一种在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法

摘要

本发明涉及一种在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法，属于核酸转化和纯化技术领域。本发明方法在DNA重亚硫酸盐转化体系中加入一种能够防止DNA片段化而降解的DNA保护剂，使得DNA在重亚硫酸盐处理过程中不至于片段化而降解。进而有效的提高了处理后DNA的质量，使得核酸的回收率达到了70%左右，并且增加了转化后的PCR及其他分析技术的灵敏度。本发明方法使得整个DNA重亚硫酸盐处理过程更加简单，快捷，同时提高了处理后DNA的质量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法，有利于在重亚硫酸 盐转化过程中加快反应速度，保护DNA的完整性，属于核酸转化和纯化技术领域。

背景技术

虽然检测DNA甲基化的方法有很多种，但是在众多方法中，研究人员首先都会使用 到一项技术，那就是DNA的重亚硫酸盐转化。DNA的重亚硫酸盐转化会将DNA中未甲 基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化了的胞嘧啶则保持不变。因此，通过随后的测序、 甲基化特异性PCR或芯片等分析手段来比较处理前和处理后的DNA序列，就能确定DNA 待检序列中哪些碱基是甲基化了的。

尽管这种转化在理论上很简单，但是重亚硫酸盐转化真正要做起来却并非那么容易。 因为重亚硫酸盐转化的条件非常苛刻，比如在反应体系中需要提供高浓度的重亚硫酸盐来 完成未甲基化胞嘧啶的转化，而且还需要保证双链DNA分子长时间处于解链状态以便于 进行有效的转化。因此，DNA重亚硫酸盐转化的体系通常是一种高盐，高温和低pH值的 条件。但是在这种条件下，反应体系中会产生大量的活性氧基团，这种活性氧会使DNA 发生片段化并发生降解，因此将导致转化后的PCR及后续分析技术灵敏度降低，同时也会 导致DNA的回收率下降，有时甚至达不到50%。

基于上述重亚硫酸盐转化的特点，传统的转化方法为保证DNA的完整性通常将转化 条件优化的相对缓和，但在这种缓和的处理条件下，研究人员将会牺牲大量的处理时间， 因此将会导致整个处理流程非常繁琐和耗时，一般都会消耗18个小时左右。但是即便是 这样，对于珍贵的微量样品（比如1ng），由于DNA的降解仍不可避免，所以传统方法的 处理效果也不尽如人意。

发明内容

本发明的目的是提出一种在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法，通过采用 一种新的DNA保护剂来防止DNA在重亚硫酸盐转化过程中发生片段化和降解，同时也使 整个重亚硫酸盐转化更加高效、快速。

本发明所涉及的在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法，包括以下步骤：

（1）在200微升的离心管中加入5～20微升的待处理DNA溶液，10微升的DNA保 护剂以及90微升的DNA重亚硫酸盐转化液，并用去离子水补足反应体积至120微升；

其中所述的DNA重亚硫酸盐转化液配方为：四乙基氯化铵：1～2克，重亚硫酸盐： 0.3～0.5克，将两种组分称重后溶于去离子水中，用氢氧化钠溶液调节混合溶液的pH值至 5.0～6.0，并最终用去离子水定容溶液至1000毫升；

其中所述的DNA保护剂为：对苯二酚：2～3克，加去离子水，溶解后定容至1000 毫升；

（2）对步骤（1）的反应体系进行重亚硫酸盐处理，处理程序为：将反应体系加热至 95摄氏度，保温10分钟，降温至64摄氏度，保温60分钟，然后冷却至室温（15～25摄 氏度），得到第一溶液；

（3）将步骤（2）的第一溶液与结合液充分混合，以增加第一溶液中的DNA与硅膜 吸附柱的结合能力，混合比例为：第一溶液:结合液＝1:5，得到第二溶液；

其中所述的结合液的配方为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）：11～13克，乙二胺四乙酸二 钠（EDTA）：6～8克，将两种组分称量后与去离子水中混合，用浓盐酸调节混合溶液的pH 值至5.0～7.0，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（4）向硅膜吸附柱中加入500微升平衡液，在12000转/分钟下离心分离1分钟，倒 掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

其中所述的平衡液为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）：11～13克，与去离子水混合，用浓 盐酸调节混合溶液的pH值至9.0～10.0，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（5）将第二溶液加入到上述步骤（4）经过平衡处理的收集管内的硅膜吸附柱中，室 温放置2分钟，以12000转/分钟离心分离1分钟，倒掉收集管中的废液，将硅膜吸附柱 放入收集管中；

（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入600微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱 盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为45秒，倒去废液；

其中所述的漂洗液为无水乙醇：700～800毫升，称量后与去离子水中混合，最后用去 离子水定容溶液至1000毫升；

（7）向步骤（6）的硅膜吸附柱中继续加入600微升亚硫酸基团去除液，室温下放置 15分钟后进行离心处理，离心的转速为12000转/分钟，离心时间为45秒，倒去废液；

