包含双和汤或其乳酸菌发酵物的用于预防或治疗骨质疏松症的组合物

摘要

本发明涉及预防或治疗骨质疏松症的组合物。尤其涉及包含双合汤或在双合汤中接种乳酸菌进行发酵而制得的双合汤乳酸菌发酵物作为有效成分的预防或治疗骨质疏松症的药物组合物及健康食品。本发明的包含双合汤或双合汤乳酸菌发酵物的组合物对抑制破骨细胞的分化及相关基因表达具有显著效果，生物体内试验中也具有骨密度增加效果，因此，可用于预防及/或治疗骨质疏松症。

说明书

技术领域

本发明涉及用于预防及治疗骨质疏松症的组合物，尤其涉及含有双和 汤或其乳酸菌发酵物作为有效成分，并可用于骨质疏松症的预防及/或治疗 的组合物。

背景技术

机体骨组织一直处于成骨细胞形成组织与破骨细胞吸收组织的反复 的动态平衡中。当成骨细胞与破骨细胞失去平衡，骨质吸收超过骨质形成 将会引发骨质疏松症，特点是骨组织的钙减少，骨密质变薄，而骨髓腔随 之变大；如这种状态持续，骨硬度将会降低，易引发骨折。已知骨质疏松 症的原因很多，如年龄增大、运动不足、低体重、吸烟、钙摄入减少、闭 经、切除卵巢手术后等。尤其，在女性30岁之后持续骨质减少，而且闭 经后由于体内激素水平的变化，骨质急剧减少。虽有一些个体差异，但在 老年人、尤其闭经期以后女性来说出现骨质疏松现象是无法避免的，在发 达国家随着人口老龄化，人们逐渐重视治疗骨质疏松症的药物。一般骨质 疏松症分为三大类：第一类为原因不名(idiopathic)的骨质疏松症，第二 类为闭经期后雌激素减少引起的I型骨质疏松症，第三类为高龄男女中出 现的II型骨质疏松症。

目前用于治疗骨质疏松症的药物，大多数是雌激素类药物，但是此类 药物长期服用容易引发癌症、胆结石、血栓形成等副作用。骨质疏松症治 疗难点是不能短期用药，需长期用药，所以既可以长期服用又没有上述副 作用，还能代替雌激素的新药的开发极其必要。近年来，人们正在研究利 用大豆、豆制品等食品中含有的染料木黄酮(genistein)或黄豆苷元 (daidzein)等的植物雌激素(phytoestrogen)来开发副作用小、还可以长 期服用的预防及治疗治疗骨质疏松症的药剂。

虽然作为植物性激素的植物性雌激素在生物体内利用率较低，然而其 与雌激素受体-α(ER-α)及雌激素受体-β(ER-β)亲和性较好，同时 发生乳腺癌等副作用机率少，可做为骨质疏松症治疗药物E2的替代品。

目前最为大家所熟知的植物雌激素：黄豆苷元、染料木黄酮、刺芒柄 花素(formononetin)、鹰嘴豆芽素A(biochanin A)等的异黄酮(isoflanone) 类化合物；拟雌内酯(coumestrol)等的和香豆素(coumestan)类化合物； 肠内酯(enterolactone)等的木脂素(lignan)类化合物；及肠二醇(enterodiol) 等的酚类(phenol)化合物。上述化合物中的糖化合物在肠道细菌的β糖 苷酶(glucosidase)或胃酸水解后，作为以非糖苷形式的游离(free)异黄 酮而被吸收。

另外，双和汤又称双和散，主要治疗心力交瘁、气血两损、久病虚弱、 气虚多汗等症状。配方组成药物有白芍药、熟地黄、黄芪、当归、川芎、 桂皮、甘草、生姜、大枣，熬制成汤口服。

双和汤配方中药材的功效：桂皮活化脾胃功能，有助于治疗脾胃虚寒 引起的消化不良、脘腹冷痛、泄泻等；当归具有促进血液循环、抗癌、降 压、镇痛解痉、化淤活血、促进肠蠕动、改善便秘等效果；白芍药具有减 少神经及肌肉的过度紧张，从而镇痛，补血的效果；熟地黄补血；黄芪与 人参一样是补气的代表性药材，补气止汗、治痈肿等效果；川芎有助于血 液循环、镇痛止痛，治疗头痛，活化肝功能，具有造血功能，有助于治疗 贫血；干姜主治消化不良、呕吐、腹泻、促进血液循环；大枣健胃、滋补 经脉、舒心、补脾、补津液、补气，还调和各种药材的功效。

