氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中DNA损伤及DNA修复相关基因表达的研究

摘要

镉及其化合物是常见的工业毒物和环境污染物，研究证实镉可以诱发多种肿瘤，国际癌症研究机构(IARC)早在1993年就将其归类为第一类致癌物。近年来，对于镉毒作用机制的研究取得了很大进展，但其致癌的机制仍未完全阐明。 癌症的发生发展是内外环境因素导致的涉及多阶段和多种基因改变的复杂过程，这些基因的改变往往又与机体内遗传因素和环境致癌因素的长期累积性损伤作用有关。DNA损伤、修复、复制、耐受和逃逸机制与基因突变和细胞恶性转化具有十分密切的内在联系，其中DNA修复基因在维持基因组的稳定性和完善性中起着关键的作用。DNA修复基因表达的下调和突变都会影响细胞的DNA修复功能，从而极易导致癌症的发生。DNA修复系统划可分为碱基剪切修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)、错配修复(删R)、直接修复和双链断裂修复。它们分别参与一个或多个修复途径，其中与细胞转化及癌变关系较为密切的修复途径包括O<'6>-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)、MMR、NER和BER途径，而hMSH2、hMLH1、ERCC1、ERCC2、XRCC1、hOGG1、MGMT等7种基因是以上四个DNA修复途径的关键基因，可反映DNA修复系统的能力。这些DNA修复基因的异常，是导致细胞恶性转化的重要原因。目前DNA修复基因已被作为侯选癌症易感性基因。 为了深入研究DNA损伤、DNA修复相关基因表达及其突变情况在镉分子致癌机制中的作用，本课题运用多种先进的分子生物学手段检测了氯化镉诱导人支气管上皮细胞(16HBE)恶性转化过程中DNA损伤及7种DNA修复相关基因的表达情况，并对异常表达的DNA修复基因作外显子序列分析，这对进一步阐明镉的分子致癌机制有重要作用，并为高危人群的筛选和相关肿瘤的早期生物检测指标提供新的依据。 方法: 1、镉转化16HBE细胞中DNA损伤检测镉恶性转化人支气管上皮模型已于前期研究建立并公开发表。对非转化16HBE细胞、氯化镉诱导恶性转化16HBE第15代和35代细胞及其接种裸鼠成瘤的16HBE细胞进行单细胞凝胶电泳(SCEG)，以DNA损伤率和彗星尾长分析四种细胞的DNA损伤情况。 2、DNA修复相关基因mRNA表达水平分析通过对非转化16HBE细胞、氯化镉转化16HBE第5代、第15代、第35代细胞及其接种裸鼠成瘤的16HBE细胞进行总 RNA 抽提，利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，以β-Actin作为内参照对照，半定量检测hMSH2、hMLH1、ERCC1、ERCC2、XRCC1、hOGG1和MGMT共7种DNA修复相关基因的mRNA表达水平。 3、DNA修复相关基因蛋白表达的动态观察通过对非转化16HBE细胞、氯化镉诱导恶性转化16HBE第5代、第15代、第35代细胞及其接种裸鼠成瘤的16HBE细胞进行免疫组织化学(SP法)实验，检测hMSH2、hMLH1、ERCC1、ERCC2、XRCC1、hOGG1、MGMT等7种DNA修复基因蛋白表达的动态变化情况。 4、DNA修复基因外显子的序列检测对非转化16HBE对照细胞及其镉转化成瘤细胞进行DNA抽提，对异常表达的DNA修复基因的10个外显子 (hMSH2exon6、hMSH2 Exon7、hMSH2Exon8、hMSH2Exon9、hMSH2 exon12、ERCC1 exon3、ERCC1 exon4、XRCC1 exon6、XRCC1 exon9、hOGG1 exon7)进行PCR扩增和基因序列测定，检测各外显子的突变情况。 5、统计学方法运用SPSS12.0统计软件建立数据库，将实验数据输入数据库，计数资料的描述用率表示，各率的比较用 x<'2>检验，计量资料的统计描述用均数±标准差表示，多个样本均数的比较用单因素方差分析(ANOVA)，多个样本均数与对照组均数比较用Dunnett-t 检验。 结果: 1、氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中对DNA的损伤作用用单细胞凝胶电泳(SCEG)检测镉恶性转化16HBE细胞过程中DNA的损伤情况。