合培养条件选28～32℃， 48～72h，筛选导入诱导质粒的A.thiooxidans接合转移子选含80～150ug/mL链霉素的 Starkey-Na₂S₂O₃固体培养基平板，28～32℃培养10～15天。

上述初筛A.thiooxidans双交换子的方法是挑取链霉素平板上的接合转移子单菌落至20 mL含250～400ug/mL链霉素的Starkey-S⁰液体培养基中，28～32℃培养5～7天，按5～10% 的接种量转接20mL上述液体培养基中，28～32℃培养5～7天，取菌液稀释后涂布已涂布 80～150uL的5～20mg/mL X-gal的含80～150ug/mL链霉素的Starkey-Na₂S₂O₃培养基平 板，28～32℃培养10～15天，获得发生第二次同源重组的白色双交换子。

上述筛选和验证A.thiooxidans目标基因敲除突变株的方法是挑取链霉素平板上的白色双 交换子单菌落至10～20uL无菌水中，取0.5～1.5uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和 琼脂糖凝胶电泳，从中筛选和验证发生了双交换的突变株。

上述获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株的方法是将验证的目标基因 敲除突变株稀释后涂布Starkey-Na₂S₂O₃培养基平板，28～32℃培养10～15天，挑取平板上 的单菌落接种到20mL Starkey-S⁰液体培养基中，28～32℃培养5～7天；再继续如上转接3～ 5次连续传代培养，挑取单菌落至10～20uL无菌水中，取0.5～1.5uL菌液作模板，设计引 物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证质粒丢失。

上述Starkey-Na₂S₂O₃无机盐溶液配方为：(NH₄)₂SO₄6.0g/L，KH₂PO₂6.0g/L，MgSO₄﹒ 7H₂O1.0g/L，CaCl₂﹒2H₂O0.5g/L，pH4.8，121℃灭菌20min。

上述Starkey-Na₂S₂O₃固体培养基配方为：A液：(NH₄)₂SO₄0.6g，KH₂PO₂0.6g，MgSO₄﹒7H₂O1.0g，CaCl₂﹒2H₂O0.05g，蒸馏水100mL，pH4.8，121℃灭菌20min；B液：琼脂 粉2g，蒸馏水100mL，121℃灭菌20min；C液：Na₂S₂O₃2.0，FeSO₄﹒7H₂O0.006g溶解 至10mL蒸馏水中，过滤除菌；A液和B液高压灭菌后冷却至80℃混合，再加入C液混合， 制备固体平板。

上述Starkey-Na₂S₂O₃固体接合培养基配方为：在上述Starkey-Na₂S₂O₃固体培养基配方A 液中加入0.05％酵母粉。

上述Starkey-S⁰液体培养基配方为：(NH₄)₂SO₄2.0_g/L，KH₂PO₂3.0g/L，M_gSO₄﹒7H₂O0.5 g/L，CaCl₂﹒2H₂O0.25g/L，FeSO₄﹒7H₂O0.01g/L，浓H₂SO₄调节至pH2.5，121℃灭菌20min； 硫粉放入试剂瓶中密闭，煮沸3h灭菌，接种后按10g/L加入培养基中。

上述筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法中：

所述敲除质粒骨架优选插入大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ、oriColE1复制原点的大肠 杆菌质粒pKIT。

所述目标基因敲除质粒的构建优选将目标基因上、下游长度为0.9～1.1kb的上、下游同 源臂，按照在基因组上的方向分别克隆至敲除质粒骨架的多克隆位点MCS中。

所述含目标基因敲除质粒的供体菌与A.thiooxidans受体菌接合培养条件优选30℃，7天， 筛选发生了第一次同源重组的A.thiooxidans单交换子优选含100ug/mL卡那霉素的 Starkey-Na₂S₂O₃固体培养基平板，30℃培养12天，A.thiooxidans单交换子的复苏条件优选含 300μg/mL卡那霉素的Starkey-S⁰液体培养基，30℃培养6天。

所述以X-gal作为底物，对A.thiooxidans单交换子进行蓝色菌落验证优选向卡那霉素抗 性平板上的单菌落表面滴加1.0uL的12mg/mL的无菌X-gal溶液，30℃孵育30min。