目前，在中药材中加入微生物进行发酵，获得有效成份的的技术有： 韩国注册专利第185619号，中药材熬制成汤后，在汤液中加入生长好风 味优异的乳酸菌进行混合培养、发酵，从而得到整肠作用的协同效果的技 术；韩国公开专利第2004-0078030号，选择部分谷物与一些中药材发酵的 大豆，通过低温速成技术将全部原料进行发酵，从而直接保持各原料的固 有性质并增强其效果的技术，等等。然而有关双和汤发酵药材相关文献却 几乎没有。

本发明人等，在调制好双和汤后，添加乳酸菌获得发酵物，并发现所 述双和汤及其乳酸菌发酵物具有之前未曾有过的优异的治疗或预防骨质 疏松症功效，从而完成本发明。

发明内容

本发明所要解决的问题

本发明的目的在于提供包括双和汤或其乳酸菌发酵物作为有效成分 的用于预防或治疗骨质疏松症的组合物。

用于解决问题的手段

为达到上述目的，本发明提供包括双和汤或其乳酸菌发酵物作为有效 成分的用于预防或治疗骨质疏松症的药物组合物。

另外，本发明还提供包括双和汤或其乳酸菌发酵物作为有效成分的用 于预防或治疗骨质疏松症的健康食品。

解决问题的方法

本发明提供包括双和汤或其乳酸菌发酵物作为有效成分的用于预防 或治疗骨质疏松症的药物组合物。

所述双和汤是由白芍药、熟地黄、黄芪、当归、川芎、桂皮、甘草、 生姜、大枣，提取而成，优选以白芍药10重量份、熟地黄4-6重量份、黄 芪4-6重量份、当归4-6重量份、川芎4-6重量份、桂皮2-5重量份、甘草 2-5重量份、生姜1-3重量份、大枣1-4重量份为比例制成生药混合物后提 取。通常利用纯水提取，但有时也可使用有机溶剂。还可使用有机溶剂C1 或C4低级醇、丙酮，或其水溶液，但不限于此。本发明中，所述“双和 汤”包括将药材混合物用水提取的，还包括使用有机溶剂提取的。

根据本发明的优选实施例，为调制双和汤乳酸菌发酵物(以下简称“双 和汤发酵物”)，首先向所述的生药混合物中加入2-15倍水，在70-100℃下 加热提取。提取物冷却后接种试料重量的0.5-5重量％、优选1重量％的乳 酸菌，在20-40℃、优选37℃下，发酵24-52小时、优选48小时，从而调 制成本发明的双和汤发酵物。如以利用水以外的其它有机溶剂作为提取溶 剂而制得的双和汤提取物来调制所述双和汤发酵物时，优选首先将所述提 取物干燥后稀释于水，并将乳酸菌接种于此进行发酵。

所述乳酸菌可使用分离菌株或市售乳酸菌株。具体有乳杆菌、双歧杆 菌、链球菌、明串珠菌、片球菌、乳酸球菌中的微生物，优选使用乳杆菌 中的微生物。本发明优选实施例中，使用诸如发酵乳杆菌(Lactobacillus  fermentum)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、干酪乳杆菌(Lactobacillus  casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus  acidophilus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylophilus)、弯曲乳杆菌 (Lactobacillus curvatus)、混淆乳杆菌(Lactobacillus confuses)、短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)及短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)的多种乳酸 菌制成双和汤发酵物(参考实施例1)，但可使用的乳酸菌不限于所述例示 的乳酸菌。乳酸菌培养基可选自MRS(Man-Rogosa-Sharpe)、乳糖、M17 及APT培养基(Asparagine Enrichment Broth)，但不限于此。双和汤可以 自制或使用市面销售产品。