结果显示，氯化镉恶性转化16HBE第15代、第35代细胞和氯化镉诱发16HBE恶性转化细胞接种裸鼠成瘤细胞的DNA损伤率分别达22.00％、46.75％和49.00％，明显高于非转化16HBE细胞的4.75％损伤率(P<0.001)，三种细胞彗星平均尾长也显著大于非转化的16HBE细胞(P<0.001)，提示镉化物可导致细胞DNA损伤。 2、镉转化16HBE细胞中DNA修复相关基因的mRNA表达各实验细胞总RNA经两步法RT-PCR扩增后获得各DNA修复相关基因cDNA目的产物，用凝胶成像系统扫描各DNA修改相关基因和β-Actin电泳条带。结果显示，随着CdCl<,2>对16HBE细胞转化代数增加，hMSH2、ERCC1、XRCC1和hOGG1基因mRNA表达水平表达逐渐减弱，与非转化16HBE细胞相比，CdCl<,2>恶性转化第35代细胞及转化细胞接种裸鼠成瘤细胞的hMSH2、ERCC1、XRCC1和hOGG1基因mRNA表达水平均有不同程度的降低(P<0.05)。而MGMT基因、hMLH1基因和ERCC2基因mRNA表达水平在氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中未见显著性差异(P>0.05)。提示某些DNA修复基因表达水平与镉的细胞转化及致癌性相关。 3、DNA修复相关基因蛋白表达的动态变化经过免疫组织化学(SP法)检测，DNA修复相关基因蛋白hMSH2、ERCC1、XRCC1和hOGG1在16HBE细胞和氯化镉第5代转化细胞呈现强阳性表达，随着CdCl<,2>对16HBE细胞转化代数增加，其表达逐渐减弱，至第35代细胞及转化细胞接种裸鼠成瘤细胞均呈现阴性表达。另外3个DNA修复相关基因MGMT、hMLH1和ERCC2在16HBE细胞和氯化镉第5代细胞、第15代细胞、第35代细胞及转化细胞接种裸鼠成瘤细胞均呈阳性表达。提示某些DNA修复基因蛋白的表达下调与镉的细胞转化及其致癌性有关。 4、异常表达的DNA修复相关基因突变情况对异常表达的DNA修复基因外显子进行测序分析，结果显示非转化16HBE对照细胞各基因外显子序列均与Genbank报道的序列一致，但在镉转化成瘤细胞中，发现hMSH2基因exon8在第1、2、7位点上均出现胸腺嘧啶T缺失，hMSH2基因exon9在第20和第182位点出现腺嘌呤A缺失，hMSH2基因exon12在241位点上出现腺嘌呤A插入，ERCC1基因exon4在第1位点出现腺嘌呤A缺失，hOGG1基因exon7在第162位点插入一个腺嘌呤A，所有的突变均为移码突变。其余在氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中异常表达的DNA修复相关基因的各外显子序列与对照组相比未见差异。提示DNA修复相关基因的突变可能与某些基因的表达异常有联系。 结论: 1、氯化镉对16HBE细胞恶性转化过程中，可见细胞DNA明显损伤，发现多种DNA修复相关基因hMSH2、ERCC1、XRCC1和hOGG1的mRNA和蛋白表达显著下调，其表达水平随着镉对16HBE细胞恶性转化程度而不断减弱，表明细胞DNA损伤及DNA修复能力下降可能是镉化物分子致癌的重要机制。 2、在氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中，hMSH2、ERCC1和hOGG1基因的某些外显子都出现移码突变。表明DNA修复基因的突变可能是导致其表达改变的原因之一。 3、DNA修复基因hMSH2、ERCC1．、XRCC1和hOGG1的mRNA和蛋白表达可以考虑作为镉致癌早期诊断的分子标记物的参考指标，和高危人群的筛检。

目录

英文缩略词汇表

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

结果

(一)氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中对DNA的损伤作用

(二)镉恶性转化16HBE细胞过程中DNA修复相关基因的mRNA表达情况

(三) DNA修复相关基因蛋白表达在镉恶性转化16HBE细胞过程中的动态变化

(四)异常表达的DNA修复相关基因的突变情况分析

讨论

结论

参考文献

镉致癌分子机理的研究进展

在校期间发表的论文

致谢