一种高耐热性植酸酶酵母工程菌及其构建方法

摘要

本发明通过生物信息学方法对已报道的植酸酶AppA基因进行分析，找出潜在的热稳定相关位点，利用定点突变技术对该基因的关键位点进行定点突变，获得突变基因Appa-M2,将突变基因构建到酵母穿梭载体pPIC9上，转化到毕赤酵母GS115中，筛选出高效表达耐热植酸酶的菌株。本发明构建筛选的重组酵母工程菌表达的植酸酶耐热性能好，85℃保温10分钟，残余酶活可达到60％。在饲料和食品工业中有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体属于一种高比活高耐热性植酸酶酵母工程菌及其构建方 法。

背景技术

植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称，属磷酸单酯水解 酶。植酸酶具有特殊的空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸（盐）降解为肌醇 和无机磷，同时释放出与植酸（盐）结合的其它营养物质。植酸是植物性饲料中存在的主要 抗营养因子之一，对无机离子、蛋白质等都具有螯合作用,从而影响动物对营养物质的吸收。 作为动物饲料中主要成份的植物性饲料含有相当数量的磷,其中50%以上是以植酸磷的形式 存在的,而单胃动物因缺乏分解植酸所必需的酶而不能有效地利用植酸磷。如果在单胃动物 的饲料中直接添加磷必然会造成磷资源浪费，形成高磷粪便而造成环境污染;如果不在饲料中 添加磷,这势必将影响到动物生长、发育和繁殖。目前，植酸酶的工业化生产在世界范围内 已形成了一个巨大的产业。不仅为生产企业带来可观的经济效益，也从根本上解决了目前单 胃动物粪便中磷对环境的污染，降低了使用无机磷酸盐作为饲料添加剂给我国矿物质资源带 来的压力，表现出极大的社会经济效益。因此，植酸酶作为新型饲料添加剂,可以提高饲料中 磷和其他成分的利用率并减轻环境污染,已得到越来越多的重视和应用（丁强等，中国农业科 技导报,2010,12(3)；27～33）。

来源于大肠杆菌的植酸酶(appA植酸酶)是迄今所知的分解植酸能力最强的植酸酶（Lei， et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2001,57(4):474-481）。自1952年发现大肠杆菌中有 植酸酶活性以来,人们已分离了大肠杆菌植酸酶（appA）基因，在原核表达系统（Golovan,et  al.,Can J Microbiol,2000,46(1):59～71;罗会颖,生物工程学报,2004,20(1):78～84;陈寅等, Microbiol,2004,31(3)74～78;黄敏等,应用与环境生物学报,2009,15(3)：371～375）和真核表达系 统（Rodriguez，et al.,Arch Biochem Biophys,2000,382(1):105～112;罗会颖等，生物工程学 报,2006,22(4);528～533；黄光瑞等,湖北大学学报,2007,29(3);290～293）中表达了appA植酸酶, 并对其酶学性质进行了系统研究。目前在生产实践中应用的来源于大肠杆菌的植酸酶appA, 其pH特性较好,比活性也是目前报道最高的,但它的热稳定性较差,通过制粒高温过程后其活 性将损失70%以上,难以在主要的颗粒料中应用（丁强等,中国农业科技导报,2010,12(3)； 27～33）。近年来,利用基因工程技术定向改造appA植酸酶提高酶的热稳定性,成为改造植酸 酶的一个方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高耐热性植酸酶酵母工程菌及其构建方法。

本发明提供的一种高耐热性植酸酶基因（Appa-M₂），其核苷酸序列为SEQ ID No.1。

该基因通过如下方法得到：

根据GenBank中报道的AppA序列（DQ513832），委托生物技术公司合成了植酸酶基因 Appa；分别在5’和3’端加入EcoRI和NotI酶切位点；

对Appa序列通过生物信息学分析，找到有两个可以引进糖基化的潜在糖基化位点，通 过引进糖基化提高在酵母中表达植酸酶的热稳定性；

通过定点突变利用互补引物对上述两个位点进行突变，引入糖基化，合成定点突变引物， 下划线标记为突变位点；

Q258N引物：（CAG--AAC）

F_Q258N5’-CTACTTGCTGAACAGAACTCCAGAGG-3’其核苷酸序列为SEQ ID No.3

R_Q258N5’-CCTCTGGAGTTCTGTTCAGCAAGTAG-3’其核苷酸序为SEQ ID No.4

Q349N引物：（CAG--AAC）

F_Q349N5’-CTCTCAATGGATTAACGTTTCGTTGG-3’其核苷酸序列为SEQ ID No.5

R_Q349N5’-CCAACGAAACGTTAATCCATTGAGAG-3’其核苷酸序列为SEQ ID No.6

获得能在酵母中高效表达的改良后的植酸酶基因（Appa-M₂），其核苷酸序列为SEQ ID  No.1。

与合成了的植酸酶基因Appa相比，改良后的植酸酶基因（Appa-M₂）在＋772、＋774、 ＋1045和1047位的碱基发生了改变。导致所编码的氨基酸序列在＋259、＋350位的氨基酸 发生了改变，使得+259Q、＋350Q改变为＋259N,＋350N，其氨基酸序列为SEQ ID No.2。