所述诱导质粒优选插入I-SceI基因的广泛宿主范围特性质粒pJRD215。

所述含诱导质粒的供体菌与受体菌A.thiooxidans单交换子的接合培养条件优选30℃，60 h，筛选导入诱导质粒的A.thiooxidanss接合转移子优选含100μg/mL链霉素的Starkey-Na₂S₂O₃固体培养基平板，30℃培养12天。

所述以X-gal作为底物，对获得的接合转移子进行白色菌落初筛优选挑取链霉素平板上 的接合转移子单菌落至20mL含300ug/mL链霉素的Starkey-S⁰液体培养基中，30℃培养6 天，按7%的接种量转接20mL上述液体培养基中，30℃培养6天，取菌液稀释后涂布已涂 布100uL的12mg/mL X-gal的含100ug/mL链霉素的Starkey-Na₂S₂O₃培养基平板，30℃培 养12天，获得发生第二次同源重组的白色双交换子。

所述获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株优选通过不加链霉素的 Starkey-S⁰液体培养30℃培养6天和Starkey-Na₂S₂O₃固体平板30℃培养12天，连续转接4 次传代培养，获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株。

本发明针对A.thiooxidans中尚未建立无标记基因敲除技术以及嗜酸性氧化亚铁硫杆菌和 嗜酸性喜温硫杆菌已有的无标记基因敲除技术中存在筛选效率低和工作量大的问题，提出了 一种A.thiooxidans无标记基因敲除方法和利用β-半乳糖苷酶蓝白筛选高效筛选A. thiooxidans无标记基因敲除菌株的方法。本发明在国际上率先将无标记基因敲除技术应用于 A.thiooxidans，尤其率先将基于β-半乳糖苷酶活性的菌落筛选方法应用于A.thiooxidans无标 记基因敲除方法中，实现了通过菌落颜色简便、快捷筛选双交换子的目的，克服了嗜酸性氧 化亚铁硫杆菌和嗜酸性喜温硫杆菌已有的无标记基因敲除流程中因缺少选择压力造成的双交 换子筛选困难这一瓶颈，从而大大缩短了双交换子筛选的时间、提高了双交换子筛选的效率、 减少了筛选的成本。本发明建立的无标记基因敲除技术第一次同源重组的频率为2.46±1.21 ×10^-7；转接2次后发生第二次同源重组的频率为1.21±0.3×10^-2。

本发明能快速、稳定、高效地敲除A.thiooxidans的基因，尤其能利用β-半乳糖苷酶蓝白 筛选高效筛选A.thiooxidans基因敲除突变菌株，为A.thiooxidans中未知基因功能的研究和代 谢途径中关键酶作用机制的探索提供了便利，由于所得突变株不携带任何抗生素抗性基因， 可适合该菌株多基因的敲除和遗传改造研究，为今后深入研究A.thiooxidans，构建高效浸矿 A.thiooxidans基因工程菌安全地用于大规模工业生产提供了新途径。

附图说明

图1为用于基因敲除的敲除质粒骨架pZK19的结构示意图。

图2为A.thiooxidans多铜氧化酶基因（cueO）敲除流程图。

图3为含有酵母核酸内切酶I-SceI基因的诱导质粒pJRD215-I-SceI的结构示意图。

图4为利用β-半乳糖苷酶活性的菌落筛选方法筛选获得白色A.thiooxidans双交换子。

图5为A.thiooxidans cueO基因敲除菌株的PCR验证图。

图中：M,Tans2K PlusII DNA Marker,从上到下大小依次为8,000bp、5,000bp、3,000 bp、2,000bp、1,000bp、750bp、500bp；W，野生型A.thiooxidans基因组DNA为模板，扩 增片段大小为3.86kb；S，A.thiooxidans cueO基因敲除单交换子基因组DNA为模板，扩增 片段大小为2.7kb；D，A.thiooxidans cueO基因敲除菌基因组DNA为模板，扩增片段大小为 11.4kb；引物是CueOoutF和CueOoutR。

