利用秀丽隐杆线虫鉴定白酒中塑化剂的方法

摘要

利用秀丽隐杆线虫鉴定白酒中塑化剂的方法，它涉及一种鉴定塑化剂的方法。本发明解决了常规的塑化剂检测方法中操作复杂、仪器依赖度大、成本高的技术问题。本方法如下：一、配制胆固醇乙醇溶液；二、配制磷酸盐缓冲液；三、制备线虫培养基；四、向线虫培养基中均匀涂入大肠杆菌OP50菌液，于37℃培养8～12h，接入8～12条性成熟的秀丽隐杆线虫，培养24h并观测产卵数量，秀丽隐杆线虫产卵数低于正常水平，则证明待检白酒含有塑化剂。本检测方法对实验条件要求低，不需要特殊的高精分析仪器和检测设备，实验操作方便，成本低廉，易于掌握。

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定塑化剂的方法。

背景技术

塑化剂(plasticizer)又名增塑剂，为邻苯二甲酸酯同系物。2011年5月起台湾食品中先后检出DEHP、DINP、DNOP、DBP、DMP、DEP等6种邻苯二甲酸酯类塑化剂成分，药品中检出DIDP，6月1日卫生部紧急发布公告，将邻苯二甲酸酯(也叫酞酸酯)类物质，列入食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单。而2012年年底被曝光的“酒鬼”酒塑化剂超标2.6倍，引起人们关于塑化剂及对白酒特别是高档酒食品安全的恐慌和质疑。

塑化剂为一种环境荷尔蒙，对人和动物会造成免疫力及生殖力下降。目前各国可容忍的60公斤成人每日摄取量范围为1.2-8.4毫克，用白鼠为材料研究发现服食“塑化剂”的老鼠，诞下的后代以雌性为主，并会影响其正常的排卵；即使诞下雄性，其生殖器官较正常的小三分之二，而精子数量亦大减，表明“塑化剂”具有生殖毒性。一些研究也表明塑化剂对幼儿的潜在危害会更大，表现出一定的发育毒性。

邻苯类塑化剂用量巨大，使用范围广，污染面积和影响人数就都蔚为可观，目前邻苯二甲酸酯类可以说是全球分布最为广泛的一类人工合成环境污染物，在空气、水、土壤和灰尘中都可以检测到。邻苯二甲酸酯类在生物体重还有富集作用，水生生物体内有明显的该类化合物的残留物，最终人们通过食物和空气等途径暴露其中。关于塑化剂的检测尚无统一标准。常规化学检测和仪器分析中存在操作复杂，仪器依赖度大，成本高的不足。

发明内容

本发明的目的是为了解决常规的塑化剂检测方法中操作复杂、仪器依赖度大、成本高的技术问题，提供了一种利用秀丽隐杆线虫鉴定白酒中塑化剂的方法。

利用秀丽隐杆线虫鉴定白酒中塑化剂的方法如下：

一、称取1.0g胆固醇，溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；

二、配制磷酸盐缓冲液：称取13.6g KH₂PO₄、1.8g KOH，加蒸馏水定容至100mL，调节pH值为6.0；

三、将15～20g琼脂粉、2～3g蛋白胨、0.10～0.12g CaCl₂、0.11～0.13g MgSO₄和2～3g NaCl加入到1000mL的烧杯中，加入1ml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml；

四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120℃灭菌15～25min，然后降温至50～60℃，在无菌环境下加入0.5～5ml待测白酒，然后将混合物在无菌环境下倒入6cm培养皿中，在温度为20℃的无菌环境下干燥8h～12h，即得线虫培养基；

五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为1×10⁹个/mL～2×10⁹个/mL大肠杆菌OP50菌液0.8～1.2mL，于37℃培养8～12h，接入8～12条性成熟的秀丽隐杆线虫，培养24h并观测产卵数量，秀丽隐杆线虫产卵数低于正常水平(21个以上为正常产卵数量)，则证明待检白酒含有塑化剂。

本发明通过测定线虫产卵率，借助塑化剂对线虫的生殖毒性鉴定白酒中是否含有塑化剂。适量酒精对线虫的繁殖没有影响，将微量白酒添加入线虫培养基中，如果此培养基上生长的线虫产卵率低于正常水平，便可确定此类白酒还有塑化剂。