本发明提供一种高耐热性植酸酶酵母工程菌，含有上述基因。

本发明提供一种高耐热性植酸酶酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1）将上述改良后的植酸酶基因（Appa-M₂）通过限制性内切酶EcoRI和NotI消化，构建 到酵母穿梭载体pPIC9上，得到重组载体pPIC9-Appa-M₂；

2）大量制备pPIC9-Appa-M₂制粒，然后通过BglII酶进行线性化；

3）通过氯化锂转化法转化毕赤酵母GS115；

4）筛选高效表达植酸酶Appa-M₂的重组酵母菌株。

诱导表达纯化Appa-M₂植酸酶，对纯化得到的植酸酶酶学性质进行分析，结果表明，本 研究构建筛选的重组酵母工程菌表达的植酸酶耐热性能好，85℃保温10分钟，残余酶活可达 到60％。

本发明所提供的重组酵母工程菌株经过中试发酵以后，进一步可用于大规模的工业生产 植酸酶，本发明所建立的基因改造，酵母表达体系可以为植酸酶的改造提供新的思路。在饲 料和食品工业中有广泛的应用前景。

附图说明

图1：Appa突变测序图

图2:pPIC9-Appa-M₂酶切鉴定图

图3：pPIC9-Appa-M₂BglII内切酶线性化电泳图

图4:pPIC9-Appa-M₂转化酵母RDB培养基转化图

图5:MD、MM培养基筛选图

图6：稳定性传代培养图

图7:提取酵母基因组PCR鉴定Appa-M₂图

图8:纯化SDS-PAGE电泳图

图9：植酸酶最适温度图

图10：植酸酶最适pH图

图11:植酸酶温度稳定性检测图

具体实施方式

实施例1

一、植酸酶基因Appa的获得

根据GenBank中报道的AppA序列（DQ513832），委托生物技术公司合成植酸酶基因Appa， 克隆到T-Easy载体上，得到重组质粒T-Easy-Appa。

二、Appa序列糖基化位点分析

当蛋白质含有一致性序列Asn-X-Ser/Thr（N-X-S/T）(X代表任何氨基酸)时,毕赤酵母 能对其中天冬氨酰残基上的酰胺氮进行糖基化,产生N-糖基化。据相关文献报道糖基化对酶 的热稳定性有重要的影响，序列分析表明，由Appa基因编码的植酸酶本身有三个糖基化位点， 分别为：N139，N204，N317位点。分析发现，该基因通过改造还有两个潜在的可以引进糖基 化的位点，分别为：Q259，Q350，天冬酰胺N密码子有：AAT、AAC，酵母中AAC为偏爱密码 子。所以设计突变引物把谷氨酰胺密码子（CAG）置换为天冬酰胺(N)密码子（AAC）。

三、通过快速定点突变引入糖基化位点

利用两对互补引物（SEQ ID No.3-6），使用带有合成植酸酶基因Appa的重组质粒T- Easy-Appa作为模板，通过PCR技术进行扩增，得到突变后的重组质粒T-Easy-Appa-M₂。再 经过DpnI消化掉PCR体系中的模板质粒T-Easy-Appa，消化产物转入大肠杆菌DH5а大量扩 增，提取质粒测序，结果表明Appa-M₂突变成功，得到的Appa-M₂核苷酸序列SEQ ID No.1， 氨基酸序列SEQ ID No.2，突变结果见图1。

四、构建酵母重组载体pPIC9-Appa-M₂

分别对Appa-M₂和穿梭载体pPIC9进行EcoRI和NotI消化，酶切产物回收，用酶切后的 Appa-M₂和pPIC9，按比例混合，用T4连接酶16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5а， 涂含氨苄霉素的LB固体培养基平板，37℃过夜培养，挑取单菌落在LB液体培养基中大量培 养，纯化质粒做EcoRI和NotI酶切鉴定见图2，pPIC9-Appa-M₂酶切后的片段分别为8kb和 1.236kb。

五、pPIC9-Appa-M₂制粒大量制备及线性化

使用500μl反应体系，15μl BglII内切酶，50μl酶的缓冲液400μl pPIC9-Appa-M₂，用无 菌水补足500μl，过夜消化，再经过酚氯仿抽提，20％乙醇沉淀，最后用20μl无菌水溶解。 消化结果电泳图见图3。