本发明的双和汤或双和汤发酵物在临床上可通过口服或非口服途径 服用，并可以一般药物制剂形式使用。具体讲，本发明的双和汤或双和汤 发酵物在实际临床上以口服或非口服的各种制剂形式使用。上述双和汤或 双和汤发酵物制成制剂时，可使用一般填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、 崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂生产。经口施用固体制剂有片剂、 丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊等。此类固体制剂在双和汤或双和汤发酵物中 加入一种以上赋形剂混合制成，如，淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等。 单纯赋形剂以外，还可使用润滑剂，如硬脂酸镁滑石粉等。经口施用的液体制剂有悬浮剂、内服液剂 乳液剂、糖浆剂等，除了使用常见的单纯稀释剂水、液体 石蜡以外，还可使用各种赋形剂，如湿润剂、甜味剂、香料、保鲜剂等。 非经口施用制剂有无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冷冻干燥制 剂、栓剂。非水性溶剂、悬浮溶剂可使用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油之类 的植物油、油酸乙酯等可以注射的酯类等。 栓剂的基本底剂有Witepsol聚乙二醇、吐温可可脂、甘油、明胶等。同时，为了增强骨质疏松 症预防与治疗功能可以适当添加钙或维生素D₃。

剂量单位是，例如，可以为个体剂量的1、2、3或 者4倍；或1/2、1/3或1/4倍，个体剂量含有有效药物的1次剂量，这相 当于1日剂量的全部、1/2、1/3或1/4倍。

本发明双和汤或双和汤发酵物的人体剂量根据体内活性成份的吸收、 非活性化率及排泄速度、患者年龄、性别、状态、疾病程 度等适当选择，成人用量是10～300mg/Kg，优选用量是20～100mg/Kg， 每天可分1～6次服用。

本发明的组合物对小鼠经口施用及腹腔内用药时的毒理学实验结果 显示，经口毒性实验半数致死量(LD₅₀)是5g/Kg以上，为安全可用药物。

根据本发明一实施例，双和汤或双和汤发酵物处理破骨细胞时，明显 减少破骨细胞分化相关指标-TRAP活性及多核性破骨细胞的形成(参考图 1)，并且代表性的破骨细胞分化相关基因表达也明显减少(参考表2)。根 据利用多种乳酸菌发酵物的实施例，本发明的双和汤发酵物整体减少破骨 细胞分化相关指标-TRAP活性，在高浓度效果更明显，明显减少多核性破 骨细胞的形成(参考图2)。

根据本发明另一实施例，双和汤发酵物给药后，实验动物没有出现异 常症状或死亡。双和汤或双和汤发酵物处理后，不影响卵巢切除动物体重 增加(参考图3)，也未出现其他器官的重量变化(参考图4)。并且，通 过生化分析仪分析各组动物的血清结果显示，双和汤发酵物给药组中具有 明显降低卵巢切除后增加的甘油三酯浓度的效果(参考图5)。

而且，根据本发明另一实验例，卵巢切除引起的骨密度减少的模型中， 双和汤或双和汤发酵物给药后，显示出因卵巢切除而减少的大腿骨密度增 加的趋势(参考表6)，组织分析中也明显发现能改善骨小梁减少的趋势。

并且本发明还提供一种含有双和汤或双和汤发酵物作为有效成份的 预防或减缓骨质疏松症的健康食品。

以改善骨质疏松症为目的，本发明双和汤或双和汤发酵物可添加到健 康食品中。作为食品添加剂，双和汤或双和汤发酵物以一般的方式适当使 用，如可直接添加、与其它食品或其它食品成份混合皆可。有效成份的混 合量可根据使用目的(预防、健康或治疗)而适当决定。一般情况下，制 造食品或饮料时，双和汤或双和汤发酵物以相对于原料为30重量％以下， 优选10重量％以下的量添加。但以健康及卫生，或调节健康为目的长期摄 取时，所述量可低于所述范围，由于在食品安全方面无任何问题，因此有 效成分可以以所述范围以上的量来使用。

所述食品种类，无特别限制。可添加上述物质的食品有，肉类、火腿、 面包、巧克力、糖果类、零食类、饼干类、披萨、方便面、其它面类、口 香糖类、包括冰淇淋类等的奶制品、各种汤类、饮料、茶、能量饮料、酒 类饮料及维生素复合制剂等，包括通常意义上的所有健康食品。并且，本 发明的双和汤或双和汤发酵物也可用于韩医处方。