本发明与传统的利用分析仪器鉴定白酒中塑化剂的方法相比，敏感度高，利用线虫繁殖指标，可以直观高效的确定白酒中是否含有塑化剂。本检测方法对实验条件要求低，不需要特殊的高精分析仪器和检测设备，实验操作方便，成本低廉，易于掌握。

附图说明

图1是实验一至实验四中每条秀丽隐杆线虫的产卵数，图中a表示实验一中每条秀丽隐杆线虫的产卵数，b表示实验二中每条秀丽隐杆线虫的产卵数，c表示实验三中每条秀丽隐杆线虫的产卵数，d表示实验四中每条秀丽隐杆线虫的产卵数，e表示实验五中每条秀丽隐杆线虫的产卵数，f表示实验六中每条秀丽隐杆线虫的产卵数，g表示实验七中每条秀丽隐杆线虫的产卵数，h表示实验八中每条秀丽隐杆线虫的产卵数，i表示实验九中每条秀丽隐杆线虫的产卵数。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式利用秀丽隐杆线虫鉴定白酒中塑化剂的方法如下：

一、称取1.0g胆固醇，溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；

二、配制磷酸盐缓冲液：称取13.6g KH₂PO₄、1.8g KOH，加蒸馏水定容至100mL，调节pH值为6.0；

三、将15～20g琼脂粉、2～3g蛋白胨、0.10～0.12g CaCl₂、0.11～0.13g MgSO₄和2～3g NaCl加入到1000mL的烧杯中，加入1ml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml；

四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120℃灭菌15～25min，然后降温至50～60℃，在无菌环境下加入0.5～5ml待测白酒，然后将混合物在无菌环境下倒入6cm培养皿中，在温度为20℃的无菌环境下干燥8h～12h，即得线虫培养基；

五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为1×10⁹个/mL～2×10⁹个/mL大肠杆菌OP50菌液0.8～1.2mL，于37℃培养8～12h，接入8～12条性成熟的秀丽隐杆线虫，培养24h并观测产卵数量，秀丽隐杆线虫产卵数低于正常水平，则证明待检白酒含有塑化剂。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中将16～19g琼脂粉、2g蛋白胨、0.10g CaCl₂、0.11g MgSO₄和2g NaCl加入到1000mL的烧杯中。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中将15g琼脂粉、2g蛋白胨、0.10g CaCl₂、0.11g MgSO₄和2g NaCl加入到1000mL的烧杯中。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中将20g琼脂粉、3g蛋白胨、0.12g CaCl₂、0.13g MgSO₄和3g NaCl加入到1000mL的烧杯中。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤四中降温至52～58℃。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤四中降温至55℃。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤四中在温度为20℃的无菌环境下干燥10h。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤五中向线虫培养基中均匀涂入浓度为1×10⁹个/mL～2×10⁹个/mL大肠杆菌OP50菌液1mL。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤五中于于37℃培养10h。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤五中接入10条性成熟的秀丽隐杆线虫。其它与具体实施方式一相同。

采用下述实验验证本发明效果：

实验一：利用秀丽隐杆线虫鉴定白酒中塑化剂的方法如下：

一、称取1.0g胆固醇，溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；

二、配制磷酸盐缓冲液：称取13.6g KH₂PO₄、1.8g KOH，加蒸馏水定容至100mL，调节pH值为6.0；

三、称取18g琼脂粉、2.5g蛋白胨、0.11g GaGl₂、0.12g MgSO₄、2.5g NaCl于1000mL烧杯，加入1ml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml；

四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120℃灭菌20min，将温度降至55℃，于超净工作台无菌环境下将混合物倒入6cm培养皿中，最后在温度为20℃的无菌环境下干燥10h，即得到线虫培养基；

五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为2×10⁹个/mL大肠杆菌OP50菌液1mL，于于37℃培养10h，接入10条性成熟的秀丽隐杆线虫，培养24h并观测产卵数量。

本实验步骤四中不加入任何其他物质，本实验中24h后秀丽隐杆线虫产卵率为正常培养基中生长的线虫繁殖水平。

实验二：利用秀丽隐杆线虫鉴定白酒中塑化剂的方法如下：

一、称取1.0g胆固醇，溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；

二、配制磷酸盐缓冲液：称取13.6g KH₂PO₄、1.8g KOH，加蒸馏水定容至100mL，调节pH值为6.0；

三、称取18g琼脂粉、2.5g蛋白胨、0.11g GaGl₂、0.12g MgSO₄、2.5g NaCl于1000mL烧杯，加入1ml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml；