图6为A.thiooxidans cueR基因敲除流程图。

图7为A.thiooxidans copA基因敲除流程图。

具体实施方式

一般性说明：

本发明所用极端嗜酸性氧化硫硫杆菌标准菌株A.thiooxidans ATCC19377购自ATCC(美 国典型微生物菌种保藏中心)。所述质粒pKIT来源见Wang H,Liu X,Liu S,Yu Y,Lin J,Lin J, Pang X,Zhao J.Appl.Environ.Microbiol.，2012,Vol.78,No.6,1826-1835。所述质粒pUC19RP12 的来源见Gyorgy Posfai,Vitaliy Kolisnychenko,Zsuzsa Bereczki,Frederick R Blattner.Nucleic  Acids Research,1999,27:4409～4415。所述质粒pJRD215来源见Davison J,Heusterspreute M, Chevalier M,Ha-Thi V,Brunel F.Gene,1987,Vol.51,No.2-3,275-280。所述质粒pUC19购自上 海生工生物工程技术有限公司。所述大肠杆菌菌株JM109和K12购自TaKaRa公司。所述大 肠杆菌菌株S17-1λpir购自济南鑫兴生物科技有限公司。所用琼脂糖凝胶回收试剂盒Gel  Extraction Kit、质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I和细菌基因组提取试剂盒Bacterial DNA Kit 均购自Omega生物技术有限公司。所用DNA聚合酶rTaq DNA Polymerase和PrimerSTAR  HS DNA Polymerase购自TAKARA公司，TranStart FastPfu DNA Polymerase和TranFast Taq  DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司。所用限制性核酸内切酶和T4DNA连接 酶购自TAKARA公司。所用X-gal购自上海生工生物工程技术有限公司。Tans2K PlusII Marker 购自北京全式金生物技术有限公司。

实施例1：极端嗜酸性氧化硫硫杆菌多铜氧化酶基因（cueO）的无标记敲除

1．敲除质粒骨架pZK19的构建

（1）质粒pK19的构建

根据质粒pUC19的序列信息设计引物扩增其复制原点oriColE1部分：

19F：5′-CAGCGAGCTCGGGATAACGCAGGAAAGA-3′

19R：5′-CAAAGGGCCCTAATAGACTGGATGGAGGCG-3′

引物19F的5’端加入Sac I酶切位点，引物19R的5’端加入Apa I酶切位点。两引物以 质粒pUC19为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)扩增获得带有pUC19oriColE1的片段。PCR 反应体系(25uL)组成如下：5×PrimerSTAR Buffer(Mg²⁺plus)5uL；dNTP Mixture(各2.5mM) 2uL；引物19F(10uM)0.25uL；引物19R(10uM)0.25uL；质粒pUC19模板0.25uL； PrimerSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/uL)0.25uL；水17uL。

PCR反应条件：98℃预变性3min，98℃变性10s，57℃退火10s，72℃延伸1min10s， 30个循环后72℃延伸5min，4℃保存。PCR扩增产物大小为1.11kb。

根据质粒pKIT的序列信息设计引物扩增其多克隆位点MCS、接合转移元件oriT、卡那 霉素抗性基因Km^r及酵母核酸内切酶I-SceI特异识别作用位点部分：

KITF：5′-ATACGAGCTCCACCGCGGTG-3′

KITR：5′-CGCGGGGCCCCGATCTCAAGAAGATCATC-3′

引物KITF5’端加入Sac I酶切位点，引物KITR5’端加入Apa I酶切位点。两引物以质粒 pKIT为模板，通过PCR扩增获得带有pKIT的多克隆位点MCS、接合转移元件oriT、卡那 霉素抗性基因Km^r及酵母核酸内切酶I-SceI特异识别作用位点的片段。PCR反应体系(25uL) 组成如下：5×PrimerSTAR Buffer(Mg²⁺plus)5uL；dNTP Mixture(各2.5mM)2uL；引物KITF (10uM)0.25uL；引物KITR(10uM)0.25uL；质粒pKIT模板0.25uL；PrimerSTAR HS DNA  Polymerase(2.5U/uL)0.25uL；水17uL。PCR反应条件同上，扩增产物大小为1.52kb。