本发明健康饮料组合物与通常的饮料相同，作为添加成份可加入各种 食用香料或天然碳水化合物等。上述天然碳水化合物有如葡萄糖、果糖等 的单糖类；如麦芽糖、蔗糖等的双糖；及如糊精、环糊精等的多糖；如木 糖醇、山梨醇、赤藻糖醇等的糖醇。甜味剂有如奇异果甜蛋白、甜菊提取 物的天然甜味剂；或如糖精、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的合成甜味剂。所述 天然碳水化合物添加比例是每100ml双和汤或双和汤发酵物约0.01～0.04g， 优选0.02～0.03g。

除上述添加剂以外，双和汤或双和汤发酵物也可添加各种营养剂、维 生素、电解质、风味剂、色素、果胶酸及其盐、褐藻酸及其盐、有机酸、 保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、用于碳酸 饮料的碳酸剂。此外双和汤或双和汤发酵物也可含有为制成天然果汁、果 汁饮料及蔬菜饮料的果肉。此类成份可单个或混合使用，此类添加剂比例 并不大重要，但是相对于每100重量份双和汤或双和汤发酵物一般选择范 围为0.01～0.1重量份。

发明效果

综上所述，双和汤或双和汤发酵物具有优异的抑制破骨细胞分化及相 关基因表达的效果，在生物体内实验中证明具有增加骨密度的效果，可以 用于预防及/或治疗骨质疏松症。

附图说明

图1为分别表示RAW264.7细胞中RANKL(Receptor Activator for  Nuclear Factor kB Ligand)诱导的TRAP活性(A)和双和汤及由发酵乳 杆菌(NRRL(Norther Regional Research Laboratory，ARS Culture Collection， US Department of Agriculture，Peoria，Ill，USA)B4524)发酵的双和汤发酵物 对TRAP-阳性多核化破骨细胞的形成产生的效果(B)的图表及照片。

图2为表示由多种乳酸菌发酵的双和汤发酵物对在RAW264.7细胞中 RANKL诱导的TRAP活性(A)，TRAP-阳性多核化破骨细胞形成产生的 效果(B)的图表。S：双和汤的热水提取物样本，S-con：双和汤发酵前 灭菌样本，S658：格氏乳杆菌(NCFB(National Collection of Food Bacteria， Reading，United Kingdom)2233)发酵物，S692：干酪乳杆菌(KFRI#692) 发酵物，S-127：干酪乳杆菌(KCTC2180)发酵物，S-144：植物乳杆菌(ATCC 8014)发酵物，S-150：嗜酸乳杆菌(ATCC4356)发酵物，S-161：嗜淀 粉乳杆菌(NRRL B-4437)发酵物，S-166：弯曲乳杆菌(NRRL B-4562) 发酵物，S-217：嗜酸乳杆菌(KCTC3168)发酵物，S-227：混淆乳杆菌 (IH14005)发酵物，S-239：短乳杆菌(IH14003)发酵物，S-402：植物 乳杆菌(ATCC8014)发酵物，S-744：短双歧杆菌(ATCC15700)发酵 物，GM：培养基，RANLK：破骨细胞分化诱导细胞因子，LY294002：破 骨细胞分化抑制剂。

图3为双和汤及双和汤发酵物给药期间，卵巢切除大鼠体重变化图。 C；对照组，NC；阴性对照组，SHT；双和汤给药组，SFT；由发酵乳杆 菌发酵的双和汤给药组。

图4为表示大鼠大腿骨(A)及子宫(B)的组织形态学分析结果的照 片。C；对照组，NC；阴性对照组，SHT；双和汤给药组，SFT；由发酵 乳杆菌发酵的双和汤给药组。