其中所述的亚硫酸基团去除液配方为：NaOH：11～13克，无水乙醇：700～800毫升， 将两种组分称量后与去离子水中混合，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（8）向步骤（7）的硅膜吸附柱中加入600微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行 脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为45秒，倒去废液，重复该 步骤一次；

（9）对步骤（8）的硅膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干 燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下2～5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；

（10）在步骤（9）的硅膜吸附柱中加入20微升无核糖核酸酶的去离子水，室温下 放置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟， 得到纯化的DNA溶液。

上述方法中所述的硅膜吸附柱为商业化耗材，并且与其收集管配套使用。此吸附柱 可从天根生化科技（北京）有限公司购买，其货号为RK125-B。

本发明提出的在DNA重亚硫酸盐转化过程中防止DNA降解的方法，其优点是：

1、本发明方法使用了一种新的在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法，因 此使得DNA在重亚硫酸盐处理过程中不至于片段化而降解。进而有效的提高了处理后 DNA的质量，使得核酸的回收率达到了70%左右，并且增加了转化后的PCR及其他分析 技术的灵敏度。

2、通过使用本发明的方法，可以使得重亚硫酸盐处理过程向着更节省时间的方向进 行，因此可以大大的缩短重亚硫酸盐处理时间，可将传统的18个小时的处理时间缩短到 目前的2小时。

附图说明

图1是本发明方法的实施例的结果图，通过本发明方法处理4个1000纳克人类基因 DNA组样品的后续甲基化特异性PCR电泳检测图。

其中，泳道M：脱氧核糖核酸分子量标准（TIANGEN，100bp DNA Ladder）。泳道1～4： 以使用本发明方法处理的4个人类基因组样品为模板，以按照转化后的p16基因序列设计 的引物为引物进行的甲基化特异性PCR结果。泳道5～8：以使用本发明方法处理的4个人 类基因组样品为模板，以按照转化前的p16基因序列设计的引物为引物进行的甲基化特异 性PCR结果。

具体实施方式

本发明提出的在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法，包括以下步骤：

（1）在200微升的离心管中加入5～20微升的待处理DNA溶液，10微升的DNA保 护剂以及90微升的DNA重亚硫酸盐转化液，并用去离子水补足反应体积至120微升；

其中所述的DNA重亚硫酸盐转化液配方为：四乙基氯化铵：1～2克，重亚硫酸盐： 0.3～0.5克，将两种组分称重后溶于去离子水中，用氢氧化钠溶液调节混合溶液的pH值至 5.0～6.0，并最终用去离子水定容溶液至1000毫升；

其中所述的DNA保护剂为：对苯二酚：2～3克，加去离子水，溶解后定容至1000 毫升；

（2）对步骤（1）的反应体系进行重亚硫酸盐处理，处理程序为：将反应体系加热至 95摄氏度，保温10分钟，降温至64摄氏度，保温60分钟，然后冷却至室温（15～25摄 氏度），得到第一溶液；

（3）将步骤（2）的第一溶液与结合液充分混合，以增加第一溶液中的DNA与硅膜 吸附柱的结合能力，混合比例为：第一溶液:结合液＝1:5，得到第二溶液；

其中所述的结合液的配方为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）：11～13克，乙二胺四乙酸二 钠（EDTA）：6～8克，将两种组分称量后与去离子水中混合，用浓盐酸调节混合溶液的pH 值至5.0～7.0，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（4）向硅膜吸附柱中加入500微升平衡液，在12000转/分钟下离心分离1分钟，倒 掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

其中所述的平衡液为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）：11～13克，与去离子水混合，用浓 盐酸调节混合溶液的pH值至9.0～10.0，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（5）将第二溶液加入到上述步骤（4）经过平衡处理的收集管内的硅膜吸附柱中，室 温放置2分钟，以12000转/分钟离心分离1分钟，倒掉收集管中的废液，将硅膜吸附柱 放入收集管中；

（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入600微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱 盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为45秒，倒去废液；

其中所述的漂洗液为无水乙醇：700～800毫升，称量后与去离子水中混合，最后用去 离子水定容溶液至1000毫升；

（7）向步骤（6）的硅膜吸附柱中继续加入600微升亚硫酸基团去除液，室温下放置 15分钟后进行离心处理，离心的转速为12000转/分钟，离心时间为45秒，倒去废液；

其中所述的亚硫酸基团去除液配方为：NaOH：11～13克，无水乙醇：700～800毫升， 将两种组分称量后与去离子水中混合，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（8）向步骤（7）的硅膜吸附柱中加入600微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱 盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为45秒，倒去废液，重复该步 骤一次；

（9）对步骤（8）的硅膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟， 干燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下2～5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；

（10）在步骤（9）的硅膜吸附柱中加入20微升无核糖核酸酶的去离子水，室温下 放置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟， 得到纯化的DNA溶液。