将以上两种PCR扩增产物分别用琼脂糖凝胶分离后，用Gel Extraction Kit纯化回收，再 用Sac I和Apa I两种限制性内切酶进行酶切，用T4DNA连接酶连接，转化E.coli JM109感 受态细胞，获得2.6kb的中间质粒pK19。

（2）敲除质粒骨架pZK19的构建

根据NCBI上E.coli K12MG1655基因组中β-半乳糖苷酶基因（lacZ）序列信息，设计 该基因上、下游引物扩增lacZ基因：

lacZ-F：5′-TTAGGTACCCATTAGGCACCCCAGGCT-3′

lacZ-R：5′-GGTAGGTACCGCGAAATACGGGCAGACAT-3′

在两引物的5’端都加入了Kpn I酶切位点，以E.coli K12的基因组DNA为模板，通过 PCR扩增获得带有lacZ基因的片段。PCR反应体系（25uL）组成如下：5×TranStart FastPfu  Buffer5uL；dNTP Mixture(各2.5mM)2uL；引物lacZ-F(10uM)0.5uL；引物lacZ-R(10uM) 0.5uL；E.coli K12基因组DNA模板1uL；5×PCR Stimulant2.5uL；TranStart FastPfu DNA  Polymerase0.5uL；水13uL。

PCR反应条件：94℃预变性2min，94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min40s， 30个循环后72℃延伸5min，4℃保存。PCR扩增产物大小为3.17kb。

将PCR扩增产物用琼脂糖凝胶分离后用Gel Extraction Kit纯化回收，用Kpn I限制性内 切酶进行酶切，同时将中间质粒pK19也用Kpn I酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接， 转化E.coli JM109感受态细胞，获得5.77kb的敲除质粒骨架pZK19（图1）。

2．A.thiooxidans多铜氧化酶基因（cueO）敲除质粒pZKC19的构建

A.thiooxidans多铜氧化酶基因（cueO）敲除流程图见图2。

根据NCBI上公布的A.thiooxidans标准菌株ATCC19377的基因组序列信息，设计引物 分别扩增cueO基因上、下游部分片段作为敲除该基因的上、下游同源臂：

CUHF：5′-GAGAAGCTTGAAGATGCCATTCACTCCG-3′

CUHR：5′-ATAAGGATCCCAGTGGGTGGTTGTGCTCT-3′

CDHF：5′-GACGGATCCATCATTGCCACATGCTGGAACAC-3′

CDHR：5′-GATTCTAGATACAGTTTAATCCAGCCTATGCAGC-3′

在引物CUHF的5’端加入Hind III酶切位点，在引物CUHR和CDHF的5’端加入BamH I酶切位点，在引物CDHR的5’端加入Xba I酶切位点。引物对CUHF/CUHR和CDHF/CDHR， 分别以A.thiooxidans ATCC19377基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得用于敲除cueO基 因的上、下游同源臂片段。PCR反应体系(25uL)组成如下：5×PrimerSTAR Buffer(Mg²⁺plus) 5uL；dNTP Mixture(各2.5mM)2uL；引物对CUHF/CUHR或CDHF/CDHR(10uM)各0.25 uL；A.thiooxidans ATCC19377基因组DNA模板0.25uL；PrimerSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/uL)0.25uL；水17uL。

PCR反应条件：98℃预变性3min，98℃变性10s，58℃(引物对CUHF/CUHR)或55℃(引 物对CDHF/CDHR)退火10s，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸5min，4℃保存。PCR 扩增的上、下游同源臂产物大小都为0.93kb。

将以上PCR产物用Gel Extraction Kit纯化后，上游同源臂片段用Hind III和BamH I酶 切，同时质粒pZK19也用这两种酶进行酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，转化E.coli  JM109感受态细胞，获得重组质粒pZK19-CUH。然后将下游同源臂用BamH I和Xba I酶切， 同时将重组质粒pZK19-CUH也用BamH I和Xba I酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接， 转化E.coli JM109感受态细胞，获得cueO基因敲除质粒pZKC19。

