从西藏灵菇中分离的一株嗜热链球菌及分离方法及应用

摘要

一种从西藏灵菇中分离的一株嗜热链球菌及分离方法及应用，属于微生物技术领域，其特征是：在M17培养基平板上划线分离，42℃培养48h，菌落为圆形，凸起，边缘整齐，颜色乳白色，挑取能拉丝，不透明，表面湿润光滑，菌体呈球状，多排列成长短不一的链状，不产芽孢；过氧化氢酶实验阴性，革兰氏染色阳性，硝酸盐还原实验阴性，无运动性、需氧或兼性厌氧生长，不液化明胶，不产生硫化氢，吲哚实验阴性；15℃不生长；生长温度为37-45℃；最高和最低初始生长pH为9.0和4.0，生长初始pH为6.5-7.0。有益效果是：嗜热链球菌在42℃条件下用M17培养液发酵30h产胞外多糖的量达到最高值为111mg/L；利用本发明所提供的菌株制备发酵酸乳可降低增稠剂和稳定剂的用量。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域。 

背景技术

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）为革兰氏阳性菌，通常与保加利亚乳杆菌共同用作酸奶的发酵剂，是酸奶发酵剂的重要组成菌株，它可通过发酵牛乳产生乳酸、胞外多糖以及特征性风味物质，赋予了酸奶产品独特的质地和风味。嗜热链球菌发酵特性的差异直接影响到酸奶产品的质量，而且不同菌株的发酵特性也存在着显著差异，所以筛选具有优良特性的嗜热链球菌是成功制备酸奶发酵剂的基础。 

乳业发达的西方国家对嗜热链球菌浓缩型乳酸菌发酵剂的研制，目前已实现商业化生产。而国内对嗜热链球菌发酵剂制备不完善、菌株活力差、生产发酵乳质地差等问题导致产业化应用程度不高。随着我国乳品工业化的发展，对嗜热链球菌发酵剂的需求将日渐增大，其应用前景广阔。 

发明内容

本发明的目的是：提供从西藏灵菇中分离的一株嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）TIMR0705-117及分离方法及应用，它为生产酸乳制品提供了一种高效、优质菌种。 

本发明的嗜热链球菌TIMR0705-117生物学特性是：在M17培养基平板上划线分离，42℃培养48h，菌落为圆形，凸起，边缘整齐，颜色乳白色，挑取能拉丝，不透明，表面湿润光滑，菌体呈球状，多排列成长短不一的链状，不产芽孢。过氧化氢酶实验阴性，革兰氏染色阳性，硝酸盐还原实验阴性，无运动性、需氧或兼性厌氧生长，不液化明胶，不产生硫化氢，吲哚实验阴性。15℃不生长。最适生长温度为37-45℃；最高和最低初始生长pH 为9.0和4.0，最适生长初始pH 为6.5-7.0；在42℃条件下用M17培养液进行培养的延迟期相对较短，培养2小时即进入对数生长期，10小时达到稳定期。 

所述嗜热链球菌发酵剂中的所述嗜热链球菌TIMR0705-117的含量为10⁹-10¹⁰cfu/mL。 

本发明的方法是： 

将嗜热链球菌TIMR0705-117接种于M17培养液中，在42℃条件下培养8-10小时进行活化，连续活化两代，获得活化培养液；将所述活化培养液按体积百分含量为2%—4%的量接种于M17培养液中，在42℃条件下培养8—10小时，4℃条件下6000r/min离心10min，将沉淀用无菌乳悬浮。

本发明的应用是：作为酸乳发酵剂。 

在作为酸乳发酵剂时，按体积百分含量为3—5%的量向原料乳中加入所述嗜热链球菌发酵剂，并按体积百分含量为3—5%的量向所述原料乳中加入与所述嗜热链球菌共生的保加利亚乳杆菌发酵剂后进行发酵，获得滴定酸度以乳酸计0.6—0.7的发酵液即为所述发酵食品。 