具体实施方式

以下是本发明的实施实例详细说明。

但下述实施实例只是举例说明，并不限定本发明的范围。

实施例1：制作双合汤的乳酸菌发酵物

所述双和汤为由白芍药、熟地黄、黄芪、当归、川芎、桂皮、甘草、 生姜、大枣制成的汉方制剂，以一副为单位，制成50副用于本次实验。 一副用量为，白芍药9.37g、熟地黄3.75g、黄芪3.75g、当归3.75g、川 芎3.75g、桂皮2.81g、甘草2.81g、生姜1.49g、大枣2.0g，制成生药混 合物后进行提取。总50副的药材总量是1,674g，加入其10倍量的蒸馏水 16.74L，加热150分钟提取(韩国，Kyungseo熬药机 cosmos-600)，利用标准实验用筛(Standard testing sieve， Aperture500μm和150μm)过滤制成双和汤。在过滤后汤药内加入1％体 积(v/v)的乳酸菌(1-5×10⁸CFU/ml)，在37℃下发酵48小时后，利用 所述标准实验用筛过滤制成双和汤的乳酸菌发酵物。发酵物进行冷冻干燥 后至使用前保存于4℃。用于制备乳酸菌发酵物的乳酸菌有：发酵乳杆菌 (NRRL B-4524)、格氏乳杆菌(NCFB2233)、干酪乳杆菌 (KCTC2180，KFRI#692)、植物乳杆菌(ATCC8014)、嗜酸乳杆菌(ATCC 4356，KCTC3168)、嗜淀粉乳杆菌(NRRL B-4437)、弯曲乳杆菌(NRRL B-4562)、混淆乳杆菌(IH14005)、短乳杆菌(IH14003)及短双歧杆菌 (ATCC15700)。

实施例2：双和汤和发酵双和汤分化破骨细胞的效果

RAW264.7细胞在RANKL处理时显现作为破骨细胞分化的标志物的 TRAP活性的增加，并分化为破骨细胞(Minkin C.Calcif Tissue Int.1982 34(3)：285-90；Hsu H，et al.，1999，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，96，35403545)。 为了确认实施例1中制成的双和汤(SHT)和双和汤乳酸菌发酵物(SFT) 对破骨细胞分化的影响，将RAW264.7细胞以1×10³细胞/孔的密度，接 种于96孔板中，以25-200μg/ml浓度双和汤和双和汤发酵物处理3天， 使用含有分化诱导因子RANKL(100ng/ml)的α-MEM培养基(10％FBS) 作为培养基。

实验处理后第4天，进行确认TRAP阳性多核性破骨细胞形成的TRAP 染色后，检测了TRAP活性。用显微镜确认了多核性破骨细胞。破骨细胞 用10％福尔马林固定10分钟、乙醇/丙酮(1∶1，v/v)混合溶剂固定1分 钟后，利用染色试剂盒(Leukocyte Acid Phosphatase Kit387-A，Sigma，MO) 进行染色。利用装有DP控制器的显微镜(Olympus Opitical  Co.Ltd.，Tokyo，Japan)观察分化的多核性破骨细胞。 为测定TRAP活性，在所述装有固定的破骨细胞的96-孔板加入含10mM 酒石酸钠、5mM对硝基苯磺酸盐(Sigma， MO)的柠檬酸盐缓冲液(50mM，pH4.6)后，在37℃培养1小时。将此 酶反应液与等量0.1N NaOH混合后，在410nm波长测定吸光度。TRAP 活性以与对照组相比的百分比换算而显示。

结果显示，双和汤及由发酵乳杆菌发酵的双和汤发酵物在200μg/ml 浓度明显降低了TRAP活性(图1，p＜0.01)。同时，用双和汤及由发酵乳 杆菌发酵的双和汤发酵物处理时，通过TRAP染色确认了多核性破骨细胞 形成的减少(图1B)，并且利用由多种乳酸菌发酵的双和汤发酵物的实验 结果显示，本发明的双和汤发酵物整体降低了TRAP活性，特别是在100 μg/ml浓度其效果显著(图2的A，p＜0.01)。并且，由嗜淀粉乳杆菌发酵 的双和汤发酵物处理时，通过TRAP染色确认了多核性破骨细胞形成的减 少(图2的B)。

