一种产胆盐水解酶干酪乳杆菌KL1在功能性酸奶中的应用

摘要

本发明涉及一种产胆盐水解酶干酪乳杆菌KL1在功能性酸奶中的应用方法，适用于发酵乳制品中降胆固醇的功能性酸奶和微生态制剂生产。本发明采用直投法添加高效降低胆固醇的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KL1(CGMCC No.1809)干粉发酵剂和普通酸奶干粉发酵剂制备品质优良的功能性酸奶。在不改变普通酸奶发酵工艺基础上，既可利用KL1菌株产胆盐水解酶特性制备降低血清胆固醇的酸奶，又解决了酸奶乳清析出问题，还降低了酸奶后酸化程度，提高了酸奶黏度，产品在4℃条件下贮存21天后干酪乳杆菌KL1的活菌数量可达到10

说明书

技术领域

本发明涉及一种产胆盐水解酶(Bile Salt Hydrolase，BSH)干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)KL1干粉发酵剂和普通酸奶干粉发酵剂混合发酵功能性酸 奶生产技术，适用于发酵乳制品中降胆固醇的功能性酸奶和微生态制剂的生产。

背景技术

益生菌(Probiotics)是指一类通过肠道定殖作用改善宿主特定部位微生态平 衡并兼有若干其他有益生理功能的微生物。它们通过改善肠道微生物生态平衡， 控制肠道感染，降低血清胆固醇水平，提高乳糖不耐症人对乳糖的利用，并能 刺激特异性或非特异性免疫反应，具有免疫增强的作用。益生菌制品的活菌应 该代谢稳定，活性较强，通过消化道后大量存活，进入肠道后发挥益生菌作用。 目前用于生产益生菌剂的优良菌种有双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属中的乳 酸乳球菌乳酸亚种等。

本发明所用干酪乳杆菌KL1菌株是从藏灵菇中分离纯化出来的一种益生乳 酸菌，可在生长代谢过程中产生大量高活力的胆盐水解酶，经过体外牛津杯试 验和动物实验证明有降低机体血清胆固醇含量的功效。其降低胆固醇机理是缘 于干酪乳杆菌KL1菌株代谢产生的胆盐水解酶(Bile Salt Hydrolase，BSH)，BSH 是肠道中的双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属中的多种乳酸细菌在生长过程中 产生的代谢产物。大量实验证明，胆盐水解酶能在肝肠循环中将结合胆盐分解， 产生氨基酸与溶解度较低的游离胆盐。后者能与胆固醇结合形成沉淀复合物而 排出体外，从而降低血清总胆固醇的含量。

早在1963年人们就证实摄取含有某种乳杆菌或双歧杆菌发酵的酸奶具有降 低血清胆固醇含量的功效。迄今为止，国内外学者对乳酸菌降胆固醇作用机理 的研究尚存在不同观点，主要集中于以下三点：(1)乳酸菌菌体细胞直接吸收同 化胆固醇；(2)乳酸菌的胆盐水解酶活性使结合态胆盐降解为游离态胆盐，后者 溶解度下降与胆固醇发生共同沉淀作用；(3)其他理论，如吸收同化与共沉淀联 合作用。

国内关于干酪乳杆菌的研究主要是在降血脂、抗高血压、治疗过敏性疾病 等保健功效上，如上海光明乳业股份有限公司申请的“干酪乳杆菌Bd-II菌株及 其在降低血脂方面的应用”，专利申请号为：CN03128995.9；“干酪乳杆菌LC2W 菌株及其在抗高血压方面的应用”，专利申请号为：CN03129450.2；景岳生物科 技股份有限公司申请的“新的微生物株类干酪乳杆菌GM-080及其治疗过敏相 关疾病的用途”，专利申请号为：CN200410038566.X。

虽然国外关于干酪乳杆菌降低血清胆固醇功效的研究也有一项专利报道： Lactobacillus casei bd-II stain and used to reduce blood cholesterol(20060127380)， 但是，目前国外有关干酪乳杆菌产胆盐水解酶的内容尚无专利报道。虽然国内 有一项“含罗伊氏乳杆菌的功能性酸奶及其制作方法(200310112715.8)”的专利 报道，但是国内有关利用降胆固醇及高产胆盐水解酶的干酪乳杆菌应用于功能 性酸奶的生产尚未见相关文献报道和专利报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种产胆盐水解酶干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂和普 通酸奶干粉发酵剂混合发酵功能性酸奶生产技术。