3．A.thiooxidans cueO基因敲除单交换子的获得

（1）质粒pZKC19导入A.thiooxidans ATCC19377

将质粒pZKC19转化E.coli S17-1λpir，E.coli S17-1λpir(pZKC19)作为接合转移供体菌， 野生型A.thiooxidans ATCC19377作为接合转移受体菌。将受体菌培养在Starkey-S⁰液体培养 基中，30℃，180rpm，6天至对数后期，3,000rpm离心30s去除硫粉，10,000rpm离心2min 收集菌体；供体菌37℃，150rpm培养4h至对数中期，8,000rpm离心1min收集菌体。收 集的菌体分别用Starkey-Na₂S₂O₃无机盐溶液洗涤两次，按供体菌:受体菌1:1.5的比例混匀, 涂在放置于Starkey-Na₂S₂O₃接合培养基平板的0.22um滤膜上，30℃培养7天。

用Starkey-Na₂S₂O₃无机盐溶液将滤膜上的接合菌液洗脱下来，经梯度稀释后涂布到含100 ug/mL卡那霉素的Starkey-Na₂S₂O₃固体培养基平板上，30℃培养12天，平板上长出单菌落。

（2）发生第一次同源重组的A.thiooxidans cueO基因敲除单交换子的验证

发生第一次同源重组的A.thiooxidans单交换子染色体上含有来自质粒pZKC19的卡那霉 素抗性基因，因此在含100ug/mL卡那霉素的Starkey-Na₂S₂O₃固体培养基平板上长出的单菌 落即是A.thiooxidans cueO基因敲除单交换子。

向平板上的单菌落表面滴加1.0uL浓度为12mg/mL的无菌X-gal溶液，30℃孵育30min， 菌落呈蓝色。挑取蓝色菌落至10～20uL无菌水中，取1.0uL菌液作模板，设计引物进行PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证。分别用以下引物：

Plasmid-F：5′-CGGATTGACCGTAATGGGAT-3′

CueOinR：5′-CATTGATGAGAAAGCGGTTACC-3′

验证I型单交换子，PCR扩增产物大小为2.05kb（图2）。

CueOinF：5′-GCACGGAAATCTGGGAAGTC-3′

Plasmid-R：5′-CAGTGGCGATAAGTCGTGTC-3′

验证II型单交换子，PCR扩增产物大小为1.59kb（图2）。

PCR反应体系(25uL)组成如下：10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)2.5uL；dNTP Mixture(各2.5 mM)2uL；引物对Plasmid-F/CueOinR或CueOinF/Plasmid-R(10uM)各0.3uL；菌液模板1uL； rTaq DNA Polymerase(5U/uL)0.125uL；水18.775uL。

PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，30 个循环后72℃延伸5min，4℃保存。

根据计数抗性平板上的单菌落数，获得质粒pZKC19转入A.thiooxidans ATCC19377并整 合在其染色体上的接合转移频率，即第一次同源重组的频率约为2.46±1.21×10^-7。

4．诱导质粒pJRD215-I-SceI的构建

用EcoR I和Sal I酶切质粒pUC19RP12，琼脂糖凝胶电泳分离后用Gel Extraction Kit纯 化回收0.82kb的条带，该片段含有酵母核酸内切酶I-SceI基因，与同样经EcoR I和Sal I酶 切的质粒pJRD215连接，转化E.coli JM109感受态细胞，获得重组质粒pJRD215-I-SceI，见 图3。

5．A.thiooxidans cueO基因敲除突变株的获得

（1）质粒pJRD215-I-SceI导入A.thiooxidans cueO基因敲除单交换子

将质粒pJRD215-I-SceI转化E.coli S17-1λpir，E.coli S17-1λpir(pJRD215-I-SceI)作为接 合转移供体菌，A.thiooxidans cueO基因敲除单交换子作为接合转移受体菌。受体菌培养在 Starkey-S⁰液体培养基中，30℃，180rpm，6天至对数后期，3,000rpm离心30s去除硫粉， 10,000rpm离心2min收集菌体；供体菌37℃，150rpm培养4h至对数中期，8,000rpm离心 1min收集菌体。将收集的菌体分别用Starkey-Na₂S₂O₃无机盐溶液洗涤两次，按供体菌:受体 菌1:1.5的比例混匀,涂在放置于Starkey-Na₂S₂O₃接合培养基平板的0.22um滤膜上，30℃ 培养60h。