四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120℃灭菌20min，将温度降至55℃，于超净工作台无菌环境下加入5ml无水乙醇，于超净工作台无菌环境下将混合物倒入6cm培养皿中，最后在温度为20℃的无菌环境下干燥10h，即得到线虫培养基；

五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为2×10⁹个/mL大肠杆菌OP50菌液1mL，于37℃培养10h，接入10条性成熟的秀丽隐杆线虫，培养24h并观测产卵数量。

本实验步骤四中加入不含包括塑化剂在内任何杂质的纯酒精，本实验中24h后秀丽隐杆线虫产卵率处于正常水平。

实验三：利用秀丽隐杆线虫鉴定白酒中塑化剂的方法如下：

一、称取1.0g胆固醇，溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；

二、配制磷酸盐缓冲液：称取13.6g KH₂PO₄、1.8g KOH，加蒸馏水定容至100mL，调节pH值为6.0；

三、称取15g琼脂粉、2g蛋白胨、0.10g CaCl₂、0.11g MgSO₄、2g NaCl于1000mL烧杯，加入1ml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml；

四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120℃灭菌15～25min，将温度降至50～60℃，于超净工作台无菌环境下加入0.5ml无水乙醇，于超净工作台无菌环境下将混合物倒入6cm培养皿中，最后在温度为20℃的无菌环境下干燥8h～12h，即得到线虫培养基；

五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为1×10⁹个/mL个/mL大肠杆菌OP50菌液0.8mL，于37℃培养8h，接入10条性成熟的秀丽隐杆线虫，培养24h并观测产卵数量。

本实验步骤四中加入不含包括塑化剂在内任何杂质的纯酒精，本实验中24h后秀丽隐杆线虫产卵率处于正常水平。

实验四：利用秀丽隐杆线虫鉴定白酒中塑化剂的方法如下：

一、称取1.0g胆固醇，溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；

二、配制磷酸盐缓冲液：称取13.6g KH₂PO₄、1.8g KOH，加蒸馏水定容至100mL，调节pH值为6.0；

三、称取18g琼脂粉、2.5g蛋白胨、0.11g CaCl₂、0.12g MgSO₄、2.5g NaCl于1000mL烧杯，加入1ml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml；

四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120℃灭菌20min，待温度降至55℃，于超净工作台无菌环境下加入5mL乙醇质量浓度为53％的白酒，于超净工作台无菌环境下将混合物倒入6cm培养皿中，最后在温度为20℃的无菌环境下干燥10h，即得到线虫培养基；

五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为2×10⁹个/mL大肠杆菌OP50菌液1mL，于37℃培养10h，接入10条性成熟的秀丽隐杆线虫，培养24h并观测产卵数量。

本实验步骤四中加入不含塑化剂的乙醇质量浓度为53％的白酒，本实验中24h后线虫产卵率处于正常水平。

实验五：利用秀丽隐杆线虫鉴定白酒中塑化剂的方法如下：

一、称取1.0g胆固醇，溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；

二、配制磷酸盐缓冲液：称取13.6g KH₂PO₄、1.8g KOH，加蒸馏水定容至100mL，调节pH值为6.0；

三、称取18g琼脂粉、2.5g蛋白胨、0.11g CaCl₂、0.12g MgSO₄、2.5g NaCl于1000mL烧杯，加入1ml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml；四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120℃灭菌20min，待温度降至55℃，于超净工作台无菌环境下加入5mL乙醇质量浓度为42％的白酒，于超净工作台无菌环境下将混合物倒入6cm培养皿中，最后在温度为20℃的无菌环境下干燥10h，即得到线虫培养基；

五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为2×10⁹个/mL大肠杆菌OP50菌液1mL，于37℃培养10h，接入10条性成熟的秀丽隐杆线虫，培养24h并观测产卵数量。

本实验步骤四中加入不含塑化剂乙醇质量浓度为的42％白酒，本实验中24h后线虫产卵率处于正常水平。

实验六：利用秀丽隐杆线虫鉴定白酒中塑化剂的方法如下：

一、称取1.0g胆固醇，溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；

二、配制磷酸盐缓冲液：称取13.6g KH₂PO₄、1.8g KOH，加蒸馏水定容至100mL，调节pH值为6.0；

三、称取18g琼脂粉、2.5g蛋白胨、0.11g CaCl₂、0.12g MgSO₄、2.5g NaCl于1000mL烧杯，加入1ml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml；四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120℃灭菌20min，待温度降至55℃，于超净工作台无菌环境下加入1mL塑化剂(邻苯二甲酸酯)含量为0.1mg/L、质量浓度为42％的乙醇，于超净工作台无菌环境下将混合物倒入6cm培养皿中，最后在温度为20℃的无菌环境下干燥10h，即得到线虫培养基；