嗜热链球菌TIMR0705-117与所述保加利亚乳杆菌发酵剂中所述保加利亚乳杆菌加入所述原料乳中的体积比例为1：1。 

所述嗜热链球菌共生的保加利亚乳杆菌发酵剂中的保加利亚乳杆菌具体为中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）的保藏编号为6047的德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）；其在所述保加利亚乳杆菌发酵剂中的活菌含量为10¹⁰cfu/mL。 

本发明的有益效果是：嗜热链球菌在42℃条件下用M17培养液发酵30h产胞外多糖的量达到最高值为111mg/L；在原料乳鲜奶中按体积百分含量为3—5%添加含10⁹cfu/mL所述嗜热链球菌TIMR0705-117的工作发酵剂和相同量的含保加利亚乳杆菌10¹⁰cfu/mL的发酵剂获得的以乳酸计酸度为0.6—0.7的发酵酸乳，与对照样（添加商品发酵剂）相比，在冷藏期间（第1天—第28天），粘度和凝胶强度明显提高，持水力在第21天以后也明显提高。利用本发明所提供的菌株制备发酵酸乳可降低增稠剂和稳定剂的用量，本发明在发酵食品领域具有广阔的应用前景。 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

下述实施例中所用培养基的制备方法如下： 

还原脱脂乳培养基(RSM)：将脱脂乳粉按照11%（W/V）用水还原制成脱脂乳培养基，115℃灭菌15min。

MRS培养基：蛋白胨 10.0g,牛肉膏 10.0g,酵母膏 5.0g,柠檬酸铵 2.0g,葡萄糖 20.0g,吐温80 1.0mL,乙酸钠 5.0 g,磷酸氢二钾 2.0g,硫酸镁 0.5g,硫酸锰 0.25g, 蒸馏水1L。将各成分加入水中加热溶解，调pH6.6，121℃灭菌15min，冷却备用。 

纯化增菌培养基（M17培养液）：大豆蛋白胨5.0g，蛋白胨2.5g，酵母提取物5.0g，酪蛋白胨2.5g，抗坏血酸0.5g，牛肉浸膏5.0g，β-甘油磷酸二钠19g，MgSO4·7H2O 0.25g，蒸馏水1L。将各成分加入水中加热溶解，调pH7.0，121℃灭菌15min，冷却备用。 

纯化培养基平板（M17培养基平板）：上述1L的M17培养液中加入琼脂15g后121℃灭菌15min，冷却备用。 

商品发酵剂：Danisco YO-MIX 300。 

实施例1： 

一、菌株的分离 

本发明从中国传统发酵制品西藏灵菇的微生物群落中分离筛选菌株。将西藏灵菇接种至RSM中，于42℃培养8h至牛乳凝固。取凝乳逐级稀释涂布于M17培养基平板，42℃培养 48-72h，待菌落形成后，用接种环或接种针挑取可疑菌落，接种于M17培养液中，置42℃培养8-10h。待分离菌株生长良好后，再次划线接种于M17 培养基平板，置42℃培养48-72h。将培养好的单菌落接种M17培养液纯化增菌培养的同时进行涂片，筛选出多株革兰氏阳性、过氧化氢酶实验阴性双球状或链状排列的乳酸球菌。纯化后的菌株接种到M17培养液培养后，加入20%甘油，-80℃冰箱保存备用。

二、菌株的鉴定 

1、形态特征

将步骤一分离获得的菌株TIMR0705-117在M17培养基平板上划线分离，42℃培养48h，菌株生长良好。菌落为圆形，凸起，边缘整齐，颜色乳白色，挑取能拉丝，不透明，表面湿润光滑。菌体呈球状，多排列成长短不一的链状，不产芽孢。

2、生理生化试验 

步骤一分离获得的菌株TIMR0705-117为H2O2酶实验阴性，革兰氏染色阳性，硝酸盐还原实验阴性，无运动性、需氧或兼性厌氧生长，不液化明胶，不产生硫化氢，吲哚实验阴性。