实施例3.双和汤的破骨细胞分化相关基因的表达

已知TRAP、c-Src及组织蛋白酶K基因是破骨细胞分化与骨吸收功能 相关的必需基因，在破骨细胞分化时其表达增加(Hsu H，et al.，1999，Proc. Nat.Acad.Sci.USA，96，35403545)。为了确认抑制TRAP染色和活性的双 和汤对所述三种基因的表达所产生的效果，进行了实时定量PCR(real time  quantitative PCR)。为此，进行RANKL处理，并在24小时后，利用TRIzol (Invitrogen，Inc.NY，USA)分离总RNA。对于破骨细胞分化相关基因特 异的引物通过在线引物设计程序进行设计(Rozen and Skaletsky，2000)，对 各基因的引物使用下表1中所示的正向(Forward)及反向(Reverse)引 物对。cDNA合成使用2μg的总RNA，1μM的Oligo-dT₁₈引物及10单 位的RNA酶抑制剂RNasin(Promega，WI，USA)和Omniscript逆转录酶 (Qiagen，CA)进行合成。基于SYBR Green的定量PCR扩增：50倍稀释的 cDNA和20pmol引物与Brilliant SYBR Green Master Mix(Stratagene，CA) 混合后，利用Stratagene Mx3000P Real-time PCR system进行扩增。PCR程 序如下：为了聚合酶活性，在95℃下维持10分钟后，在94℃下40秒(变 性)，在60℃下40秒(退火)，及在72℃下1分钟(延长)，重复40回；此 后在95℃下1分钟，在55℃下30秒，及在95℃下维持30秒，制作生成 的PCR产物的温度解离曲线(temperature dissociation curves，又称熔化曲 线(melting curves))。所有实验进行3个重复，PCR数据根据2^-ΔΔCT方法 进行分析(Livak and Schmittgen，2001)。此时，将GAPDH做为PCR的参 照组来使用，将GAPDH标准化的2^-ΔΔCT数据经Student’st-检验分析后， 认为p＜0.05为明显的差异。

结果显示，RANKL处理时上述三种基因表达急剧增加，但在双和汤 处理组(200μg/ml)的情况下c-Src及组织蛋白酶K基因的表达明显降低 (图2，p＜0.05)。

表1

[Table1]

表2

[Table2]

RAW264.7细胞中，双和汤对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因 mRNA表达的影响

  TRAP c-Src 组织蛋白酶K RANKL未处理 1.09±0.61 1.01±0.08 1.10±0.66 RANKL处理 1.97±0.01 3.14±0.15^*19150.28±281.57^*RANKL+SHT(200μg/ml) 1.64±0.08 0.75±0.10^*#4512.74±2397.99^*#

^*p＜0.05，与RANKL未处理组相比有显著差异。

^#p＜0.05，与RANKL处理组相比有显著差异。

实施例4.双和汤和双和汤发酵物对卵巢切除大鼠脏器与血液生化指标的影响

为了验证抑制破骨细胞的形成的双和汤和双和汤发酵物对抑制骨质 疏松症的效果，对卵巢切除大鼠经口施用12周双和汤和发酵乳杆菌发酵 的双和汤发酵物。详细说明，使用9周龄雌鼠(Orient，首尔，韩国)进 行试验，收取动物时用肉眼检查外观后，在动物室放置7天驯化后，再进 行卵巢切除手术。术后7天选择健康动物36只分组进行实验。各实验组 根据表3进行分组。驯化期间对健康动物称重，以5g为间隔进行区分， 选择接近各自平均体重的动物。如此选择的动物每9只以顺序体重为基础 而成为均等体重的方式随机进行分配。动物的个体识别通过色素染色法及 个体识别卡法实施。每组每只动物试验物质以一日临床用量(15ml/Kg，2 次/日)为准施用，固定试验动物的背部皮肤后，利用一次性经口探测器 (Fujigami，Japan)和注射管灌胃。双和汤发酵物剂量由于发酵后产率变化 较双和汤多2％。对照组(C组)及阴性对照组(NC组)灌相同量的蒸馏 水。

结果显示，双和汤和双和汤发酵物给药期间，无异常或死亡动物，各 周各组体重变化显示，双和汤和双和汤发酵物给药1周开始，SHT给药组、 SFT给药组及NC组体重与C组相比明显增加(p＜0.01)。但与NC组相比， SHT给药组与SFT给药组体重变化不明显(图3)。

双和汤和双和汤发酵物施用12周后，从动物摘出的子宫、脑、甲状 腺、心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺上肉眼观察不到异常。子宫重 量结果显示，与C组相比NC组子宫重量明显减少，约84％(p＜0.01)，由 双和汤和双和汤发酵物施用所引起的子宫重量无变化。并且其它各个组间 脏器重量无差异(表4)。

利用生化分析仪，分析各组动物血清，结果显示，与C组比较NC组 甘油三酯浓度显著增加(p＜0.05)。与NC组相比，SFT组总胆固醇与LDL- 胆固醇显著增加，但甘油三酯浓度显著减少(p＜0.05)(表5)。

表3

[table3]

C；对照组，NC；阴性对照组，SHT；双和汤给药组，SFT；由发酵 乳杆菌发酵的双和汤给药组。

表4

[Table4]