本发明制备功能性酸奶是由具有高效降低胆固醇及高产胆盐水解酶的干酪 乳杆菌(Lactobacillus casei)KL1干粉发酵剂和普通酸奶干粉发酵剂制得。

一种利用产胆盐水解酶的干酪乳杆菌KL1在功能性酸奶中应用的方法，采 用直投法添加酸奶干粉发酵剂的工艺为：干酪乳杆菌KL1菌株干粉发酵剂接种 量为0.5‰(W/V，质量体积比浓度)，干酪乳杆菌KL1菌株干粉发酵剂与普通酸 奶干粉发酵剂的接种比例为1∶2(W/W，质量分数)。

所述方法中，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KL1分离筛选自吉林、呼和浩 特市普通家庭的藏灵菇(又称开菲尔粒)，并已于2006年9月11日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCC No.1809(菌 株KL1)。在含有碳酸钙和纳他霉素的MRS选择性培养基上，干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)KL1菌株的菌落大小2～3mm，表面粗糙如雪花状，边缘不 规则，无光泽，扁平，灰白色，半透明，菌落有较高黏性；个体形态呈杆状， 长短不等，短链状排列，有时菌体呈球形，G⁺无芽孢杆菌。

所述方法中，普通酸奶干粉发酵剂来自于由哈尔滨美华生物技术股份有限 公司生产的家家乐直投式酸奶发酵剂。

所述方法中，在普通酸奶生产中添加干酪乳杆菌KL1的干粉发酵剂制备的 功能性酸奶，具有良好的降低血清胆固醇功效。在不改变普通酸奶发酵工艺基 础上，既可利用KL1菌株产胆盐水解酶特性制备降低血清胆固醇的酸奶，又解 决了酸奶乳清析出问题，还降低了酸奶后酸化程度，提高了酸奶黏度，产品在4 ℃条件下贮存21天后干酪乳杆菌KL1的活菌数量可达到10⁶CFU/g以上，仍具 有保健功能。

上述得到的一种利用产胆盐水解酶干酪乳杆菌KL1在功能性酸奶中应用的 方法及其产品与专用生产菌株属于本发明保护范围。

附图说明

应用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KL1和普通酸奶干粉发酵剂生产功能 性酸奶工艺流程图说明如下：

(1)原料乳：制作酸奶的原料乳要求菌数一般低于10⁴个/mL，不含抗生素和 消毒药，不宜选用患乳房炎乳。(2)净化：以离心机除去牛乳中的白细胞和其他 肉眼可见的杂质。(3)标准化：原料乳的主要成分指标应符合食品卫生国家标准 GB5408-85。其总干物质应不低于11.5％，脂肪含量根据产品不同大体调整为4 种：3.2％、2.5％、1.0％和＜0.1％，可通过脱除奶油或添加1％～3％的脱脂奶粉或 稀奶油以调整总干物质或脂肪含量。(4)预热、配料和过滤：将原料乳加热至60 ℃左右，加入6％(W/V，质量体积比浓度)的蔗糖，溶解后过滤除杂。(5)均质： 在均质机中于8～10MPa压力下对预热的原料乳进行均质处理。目的是使乳凝固 均匀，质地更加细腻、平滑，亦可使脂肪球变小而防止脂肪上浮。(6)杀菌：将 原料乳加热至90℃，保温5～10min。(7)冷却：经杀菌后的原料乳迅速冷却至 43℃，待接种。(8)接种：采用直投法添加干酪乳杆菌KL1菌株干粉发酵剂和普 通酸奶干粉发酵剂工艺为：干酪乳杆菌KL1菌株干粉发酵剂接种量为 0.5‰(W/V，质量体积比浓度)，干酪乳杆菌KL1菌株干粉发酵剂与普通酸奶干 粉发酵剂的接种比例为1∶2(W/W，质量分数)。(9)分装：为避免杂菌侵入，分 装于塑料小容器的操作应在无菌室中快速进行。(10)保温发酵：将塑料小容器 置于发酵室中保持发酵温度43℃。当发酵乳的酸度达到38.75°T，乳凝固性状 良好时，即发酵成熟。发酵时间为3h。(11)冷却：将盛酸奶的容器从发酵室取 出，用冷风迅速冷却至10℃以下。(12)冷藏与后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏 于0～5℃冷藏室中保存，直至饮用。目的是防止酸奶继续发酵产酸造成pH过 低而影响口感，并防止杂菌污染繁殖。冷藏条件下的后熟有利于酸奶风味物质 的形成，最终获得风味柔和、浓郁的功能性成品酸奶。

本发明制作功能性酸奶的原料来源方便，发酵工艺简单，发酵周期短，操 作简单，对设备要求低，成本较低，适于工业化生产。

具体实施方式

下述实施例对本发明作进一步说明而不限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量体积比浓度(W/V)。