本发明方法中所述的硅膜吸附柱，为商业化耗材，并且与其收集管配套使用。此吸附 柱可从天根生化科技（北京）有限公司购买，其货号为RK125-B。

以下介绍本发明方法的实施例。

实施例：

通过本发明方法分别处理4份10微升（DNA的量为1000纳克）的人类基因组样品， 并通过后续的甲基化特异性PCR检测样品的处理效果。具体的操作步骤如下：

（1）在200微升的离心管中加入10微升的待处理DNA溶液，10微升的DNA保护 剂以及90微升的DNA重亚硫酸盐转化液，并用去离子水补足反应体积至120微升；

其中所述的DNA重亚硫酸盐转化液配方为：四乙基氯化铵：1.5克，重亚硫酸盐：0.4 克，将两种组分称重后溶于去离子水中，用氢氧化钠溶液调节混合溶液的pH值至5.5，并 最终用去离子水定容溶液至1000毫升；

其中所述的DNA保护剂为：对苯二酚：2.5克，加去离子水，溶解后定容至1000毫 升；

（2）对步骤（1）的反应体系进行重亚硫酸盐处理，处理程序为：将反应体系加热至 95摄氏度，保温10分钟，降温至64摄氏度，保温60分钟，然后冷却至室温（25摄氏度）， 得到第一溶液；

（3）将步骤（2）的第一溶液与结合液充分混合，以增加第一溶液中的DNA与硅膜 吸附柱的结合能力，混合比例为：第一溶液:结合液＝1:5，得到第二溶液；

其中所述的结合液的配方为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）：12克，乙二胺四乙酸二钠 （EDTA）：7克，将两种组分称量后与去离子水中混合，用浓盐酸调节混合溶液的pH值 至6.0，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（4）向硅膜吸附柱中加入500微升平衡液，在12000转/分钟下离心分离1分钟，倒 掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

其中所述的平衡液为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）：12克，与去离子水混合，用浓盐酸 调节混合溶液的pH值至9.5，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（5）将第二溶液加入到上述步骤（4）经过平衡处理的收集管内的硅膜吸附柱中，室 温放置2分钟，以12000转/分钟离心分离1分钟，倒掉收集管中的废液，将硅膜吸附柱 放入收集管中；

（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入600微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱 盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为45秒，倒去废液；

其中所述的漂洗液为无水乙醇：750毫升，称量后与去离子水中混合，最后用去离子 水定容溶液至1000毫升；

（7）向步骤（6）的硅膜吸附柱中继续加入600微升亚硫酸基团去除液，室温下放置 15分钟后进行离心处理，离心的转速为12000转/分钟，离心时间为45秒，倒去废液；

其中所述的亚硫酸基团去除液配方为：NaOH：12克，无水乙醇：750毫升，将两 种组分称量后与去离子水中混合，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（8）向步骤（7）的硅膜吸附柱中加入600微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱 盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为45秒，倒去废液，重复该步 骤一次；

（9）对步骤（8）的硅膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干 燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；

（10）在步骤（9）的硅膜吸附柱中加入20微升无核糖核酸酶的去离子水，室温下放 置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟， 得到纯化的DNA溶液。

上述方法中所述的硅膜吸附柱为商业化耗材，并且与其收集管配套使用。此吸附柱可 从天根生化科技（北京）有限公司购买，其货号为RK125-B。

为验证纯化后DNA的质量，需要通过甲基化特异性PCR反应来检测，具体流程如下：

（1）在200微升离心管中依次加2微升重亚硫酸盐处理后的DNA，1微升上游引物 （10微摩尔/升），1微升下游引物（10微摩尔/升），1.6微升dNTP（2.5毫摩尔/升），2 微升反应缓冲液和0.4微升的DNA聚合酶（2.5单位/微升），并用去离子水补足体积至20 微升。

（2）将步骤（1）配制好的反应体系进行PCR反应。反应过程中，预变性程序为：95 摄氏度5分钟；循环步骤为：94摄氏度20秒，60摄氏度30秒，72摄氏度20秒，循环次 数为35个；随后的延伸程序为72摄氏度5分钟；最后将反应体系冷却至室温（25摄氏度）。

（3）步骤（2）的反应结束后，取10微升反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

图1是本发明方法的实施例的结果图，通过本发明方法处理4个1000纳克人类基因 DNA组样品的后续甲基化特异性PCR电泳检测图。

其中，泳道M：脱氧核糖核酸分子量标准（TIANGEN，100bp DNA Ladder）。泳道1～4： 以使用本发明方法处理的4个人类基因组样品为模板，以按照转化后的p16基因序列设计 的引物为引物进行的甲基化特异性PCR结果。泳道5～8：以使用本发明方法处理的4个人 类基因组样品为模板，以按照转化前的p16基因序列设计的引物为引物进行的甲基化特异 性PCR结果。