3、培养特性 

步骤一分离获得的菌株TIMR0705-117在45℃生长良好，15℃不生长。最适生长温度为37—42℃；最高和最低初始生长pH 为9.0和4.0，最适生长初始pH 为6.5-7.0； 菌株TIMR0705-117在42℃条件下用M17培养液进行培养的延迟期相对较短，培养2小时即进入对数生长期，10小时达到稳定期；产生的胞外多糖在42℃条件下用M17培养液发酵培养30小时达到最高值，为111mg/L。

4、糖发酵试验鉴定菌株 

挑取少许菌株TIMR0705-117培养物划线于M17培养基平板是上42℃培养48-72小时。从平板上挑取单菌落，接入API 50CH液体培养基（生物梅里埃中国有限公司， API 50CH Medium）中制成菌悬液，接入API 50 CH鉴定试剂条(生物梅里埃中国有限公司)，42℃培养48-72小时，记录菌株对49 种碳水化合物的发酵结果，将其输入梅里埃公司的鉴定软件API LAB PLUS，反应结果如表1所示。经数据库查询，菌株TIMR0705-117与嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）具有99.9% 的相似性，因此，将菌株TIMR0705-117初步鉴定为嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）。

表1. 菌株TIMR0705-117 API鉴定结果 

检测项目结果检测项目结果甘油-苦杏仁苷-赤癣醇-七叶灵-D-阿拉伯糖-熊果苷-L-阿拉伯糖-柳醇-核糖-纤维二糖-D-木糖-麦芽糖-L-木糖-乳糖+阿东醇-蜜二糖-β-甲基-D-苷-蔗糖+半乳糖-海藻糖-葡萄糖+菊糖-果糖-松三糖-甘露糖-棉籽糖-山梨糖-淀粉-鼠李糖-糖原-卫茅醇-木糖醇-肌醇-拢牛儿糖-甘露醇-D-松二糖-山梨醇-D-来苏糖-α-甲基-D-甘露糖苷-D-塔格糖-α-甲基-D-葡萄糖苷-D-岩糖-D-阿拉伯糖醇-L-岩糖-L-阿拉伯糖醇-2-酮基-葡萄糖酸盐-葡萄糖酸盐-5-酮基-葡萄糖酸盐-N-乙酰-葡萄胺-  

注：“+”反应阳性；“-”反应阴性。

依据上述形态特征、生理生化特征等微生物学特性将菌株TIMR0705-117鉴定为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，并于2013年1月21日保藏于中国微生物菌种保藏理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.7183。 

嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-117工作发酵剂的制备 

将步骤一获得的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-117。活化培养液按体积百分含量为2%—4%的量接种于M17培养液中，在42℃条件下培养8—10小时，4℃条件下6000r/min离心10min，将沉淀用无菌乳悬浮，获得嗜热链球菌TIMR0705-117的工作发酵剂，使所述工作发酵剂中的嗜热链球菌TIMR0705-117的活菌浓度为10⁹—10¹⁰cfu/mL。

含有嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-117发酵酸乳的制备 

将原料乳鲜奶（不经过任何处理的新鲜牛奶）在95℃加热灭菌20min后，再冷却至42℃，按体积百分含量为3%的接种量加入实施例2步骤2获得的嗜热链球菌TIMR0705-117活菌含量为6×10⁹cfu/mL的工作发酵剂，并按体积百分含量为3%的接种量加入可共生的制备发酵酸乳的商业发酵剂保加利亚乳杆菌（德氏乳杆菌保加利亚亚种 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus），中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）的保藏编号为6047，活菌含量为10¹⁰cfu/mL），42℃发酵培养至发酵液的滴定酸度(以乳酸计)为0.6，4℃冷藏保存即得到发酵酸乳

嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-117制备发酵酸乳

1、发酵酸乳的制备

实验设两个处理组（实验组、对照组），每个处理组重复三次，具体如下：

1）实验组：将原料乳鲜奶（不经过任何处理的新鲜牛奶）在95℃加热灭菌20min后，再冷却至42℃，按体积百分含量为3%的接种量加入实施例2步骤2获得的嗜热链球菌TIMR0705-117活菌含量为6×10⁹cfu/mL的工作发酵剂，并按体积百分含量为3%的接种量加入可共生的制备发酵酸乳的商业发酵剂保加利亚乳杆菌（德氏乳杆菌保加利亚亚种 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus），中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）的保藏编号为6047，活菌含量为10¹⁰cfu/mL），42℃发酵培养至发酵液的滴定酸度(以乳酸计)为0.6，4℃冷藏保存即得到发酵酸乳样品1；

2）对照组：将原料乳鲜奶（不经过任何处理的新鲜牛奶）在95℃加热灭菌20min后，再冷却至42℃，按说明书添加商品发酵剂，42℃发酵培养至发酵液的滴定酸度(以乳酸计)为0.6，4℃冷藏保存即得到发酵酸乳样品2；

2、发酵酸乳的检测

分别检测步骤1两种处理各重复获得的发酵酸乳样品1和2进行冷藏的第1天（即温度降为4℃时）、第7天、第14天、第21天和第28天的持水力、粘度、凝胶强度，结果用不同处理三次重复的平均值±标准差形式表示，如表1—表3所示，具体测定方法如下：

粘度：采用DV-Ⅲ Ultra型粘度计（Brookfield公司）在25℃进行测定，采用LV3转子，转速100r/min，作用时间1min。

持水力：取重量W为5g发酵酸乳于离心管中，6000r/min，4℃，10min，称量上清液的重量W1，持水力（%）=(W-W1)/W×100%。 

凝胶强度：利用质构仪测定发酵酸乳的凝胶强度，将发酵酸乳样品于室温（25℃）下回复一段时间，选用锥形探头P/45C（高4cm，底径3cm），下压模式，穿入未经搅拌的发酵酸乳样品，插入深度20mm，速度2mm/s，此过程所需最大的力即为发酵酸乳的凝胶强度（单位：GS）。 

表2. 发酵酸乳保藏期间的持水力（%）变化 

发酵时间1天7天14天21天28天实验组34.2±0.4^a,A38.3±0.2^C54.1±0.3^C60.0±0.4^a,A62.0±0.3^a,A对照组132.6±0.2^b,B42.4±0.3^A58.2±0.4^A58.0±0.3^b,B62.0±0.2^b,B

 注：a,b,c表示同一保藏时间的各组的发酵酸乳相比，在P＜0.05水平差异显著；A,B,C表示同一保藏时间的各组的发酵酸乳相比，在P＜0.01水平差异极显著。

  

表3. 发酵酸乳保藏期间的粘度（单位：厘泊）变化

发酵时间1天7天14天21天28天实验组493.5±7^b514.0±5^b,B669.8±8^A679.8±7^a,A704.6±6^a,A对照组1511.4±7^a564.2±8^a,A589.4±10^C622.6±6^c,B650.6±7^>

注：a,b,c表示同一保藏时间的各组的发酵酸乳相比，在P＜0.05水平差异显著；A,B,C表示同一保藏时间的各组的发酵酸乳相比，在P＜0.01水平差异极显著。

  

表4. 发酵酸乳保藏期间的凝胶强度（单位：GS）变化

发酵时间1天7天14天21天28天实验组36.3±0.2^a37.4±0.1^a,A38.0±0.2^a,A39.4±0.1^A40.7±0.2^A对照组135.9±0.1^a37.5±0.2^b,B34.0±0.1^b,B37.1±0.2^C38.2±0.2^C

注：a,b,c表示同一保藏时间的各组的发酵酸乳相比，在P＜0.05水平差异显著；A,B,C表示同一保藏时间的各组的发酵酸乳相比，在P＜0.01水平差异极显著。

菌株TIMR0705-117鉴定为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) 的生物材料样品的相关保藏信息： 

1 生物材料的分类命名：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)

2 保藏该生物材料样品的单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

3 保藏该生物材料样品的单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

4 保藏日期：2013年1月21号

5 保藏编号：CGMCC No.7183。