实施例1、利用产胆盐水解酶的干酪乳杆菌KL1在普通酸奶中应用

1、干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂添加量对发酵酸奶酸度的影响

在普通酸奶干粉发酵剂接种量为1.0‰的前提下，以0.1mol/L NaOH溶液测 定干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂添加量为0.5‰、1.0‰、1.5‰发酵酸奶的酸度， 并以未添加干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂的普通酸奶为对照组，单位以吉尔涅耳 度(°T)表示。取10mL样品，用20mL蒸馏水稀释，加入0.5％的酚酞指示剂3 滴，以标定的NaOH溶液滴定至微红色，30s不退色为终点，结果见表1。

酸度计算公式：酸度(°T)＝c×V×10/0.1

式中c——标定后NaOH浓度(mol/L)

V——消耗标定NaOH体积数

表1不同干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂添加量对发酵酸奶酸度的影响

注：^*表示与对照组比较P＜0.05

由表1可知，与对照组相比，干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂添加量为0.5‰时 对发酵过程中酸奶酸度的影响最小，降低了发酵过程中的酸奶酸度；添加量为 1.0‰时，增加了发酵过程中的酸奶酸度；当添加量为1.5‰时，发酵过程中的酸 奶酸度显著高于对照组(P＜0.05)。因此说明在发酵酸奶酸度指标上，干酪乳杆 菌KL1干粉发酵剂0.5‰的添加量优于1.0‰和1.5‰的添加量。

2、干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂添加量对酸奶后酸化的影响

在普通酸奶干粉发酵剂接种量为1.0‰的前提下，用0.1mol/LNaOH溶液测 定干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂添加量为0.5‰、1.0‰、1.5‰贮藏至第1d、7d、 14d、21d的酸奶酸度，并以未添加干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂的普通酸奶为 对照组，测定方法同上，结果见表2。

表2不同干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂添加量对酸奶后酸化的影响

注：^*表示与对照组比较P＜0.05

由表2可知，与对照组相比，干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂添加量为1.0‰时， 显著降低了对酸奶后酸化的影响(P＜0.05)，且下降得最多；添加量为0.5‰时次 之，添加量为1.5‰时，增加了酸奶后酸化程度。因此说明在酸奶后酸化指标上， 干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂1.0‰的添加量优于0.5‰和1.5‰的添加量。

3、干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂添加量对酸奶黏度的影响

在普通酸奶干粉发酵剂接种量为1.0‰的前提下，用粘度计分别测定干酪乳 杆菌KL1干粉发酵剂添加量为0.5‰、1.0‰、1.5‰贮藏至第1d、7d、14d、21 d的酸奶黏度，以未添加干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂的普通酸奶为对照组。测 定时取50mL样品，检测参数：sp3转子，转速30r/min，结果见表3。

表3不同干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂添加量对酸奶黏度的影响

注：^*表示与对照组比较P＜0.05

由表3可知，干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂添加量为0.5‰时显著提高了酸奶 黏度(P＜0.05)，而添加量为1.0‰和1.5‰时显著降低了酸奶黏度(P＜0.05)。因此 说明在酸奶黏度指标上，干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂0.5‰的添加量优于1.0‰ 和1.5‰的添加量。

4、干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂添加量对酸奶中KL1菌株活菌数的影响

在普通酸奶干粉发酵剂接种量为1.0‰的前提下，将干酪乳杆菌KL1干粉发 酵剂添加量为0.5‰、1.0‰、1.5‰贮藏至第1d、7d、14d、21d的酸奶进行平 板菌落计数。分别取5g酸奶以45mL无菌生理盐水稀释10^-1，再取1mL酸奶稀 释液，以无菌生理盐水稀释10^-2至10^-6，同时取10^-4至10^-6的稀释菌液1mL，采 用改良MRS选择性培养基(培养基中加入0.2％～0.3％的牛胆盐；KL1菌株具有 耐受胆盐的特性，其生长不被胆盐抑制；而普通酸奶菌种的生长可被胆盐抑制) 以倾注平板培养法检测酸奶中KL1菌株的活菌数量，每个稀释度设3次重复， 37℃培养48h后计数，结果见表4。

表4干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂添加量对酸奶中KL1菌株活菌数的影响

由表4可知，添加干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂发酵的酸奶，在贮藏21天后， KL1菌株的活菌数量可达到10⁶CFU/g以上，仍具有保健功能。因此说明在酸奶 活菌数指标上，干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂添加量为0.5‰、1.0‰、1.5‰时均 可制作功能性酸奶。但考虑生产成本问题，确定干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂添 加量为0.5‰。

5、干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂添加量对酸奶乳清析出量的影响

在普通酸奶干粉发酵剂接种量为1.0‰的前提下，用量筒分别测定干酪乳杆 菌KL1干粉发酵剂添加量为0.5‰、1.0‰、1.5‰贮藏至第1d、7d、14d、21d 的酸奶乳清析出量，以未添加干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂的普通酸奶为对照组， 结果见表5。