双和汤和双和汤发酵物给药12周后脏器重量(n＝9，单位：g)

  C NC SHT SFT 子宫 0.69±0.21 0.11^a±0.02 0.10^a±0.02 0.11^a±0.02 脑 1.98±0.10 2.00±0.10 1.97±0.08 2.00±0.10 脑垂体 0.0164±0.0031 0.0134±0.0016 0.0125±0.0019 0.013±0.0017 肺 1.50±0.15 1.14±0.14 1.54±0.30 1.50±0.14 心脏 1.14±0.11 1.10±0.10 1.18±0.12 1.17±0.14 肝脏 8.71±0.72 8.17±1.11 8.96±0.99 9.10±0.51 脾脏 0.66±0.14 0.63±0.07 0.68±0.12 0.71±0.11 肾脏(左) 1.07±0.11 0.96±0.10 1.04±0.14 1.08±0.07 肾脏(右) 1.07±0.12 0.95±0.11 1.03±0.10 1.06±0.05 肾上腺(左) 0.04±0.01 0.03±0.01 0.03±0.01 0.03±0.01 肾上腺(右) 0.03±0.01 0.02±0.01 0.03±0.01 0.03±0.01

数值以平均值±S.D.表示

^ap＜0.01，与C比较差异显著。

表5

[Table5]

双和汤和双和汤发酵物给药12周后，卵巢切除大鼠血清的生化指标 (n＝9)

数值以平均值±S.D.表示

^ap＜0.05，与C比较差异显著。

^bp＜0.05，与NC比较差异显著。

实施例5.双和汤和双和汤发酵物对卵巢切除大鼠的骨密度与骨小梁的影响

为了验证双和汤和双和汤发酵物对由卵巢切除引发的骨密度减少的 效果，双和汤和发酵乳杆菌发酵的双和汤发酵物经口施用12周后，测定 胸骨与大腿骨的骨密度(骨矿物质密度，bone mineral density，BMD)。动 物剖检时，摘取右侧大腿骨清除肌肉后于10％福尔马林固定7天，除去福 尔马林后，通过Dual energy X-ray Absorption(LUNAR Corp.，Madison，WI， USA)测量骨密度。摘取的大腿骨经10％福尔马林固定后，甲酸脱灰，70％ 乙醇到100％乙醇和丙酮顺序脱水，最后经二甲苯处理后用石蜡包埋。石 蜡包埋的骨组织以3μm厚度进行切片，经苏木精-伊红染色 (Hematoxyline&eosin，H&E)。在光学显微镜(Nikon eclipse80i，Nikon， Japan)下进行观察，对骨小梁消失程度进行分析。

结果显示，与C组比较，卵巢切除后NC组胸骨与大腿骨BMD明显 减少(p＜0.01)。而且与NC组相比之下SHT给药组的因卵巢切除减少的 大腿骨BMD明显增加(p＜0.01)，SFT给药组虽然大腿骨BMD有增加趋 势，但无统计学意义(表6)。

组织分析中C组有正常大腿骨骨小梁和骨髓内脂肪蓄积，NC组骨小 梁明显减少、骨髓内脂肪蓄积增加(图4A)。但是，SHT给药组与SFT给 药组骨小梁减少得到微弱改善。同时子宫组织分析中，C组能见到正常子 宫组织，NC组可以见到子宫萎缩，双和汤和双和汤发酵物给药后，萎缩 的子宫无变化(图4B)。

表6

[Table6]

双和汤和双和汤发酵物对卵巢切除大鼠BMD的影响(n＝9)

  C NC SHT SFT 胸骨(g/cm²) 0.062±0.002 0.054^a±0.003 0.054±0.003 0.055±0.002 大腿骨(g/em²) 0.238±0.015 0.208^a±0.010 0.223^b±0.009 0.213±0.007

数值以平均值±S.D.表示

^ap＜0.01，与C比较差异显著。

^bp＜0.05，与NC比较差异显著。

制造实施例1：制造含有双和汤或双和汤发酵物的医药组合物

<1>制造糖浆剂

含有2％(重量/体积)的双和汤或双和汤发酵物作为有效成分的糖浆， 通过以下方法制成。实施例1中制成的双和汤或双和汤发酵物粉末、糖精、 糖溶于80g温水，冷却后，加入由甘油、糖精、香料、乙醇、山梨酸、蒸 馏水组成的溶液进行混合，向该混合物加水使其达到100ml。