用Starkey-Na₂S₂O₃无机盐溶液将滤膜上的接合菌液洗脱下来，经梯度稀释后涂布到含100 ug/mL链霉素的Starkey-Na₂S₂O₃固体培养基平板上，30℃培养12天，平板上长出单菌落。

（2）发生第二次同源重组的A.thiooxidans cueO基因敲除突变株的初筛和验证

诱导质粒上携带链霉素抗性基因，在链霉素培养基平板上长出的单菌落是导入了诱导质 粒的接合转移子，诱导质粒上的I-SceI基因表达产生酵母核酸内切酶I-SceI，诱导发生第二次 同源重组，同时交换下来整合在染色体上的lacZ基因和卡那霉素抗性基因。所以，双交换子 没有β-半乳糖苷酶活性，也失去了卡那霉素抗性选择压力。

挑取链霉素平板上的接合转移子单菌落至20mL含300ug/mL链霉素的Starkey-S⁰液体 培养基中，30℃培养6天，按7%的接种量转接至20mL上述液体培养基中，30℃培养6天， 取菌液稀释后涂布已涂布100uL12mg/mL X-gal的含100ug/mL链霉素的Starkey-Na₂S₂O₃ 培养基平板，30℃培养12天，白色菌落即是发生了第二次同源重组的双交换子（图4）。传 代2次后发生第二次同源重组的频率为1.21±0.3×10^-2。

双交换子中包括回复为野生型和cueO基因敲除突变株两种类型（原理见图2），挑取初 筛为双交换子的白色菌落至10～20uL无菌水中，取1.0uL菌液作模板，设计引物进行PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳，从中筛选和验证cueO基因敲除突变株（图5）。用以下引物：

CueOoutF：5′-CCCTTCATTTCCGTTCATCTG-3′

CueOoutR：5′-ACGGATTTCCTGAAGAACCC-3′

PCR反应体系(25uL)组成如下：10×TransFast Taq Buffer2.5uL；dNTP Mixture(各2.5mM) 2uL；引物CueOoutF(10uM)0.25uL引物CueOoutR(10uM)0.25uL；菌液模板1uL；TansFast  Taq DNA Polymerase(2.5U/uL)0.25uL；水18.75uL。

PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性5s，56℃退火15s，72℃延伸2min，30 个循环后72℃延伸5min，4℃保存。

PCR扩增产物大小：cueO基因敲除突变株为2.7kb，野生菌菌株为3.86kb（图5）。

（2）A.thiooxidans cueO基因敲除突变株中诱导质粒的丢失

将PCR扩增验证正确的cueO基因敲除突变株稀释后涂布不含抗生素的Starkey-Na₂S₂O₃培养基平板，30℃培养12天，挑取平板上的单菌落接种到20mL Starkey-S⁰液体培养基中， 30℃培养6天，再继续如上转接4次连续传代培养，挑取单菌落至10～20uL无菌水中，取 1.0uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证质粒丢失。用以下引 物：

SceIF：5′-GGTCCGAACTCTAAACTGCTG-3′

SceIR：5′-GGGATCAGGTACGGTTTGATC-3′

PCR反应体系(25uL)组成如下：10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)2.5uL；dNTP Mixture(各2.5 mM)2uL；引物SceIF(10uM)0.25uL引物SceIR(10uM)0.25uL；菌液模板1uL；rTaq DNA Polymerase(5U/ul)0.125uL；水18.875uL。

PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，30

个循环后72℃延伸5min，4℃保存。PCR扩增诱导质粒上I-SceI基因片段，产物大小为0.62 kb，电泳检测若无该扩增条带，则证明质粒已丢失。获得质粒丢失的A.thiooxidanscueO基因 敲除突变株。