六、氯化锂转化法转化毕赤酵母

A.感受态细胞准备：

1.在50mlYPD中培养毕赤酵母至OD600＝0.8-1.0（约108个/ml）。

2.收集细胞，用25ml灭菌水洗涤，室温1500g离心10min。

3.去除水，用1ml100mM LiCl重悬细胞。

4.将细胞悬液转至1.5ml离心管中。

5.最大转速沉淀细胞15s,用吸头吸去LiCl。

6.在400μl100mM LiCl中悬浮细胞。

7.将50μl细胞悬浮液移到1.5ml离心管中，每次用一管，现做现用，不要置于冰上或 -20度保存。

B.转化：

1.煮沸单链DNA5min，快速放于冰水中使变冷，后置于冰上。注意：载体DNA不 需。要在每次用之前都煮，在-20度保存等份少量样品，每次解冻一管，用3-4次后再煮。

2.取上面第7步中细胞，离心去除LiCl。

3.每个转化样品，按顺序加入下列试剂，PEG可保护细胞免受高浓度LiCl的有害作用。

240μl50%PEG，36μl1M LiCl，25μl2mg/ml单链DNA，溶解于50μl灭 菌水中的质粒DNA（5-10μg）。

4.剧烈涡旋细胞沉淀至完全混匀（1min）。

5.在30℃孵育30min（不要摇动）。

6.在42℃水浴热击20-25min。

7.6000-8000rpm离心，将转化溶液转移走。

8.用1ml灭菌水重悬细胞沉淀。

9.在RDB或MD平板上涂25-100μl,在30℃孵育2-4天，转换结果见图4。

七、高效表达植酸酶Appa-M2酵母菌株

筛选方法一（常规筛选方法）：

平板筛选：

用无菌牙签挑取上面筛选到的重组子分别点种MM平板和MD平板。

在MM和MD上生长一致的，其表型为Mut+。

在MD上生长正常，在MM上生长缓慢或不长的，其表型为MutS，见图5。再经过传代 培养使得植酸酶基因稳定整合到酵母基因组上见图6。

PCR鉴定：

挑取平板筛选出的阳性克隆，提取酵母总DNA。

1.分别用10ml MD，MDH，30℃培养重组菌和受体菌（GS115）到OD600=5-10（约12 小时），5000rpm室温10min离心收集细胞，用10ml无菌水洗涤菌体一次。

2.将细胞沉淀重悬于新配制的2ml SCED pH7.5缓冲液中[SCED：1M山梨醇，10mM 柠檬酸钠(pH7.5)，10mM EDTA，10mM DTT]，加0.3mg消解酶混匀37℃温育50min。

3.加2ml1%SDS将管倒置数次混匀内容物，在冰上放置5min，操作应尽可能温和小心， 加入1.5ml5M乙酸钾（pH8.9），轻柔混匀。12000rpm4℃10min离心。弃沉淀取上清。

4.上清中加2倍体积无水乙醇，室温静置15min，12000rpm4℃20min离心取沉淀。

5.沉淀重悬于0.7ml TE（pH7.4），轻柔溶解后转至1.5ml离心管中。

6.酚：氯仿（1：1），氯仿：异戊醇（24：1）各抽提一次离心取水相。

7.将水相等份转移到两个1.5ml离心管中。加1/2体积7.5M乙酸铵（pH7.5）和2倍体 积的无水乙醇，混匀-20℃60min沉淀。

8.12000rpm4℃20min离心回收核酸，弃上清用70%乙醇洗涤沉淀物，离心弃上清，晾 干残留乙醇，每管沉淀重悬于50μl TE（pH7.5）中，-20℃保存待用。

提取的酵母基因组，利用植酸酶特异引物进行PCR扩增，结果见图7。选取PCR阳性克 隆测序，测序结果表明改造后的植酸酶基因已成功整合到酵母基因组上。

八、对整合有Appa-M2重组体酵母诱导表达植酸酶及纯化

A.诱导表达

重组酵母500mL BMGY[1%酵母提取物,2%蛋白胨,1.34%YNB,0.00004%Biotin,1 %甘油(体积比)]中,30℃剧烈振摇使细胞生长至饱和状态(A600=10～20),离心收集菌 体,加入250mL诱导培养基BMMY(用甲醇代替BM GY中的甘油),30℃下继续诱导 培养2天。

B.酶的纯化

对上述得到的发酵液8000rpm离心30min,将上清用80％硫酸铵沉淀，离心去除上清， 再用40mM pH4.5乙酸钠缓冲液溶解，使用相同缓冲液透析三天，使用阳离子树脂纯化，得 到纯度98％的植酸酶，再经Hiprep26/10desalting脱去洗脱缓冲液中的氯化钠得到纯酶。 SDS-PAGE检测结果见图8。

九、Appa-M₂酶学性质测定

经纯化的植酸酶在不同pH及不同温度条件下进行酶促反应以测定其最适pH和最适温 度，结果见图9-10。将酶液在不同温度（40、50、60、70、80、85、90、95、100℃）下分别 处理10分钟，在37℃、pH4.5的条件下分别测定酶活性以测定酶的热稳定性，结果见图11。 结果显示,重组酵母工程菌表达的植酸酶Appa-M2耐热性能好，85℃保温10分钟，残余酶活 可达到60％。