上述糖浆剂的组成成份如下：

双和汤或双和汤发酵物............2g

糖精....................................0.8g

糖......................................25.4g

甘油....................................8.0g

香料.................................0.04g

乙醇....................................4.0g

山梨酸....................................0.4g

蒸馏水....................................定量

<1-2>制造片剂

含有有效成份15mg的片剂，以如下方法制成。

将双和汤或双和汤发酵物250g与乳糖175.9g、土豆淀粉180g及胶体 硅酸32g混合，上述混合物中加入10％明胶溶液后，粉碎并通过14目网 筛过滤，干燥后加入土豆淀粉160g、滑石50g及硬脂酸镁5g，混合制成 片剂。

双和汤或双和汤发酵物....................................250g

乳糖.........................................................175.9g

土豆淀粉......................................................180g

胶体硅酸......................................................32g

10％明胶溶液

土豆淀粉......................................................160g，

滑石............................................................50g

硬脂酸镁.........................................................5g

制造实施例2：制造含有双和汤或双和汤发酵物的健康食品

<2-1>制造食品

制造含有双和汤或双和汤发酵物的健康食品方法如下。

1.制造烹调调料

以双和汤或双和汤发酵物20～95重量％制成保健用烹调调料。

2.制造番茄酱及酱汁(sauce)

将双和汤或双和汤发酵物0.2～1.0重量％添加至番茄酱或酱汁制成保 健用番茄酱或酱汁。

3.制造面粉类食品

将双和汤或双和汤发酵物0.5～5.0重量％添加至面粉，利用该混合物 制成面包、蛋糕、饼干(cookie)、脆饼干(cracker)及面条，从而制成保 健食品。

4.制造汤汁及肉汤(gravies)

将双和汤或双和汤发酵物0.1～5.0重量％添加至汤料及肉汤，制成保 健加工肉制品、面条类汤汁及肉汤。

5.制造碎牛肉(ground beef)

将双和汤或双和汤发酵物10.0％(重量)添加至碎牛肉，制成保健碎 牛肉。

6.制造乳制品(dairy products)

将双和汤或双和汤发酵物5～10.0％(重量)添加至牛奶，利用所述牛 奶制成黄油及冰淇淋等多种奶制品。

7.制造禅食

糙米、大麦、糯米、薏米以公知方法进行α化干燥，烘烤后利用粉碎 机制成粒度60目的粉末。将以公知的方法蒸干的黑豆、黑芝麻、紫苏进 行烘烤后用粉碎机粉碎制成粒度60目的粉末。将双和汤或双和汤发酵物 在真空浓缩机中减压浓缩、喷雾、热风干燥、并进行粉碎，获得粒度60 目的干燥粉末。所述制作的谷物类、种子类及双和汤或双和糖发酵物的干 燥粉末以以下比例制成。

谷物类(糙米30重量％、薏米15重量％、大麦20重量％)

种子类(紫苏种子7重量％、黑豆8重量％、黑芝麻7重量％)

双和汤或双和汤发酵物干燥粉(3重量％)

灵芝(0.5重量％)

地黄(0.5重量％)

<2-2>制造饮料

1.制造碳酸饮料

添加白糖5～10％、柠檬酸0.05～0.3％、焦糖0.005～0.02％、维生素 C0.1～1％后，再加入79～94％纯水制成糖浆，上述糖浆在85～98℃下灭菌 20～180秒后，与冷却水以1∶4的比例混合，然后注入0.5～0.82％碳酸气 体，制成含有双和汤或双和汤发酵物的碳酸饮料。

2.制造健康饮料

果糖糖浆(0.5％)、寡糖(2％)、白糖(2％)、食盐(0.5％)、水(75％) 等材料与双和汤或双和汤发酵物均匀混合，瞬间杀菌后装入玻璃瓶或塑料 瓶等小包装容器中而制成健康饮料。

3.制造蔬菜饮料

将双和汤或双和汤发酵物5g添加至番茄或胡萝卜汁1,000ml制成保健 蔬菜饮料。

4.制造果汁饮料

将双和汤或双和汤发酵物1g添加至苹果或葡萄汁1,000ml制成保健果 汁饮料。