实施例2：嗜酸性氧化硫硫杆菌MerR家族调控蛋白基因（cueR）的无标记敲除

1．A.thiooxidans cueR基因敲除质粒的构建

A.thiooxidans cueR基因敲除流程图见图6。敲除质粒骨架pZK19的构建同实施例1（略）。

根据NCBI上公布的A.thiooxidans标准菌株ATCC19377的基因组序列信息，设计引物 分别扩增cueR基因上、下游部分片段作为敲除该基因的上、下游同源臂：

RUHF：5′-AAGTCGACCGTGCGTGATGTGGGTTAT-3′

RUHR：5′-CCAAGCTTGACTGAATTTTCACGCTCC-3′

RDHF：5′-CCAAGCTTTGGGATGTGAGTCGGGATC-3′

RDHR：5′-TTTCTAGAGGGTCACCAGCGCGGGAAC-3′

在引物RUHF的5’端加入Sal I酶切位点，在引物RUHR和RDHF的5’端加入Hind III 酶切位点，在引物RDHR的5’端加入Xba I酶切位点。引物对RUHF/RUHR和RDHF/RDHR， 分别以A.thiooxidans ATCC19377基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得用于敲除cueR基 因的上、下游同源臂片段。PCR反应体系(25uL)组成如下：5×PrimerSTAR Buffer(Mg²⁺plus) 5uL；dNTP Mixture(各2.5mM)2uL；引物对RUHF/RUHR或RDHF/RDHR(10uM)各0.25 uL；A.thiooxidans ATCC19377基因组DNA模板0.25uL；PrimerSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/uL)0.25uL；水17uL。

PCR反应条件：98℃预变性3min，98℃变性10s，59℃退火10s，72℃延伸1min，30 个循环后72℃延伸5min，4℃保存。PCR扩增的上、下游同源臂产物大小都为0.93kb。

将以上PCR产物用Gel Extraction Kit纯化后，上游同源臂片段用Sal I和Hind III酶切， 同时质粒pZK19也用这两种酶进行酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，转化E.coli  JM109感受态细胞，获得重组质粒pZK19-RUH。然后将下游同源臂用Hind III和Xba I酶切， 同时将重组质粒pZK19-RUH也用Hind III和Xba I酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接， 转化E.coli JM109感受态细胞，获得cueR基因敲除质粒pZKR19（图6）。

2．A.thiooxidans cueR基因敲除单交换子的获得

（1）质粒pZKR19导入A.thiooxidans ATCC19377

将质粒pZKR19转化E.coli S17-1λpir，E.coli S17-1λpir(pZKR19)作为接合转移供体菌， 野生型A.thiooxidans ATCC19377作为接合转移受体菌。接合转移子的获得与实施例1相同 （略）。

（2）发生第一次同源重组的A.thiooxidans cueR基因敲除单交换子的验证

发生第一次同源重组的A.thiooxidans cueR基因敲除单交换子的验证同实施例1（略）， 其中设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证的引物如下：

Plasmid-F：5′-CGGATTGACCGTAATGGGAT-3′（同实施例1）

CueRinR：5′-GTCAGGGAAAAACCCAGATTC-3′

验证I型单交换子，PCR扩增产物大小为1.87kb（图6）。

CueRinF：5′-CGGCCATGGTTCAGTAGAC-3′

Plasmid-R：5′-CAGTGGCGATAAGTCGTGTC-3′（同实施例1）

验证II型单交换子，PCR扩增产物大小为1.46kb（图6）。

3．A.thiooxidans cueR基因敲除突变株的获得

诱导质粒pJRD215-I-SceI的构建、诱导质粒pJRD215-I-SceI转入A.thiooxidans cueR基因 敲除单交换子、使用基于β-半乳糖苷酶活性的菌落筛选方法初筛发生了第二次同源重组的双 交换子等原理与操作与实施例1相同（略）。

双交换子中包括回复为野生型和cueR基因敲除突变株两种类型，挑取初筛为双交换子的 白色菌落至10～20uL无菌水中，取1.0uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝 胶电泳，从中筛选和验证cueR基因敲除突变株。PCR反应体系的组成和PCR反应条件同实 施例1（略）。其中使用的引物为：

