氯化镉诱发16HBE细胞系恶性转化过程中TIF3 p36的研究

摘要

目的镉及其化合物是普遍存在的环境污染物和致癌物，但其致癌机制仍不是很清楚。在多阶段癌变过程中，翻译水平上的基因表达调控是一重要环节。近来JosephP和雷毅雄等鉴定发现鼠蛋白翻译起始因子3(Translationinitiationfactor3，TIF3)为鼠的镉应答原癌基因TIF3，并发现TIF3在鼠细胞中呈现高表达。而鼠蛋白翻译起始因子3与人的翻译起始因子eIF3p36有99％的一致性。然而JosephP等研究使用的是鼠细胞，不能反映人细胞系接触镉之后其TIF3的实际表达情况。而且对人细胞来说，它是否也是镉的应答原癌基因尚是一个值得探讨的问题。本研究拟在建立氯化镉转化人支气管上皮细胞(16HBE)模型基础之上，对氯化镉恶性转化16HBE过程中不同阶段细胞中的eIF3p36mRNA的表达水平状况进行检测，为阐明镉的可能分子致癌机理提供进一步的线索，同时期望为职业接触重金属人群的生物效应标志的寻找与筛选提供初步依据。 方法1.氯化镉恶性转化16HBE模型的建立：经细胞毒性试验后，分别采用5μmol-1L、10μmol-1L、15μmol-1L浓度的氯化镉对非转化的16HBE进行染毒，每个剂量组两瓶.染毒间隔时间为12天，每次染毒24小时，染毒10次后，通过软琼脂集落形成试验和裸鼠成瘤试验鉴定细胞恶性转化程度。 2.各阶段细胞中总RNA的提取：氯化镉恶性转化16HBE模型中三个剂量组的不同阶段细胞经过含10％小牛血清的MEM培养液培养后，按TRIzol试剂盒说明书对这些细胞进行总RNA的提取，总RNA经无RNA酶的DNA酶处理以去除可能污染的DNA，在核酸定量仪下测定其浓度和纯度，并取5μl总RNA于2％琼脂糖凝胶电泳后，于紫外分析仪下检测总RNA的完整性。 3.阳性定量标准模板的制备：采用中山达安基因公司自制逆转录试剂盒，提取对照组细胞的总RNA，在普通PCR仪上进行RT-PCR扩增出翻译起始因子TIF3p36cDNA片段。割胶纯化此片段，将此片段进行梯度稀释，以用作荧光定量PCR(FQ-PCR)的阳性定量标准模板梯度。荧光定量采用灭菌三蒸水作为阴性对照。 4.Taqman荧光定量PCR检测TIF3p36mRNA的表达情况：从Genbank中调出人的TIF3基因序列，据此用Primerexpress2.0软件设计引物及探针序列，并在ABI3900台式高通量DNA合成仪上合成该引物及探针。在引物作用下，将不同剂量组、不同转化阶段的各细胞样品的总RNA中的目的基因mRNA片段进行逆转录后得其cDNA，再将阳性定量标准品、阴性质控灭菌三蒸水及样品目的基因mRNA的逆转录产物cDNA在PE7000全自动荧光定量PCR仪上、518nm荧光检测波长下，进行PCR扩增，检测各阶段细胞的TIF3表达状况。 结果1.镉恶性转化16HBE细胞模型的建立经氯化镉多次处理16HBE细胞至35代时，细胞生长速度加快，排列紊乱，失去接触抑制，出现复层生长，并可在软琼脂上生长，且呈时间剂量依赖关系。转化细胞接种裸鼠后，在裸鼠注射局部出现肿块，并逐渐长大，而阴性对照组未见肿块形成。肿块经病理组织学诊断为低分化鳞状细胞癌：镜下可见细胞大部分呈巢团状分布，少数形成乳头状腺样结构。间质量很少，细胞巢团中央可见灶状坏死区。细胞大小形态不一，核大深染，嗜硷性强，可见病理性分裂相。 2.细胞总RNA的完整性及纯度分析从镉转化16HBE的不同阶段细胞中提取总RNA，并在核酸蛋白定量仪上进行检测，其OD260/OD280值均在1.9～2.0之间，表明总RNA较纯；琼脂糖凝胶电泳结果显示28S及18S条带清晰，且28S条带的亮度是18S的2倍，5S条带未见或隐约可见，表明总RNA完整无降解，可用于进一步定量检测。 3.荧光定量PCR检测镉转化16HBE细胞模型中人TIF3mRNA的总体变化通过荧光定量PCR的检测，相对于非转化对照细胞(16HBE)，发现CdCl2诱发恶性转化不同阶段细胞(转化初期细胞、转化细胞和成瘤细胞)的人翻译起始因子TIF3P36mRNA表达水平均显著升高(P＜0.01或P＜0.05)，其中低剂量组(5μmol-1L)所转化的各阶段细胞的TIF3平均表达量分别是对照细胞的3.1倍、5.9倍和9.9倍；中剂量组(10μmol-1L)的各阶段转化细胞的TIF3平均表达量分别是对照细胞的7.1倍、6.8倍和14.8倍；高剂量组(15μmol-1L)的各阶段转化细胞的TIF3平均表达量分别是对照细胞的3.6倍、3.0倍和9.1倍。这些不同剂量组的研究结果提示，TIF3的异常表达量与CdCl2诱发16HBE细胞恶变程度之间有正相关关系。 4.荧光定量PCR检测各阶段细胞之间人TIF3P36mRNA表达变化的比较各剂量组CdCl2所诱发的成瘤细胞内，TIF3P36基因的表达水平均远高于对照及其他阶段细胞。说明每一剂量组CdCl2诱变细胞的不同阶段(即转化初期细胞、转化细胞和成瘤细胞)中，TIF3基因的表达量与镉诱导细胞恶性转化程度之间有正相关关系，但与镉的剂量本身大小似无明显关系。提示在人支气管上皮细胞恶性转化过程中，CdCl2的剂量或阈浓度并不重要，重要的是与镉本身的致癌性有关。 结论1.氯化镉具有使16HBE细胞系发生转化的能力，但是这需要较长时间和较多次的处理之后，才能使16HBE细胞系发生恶性转化；且氯化镉诱发16HBE细胞系的转化属于恶性转化，其在软琼脂中具有锚非依赖性生长能力，接种裸鼠后可产生肿瘤。 2.在氯化镉诱发16HBE细胞系恶变的过程中，存在着明显的翻译起始因子TIF3P36异常表达的现象，其表达水平与细胞恶变程度密切相关，这可能是镉致癌的分子机制之一。 3.氯化镉转化16HBE细胞恶变模型中，不同组镉剂量与各阶段转化细胞中TIF3P36基因的表达量无明显剂量-反应关系。提示人支气管上皮细胞的恶性转化过程中，CdCl2的致癌阈浓度不明显，可能与镉本身的致癌性有关。 4.不同剂量组CdCl2所诱发的成瘤细胞中，TIF3P36基因的表达水平均远高于对照及其他阶段细胞，提示经过裸鼠活体对恶性细胞进行筛选之后，部分具有恶性表型及基因型的转化细胞的遗传信息得以固定，在成瘤细胞内基因组的稳定性得以增加。

目录

英文缩略词表

前 言

第一部分氯化镉(CdCl2)诱发16HBE细胞系恶性转化的建立

第二部分氯化镉(CdCl2)诱发16HBE细胞系恶性转化过程中TIF3 p36的变化

结 论

参考文献

附图

综述翻译起始因子eIF3与金属致癌

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致 谢

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