五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为2×10⁹个/mL大肠杆菌OP50菌液1mL，于37℃培养10h，接入10条性成熟的秀丽隐杆线虫，培养24h并观测产卵数量。

本实验步骤四中加入塑化剂浓度为0.1mg/L、乙醇质量浓度为42％的白酒，本实验中24h后线虫产卵率显著低于正常水平。

实验七：利用秀丽隐杆线虫鉴定白酒中塑化剂的方法如下：

一、称取1.0g胆固醇，溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；

二、配制磷酸盐缓冲液：称取13.6g KH₂PO₄、1.8g KOH，加蒸馏水定容至100mL，调节pH值为6.0；

三、称取18g琼脂粉、2.5g蛋白胨、0.11g CaCl₂、0.12g MgSO₄、2.5g NaCl于1000mL烧杯，加入1ml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml；

四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120℃灭菌20min，待温度降至55℃，于超净工作台无菌环境下加入1mL塑化剂(邻苯二甲酸酯)含量为0.2mg/L的质量浓度为42％的乙醇，于超净工作台无菌环境下将混合物倒入6cm培养皿中，最后在温度为20℃的无菌环境下干燥10h，即得到线虫培养基；

五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为2×10⁹个/mL大肠杆菌OP50菌液1mL，于37℃培养10h，接入10条性成熟的秀丽隐杆线虫，培养24h并观测产卵数量。

本实验步骤四中加入塑化剂浓度为0.2mg/L、乙醇质量浓度为42％的白酒，本实验中24h后线虫产卵率显著低于正常水平。

实验八：利用秀丽隐杆线虫鉴定白酒中塑化剂的方法如下：

一、称取1.0g胆固醇，溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；

二、配制磷酸盐缓冲液：称取13.6g KH₂PO₄、1.8g KOH，加蒸馏水定容至100mL，调节pH值为6.0；

三、称取18g琼脂粉、2.5g蛋白胨、0.11g CaCl₂、0.12g MgSO₄、2.5g NaCl于1000mL烧杯，加入1ml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml；

四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120℃灭菌20min，待温度降至55℃，于超净工作台无菌环境下加入1mL塑化剂(邻苯二甲酸酯)含量为0.3mg/L、乙醇质量浓度为42％的乙醇，于超净工作台无菌环境下将混合物倒入6cm培养皿中，最后在温度为20℃的无菌环境下干燥10h，即得到线虫培养基；

五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为2×10⁹个/mL大肠杆菌OP50菌液1mL，于37℃培养10h，接入10条性成熟的秀丽隐杆线虫，培养24h并观测产卵数量。

本实验步骤四中加入塑化剂浓度为0.3mg/L、乙醇的42％白酒，本实验中24h后线虫产卵率显著低于正常水平。

实验九：利用秀丽隐杆线虫鉴定白酒中塑化剂的方法如下：

一、称取1.0g胆固醇，溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；

二、配制磷酸盐缓冲液：称取13.6g KH₂PO₄、1.8g KOH，加蒸馏水定容至100mL，调节pH值为6.0；

三、称取18g琼脂粉、2.5g蛋白胨、0.11g CaCl₂、0.12g MgSO₄、2.5g NaCl于1000mL烧杯，加入1ml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml；

四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120℃灭菌20min，待温度降至55℃，于超净工作台无菌环境下加入5mL塑化剂(邻苯二甲酸酯)含量为0.1mg/L、乙醇质量浓度为42％乙醇，于超净工作台无菌环境下将混合物倒入6cm培养皿中，最后在温度为20℃的无菌环境下干燥10h，即得到线虫培养基；

五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为2×10⁹个/mL大肠杆菌OP50菌液1mL，于37℃培养10h，接入10条性成熟的秀丽隐杆线虫，培养24h并观测产卵数量。

本实验步骤四中加入塑化剂浓度为0.1mg/L、乙醇质量浓度为42％的白酒，本实验中24h后线虫产卵率显著低于正常水平。