CueRoutF：5′-CGGGGTCGCATTACTGGTT-3′

CueRoutR：5′-CTACAGCAACCAGCATTGAAGGC-3′

PCR扩增产物大小：cueR基因敲除突变株为1.15kb，野生菌菌株为1.65kb（图6）。

A.thiooxidans cueR基因敲除突变株中诱导质粒的丢失操作及验证与实施例1相同（略）。

实施例3：嗜酸性氧化硫硫杆菌copA基因的无标记敲除

1．A.thiooxidans copA基因敲除质粒的构建

A.thiooxidans copA基因敲除流程图见图7。敲除质粒骨架pZK19的构建见实施例1（略）。

根据NCBI上公布的A.thiooxidans标准菌株ATCC19377的基因组序列信息，设计引物 分别扩增copA基因上、下游部分片段作为敲除该基因的上、下游同源臂：

AUHF：5′-TATGTCGACCGATCCAGTGCCATTTCCAG-3′

AUHR：5′-GTGAAGCTTCTGCAGGAAGCACAGGTCATC-3′

ADHF：5′-CTCAAGCTTCGTTTGAAGTGGCTGCGTC-3′

ADHR：5′-CTTTCTAGAAGCCAGGTTGCCAGACCATC-3′

在引物AUHF的5’端加入Sal I酶切位点，在引物AUHR和ADHF的5’端加入Hind III 酶切位点，在引物ADHR的5’端加入Xba I酶切位点。引物对AUHF/AUHR和ADHF/ADHR， 分别以A.thiooxidans ATCC19377基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得用于敲除copA基 因的上、下游同源臂片段。PCR反应体系组成及PCR反应条件与实施例2相同（略）。

上、下游同源臂片段克隆至敲除质粒骨架pZK19上获得copA基因敲除质粒pZKA19（同 实施例2，略）（图7）。

2．A.thiooxidans copA基因敲除单交换子的获得

copA基因敲除质粒pZKA19导入A.thiooxidans ATCC19377获得接合转移子的操作与实 施例1相同（略）。

发生第一次同源重组的A.thiooxidans copA基因敲除单交换子的筛选和验证（同实施例1， 略），其中设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证的引物如下：

Plasmid-F：5′-CGGATTGACCGTAATGGGAT-3′（同实施例1）

CopAinR：5′-CTCAAATTCACGCTGGCCTG-3′

验证I型单交换子，PCR扩增产物大小为2.87kb（图7）。

CopAinF：5′-GGATTTCAGCTGAATCCCATGC-3′

Plasmid-R：5′-CAGTGGCGATAAGTCGTGTC-3′（同实施例1）

验证II型单交换子，PCR扩增产物大小为1.95kb（图7）。

3．A.thiooxidans copA基因敲除突变株的获得

诱导质粒pJRD215-I-SceI的构建、诱导质粒pJRD215-I-SceI转入A.thiooxidans copA基 因敲除单交换子、使用基于β-半乳糖苷酶活性的菌落筛选方法初筛发生了第二次同源重组的 双交换子等原理与操作与实施例1相同（略）。

双交换子中包括回复为野生型和copA基因敲除突变株两种类型，挑取初筛为双交换子的 白色菌落至10～20uL无菌水中，取1.0uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝 胶电泳，从中筛选和验证copA基因敲除突变株。PCR反应体系的组成和PCR反应条件同实 施例1（略）。其中使用的引物为：

CopAoutF：5′-CGATATGCCGGTCTTGAAAC-3′

CopAoutR：5′-CGTAAAATGGTGACATCACTGC-3′

PCR扩增产物大小：copA基因敲除突变株为3.15kb，野生菌菌株为5.51kb（图7）。

A.thiooxidans copA基因敲除突变株中诱导质粒的丢失操作及验证与实施例1相同（略）。

以上具体描述了本发明技术方案的操作实例，不视为对本发明的应用限制。凡操作条件 的等同替换，均在本发明的保护范围之内。