表5不同干酪乳杆菌KL1添加量对酸奶乳清析出量的影响

注：^*表示与对照组比较P＜0.05

由表5可知，干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂添加量为0.5‰时显著降低了酸奶 乳清析出量(P＜0.05)，添加量为1.0‰时使酸奶乳清析出量有所降低；干酪乳杆 菌KL1干粉发酵剂添加量为1.5‰时，显著增加了酸奶乳清析出量(P＜0.05)。因 此说明在酸奶乳清析出量指标上，干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂0.5‰的添加量优 于1.0‰、1.5‰的添加量。

综上所述，为了获得品质优良的功能性酸奶，针对干酪乳杆菌KL1干粉发 酵剂不同添加量对酸奶品质的影响，确定其最佳添加量。通过分析测定发酵酸 奶的酸度，以及贮藏酸奶的黏度、KL1菌株活菌数量、乳清析出量，确定功能 性酸奶干酪乳杆菌KL1干粉发酵剂最佳添加量为0.5‰，干酪乳杆菌KL1菌株 干粉发酵剂与普通酸奶干粉发酵剂的接种比例为1∶2。成品功能性酸奶黏度较高， 凝乳时间较短，凝乳结实，极少量乳清析出，口感黏稠、细腻和幼滑，甜酸度 适中，有浓郁的酯香风味，冷藏21天后酸奶中的KL1菌株活菌数可达到 10⁶CFU/g以上，仍具有保健作用。

实施例2、功能性酸奶降血清胆固醇的动物实验

本发明所用的生产功能性酸奶发酵剂是干酪乳杆菌(Lactobacillus  casei)KL1干粉发酵剂和普通酸奶干粉发酵剂。其中干酪乳杆菌KL1为高产胆 盐水解酶的功能性菌种，且菌株耐胃酸、耐胆汁盐能力较强，具有抗消化道逆 环境特性，可顺利到达小肠分泌胆盐水解酶，将结合态胆盐降解产生氨基酸与 溶解度较低的游离态胆盐。后者能与胆固醇结合形成沉淀复合物而排出体外， 从而降低血清总胆固醇的含量。利用大白鼠做功能性酸奶经口灌胃试验，其方 法和结果如下：

1、动物分组与处理

将40只Wistar大鼠(由北京维通利华实验动物技术公司提供)随机分为4组， 分别是高脂模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。所有组均饲喂高脂饲料(基 础饲料78.8％、胆固醇1％、蛋黄粉10％、猪油10％、胆盐0.2％，均由北京维通利 华实验动物技术公司提供)，适应性饲养1周。1周后，所有组继续饲喂高脂饲料， 同时将低剂量组、中剂量组、高剂量组分别按0.5g/kg·d、1.5g/kg·d和2.5g/kg·d剂 量灌胃功能性酸奶(KL1菌株活菌数达10⁷CFU/g以上)，高脂模型组灌胃同剂量蒸 馏水，如此连续饲喂7周。

2、血清制备与检测

在试验第1、3、5、7周末，分别对大鼠眼眶静脉丛采血，将盛有全血的离 心管室温静置10min后，3000r/min离心10min，吸取上清液，为血清样品。采用 胆固醇氧化酶-过氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法测定血清总胆固醇(TC)的含 量，结果见表6；采用甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法测定 血清甘油三脂(TG)的含量，结果见表7。

表6功能性酸奶降低大鼠血清TC含量的实验结果

注：^**表示与对照组比较P＜0.01

由表6可见，动物实验进行至第7周后，高、中、低剂量组大鼠的血清TC含 量与高脂模型组对比，均出现极显著差异(P＜0.01)，且中剂量组效果最为明显， 表明功能性酸奶具有极显著降低高胆固醇血症大鼠血清总胆固醇含量的功效。

表7功能性酸奶降低大鼠血清TG含量的实验结果

注：^**表示与对照组比较P＜0.01

由表7可见，动物实验进行至第7周后，高、中、低剂量组大鼠的血清TG含 量与高脂模型组对比，均极显著降低(P＜0.01)，且低剂量组效果最为明显，表 明功能性酸奶具有极显著降低高胆固醇血症大鼠血清甘油三脂含量的功效。

综上所述，在普通酸奶生产中添加干酪乳杆菌KL1的干粉发酵剂制备的功 能性酸奶，具有良好的降低血清胆固醇功效，用之开发研制降血清胆固醇功能 性酸奶和微生态制剂具有广阔的市场前景。

本专利所属项目1：北京市自然科学基金“藏灵菇益生菌产生物活性物质及生理 功能的研究”

项目编号：5062006

项目起止时间：2006.01-2008.12

项目负责人：刘慧