5聚体CRP的制造方法、制造5聚体CRP的基因重组蚕及其制造方法、编码单体狗CRP的DNA及含该DNA的表达载体

摘要

将编码单体CRP的DNA导入蚕而制成基因重组蚕，接下来，回收由制成的基因重组蚕制造的5聚体CRP，纯化，从而以高效率制造5聚体CRP。

说明书

【技术领域】

本发明涉及使用蚕的5聚体CRP（C-Reactive Protein；C反应性 蛋白质）的制造方法。本发明还涉及制造5聚体CRP的基因重组蚕及 其制造方法。本发明另外涉及编码单体狗CRP的DNA及含该DNA 的表达载体。

【背景技术】

CRP是在5个单体CRP非共有结合性地结合而形成的5聚体 CRP的状态下有活性的蛋白质。在活体内，几乎全部CRP作为5聚 体CRP存在。再有，在以下本说明书中，在不特别指定的场合，CRP 是指5聚体CRP。

在临床检查领域中，CRP是在急性炎症或急性的组织崩解中增加 的急性期蛋白质之一种，已知是代表性的炎症标志物。CRP的定量在 看引起炎症－组织障碍的各种的疾病的活动性－重症度－经过之时不 可或缺。从而，在医院、临床检查中心等中，CRP被常规测定。在此 时使用的CRP测定试剂盒中，多含标准CRP溶液，每日消费大量的 CRP。因此，要求高纯度并且廉价的CRP的制造。

为了制造高纯度的CRP，检查基因工程学的方法的利用。作为基 因工程学的CRP的制造方法，唯一商业上实现的是以大肠杆菌作为宿 主的（专利文献1）。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1:美国专利第5702921号说明书

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

为了使用基因工程学的方法制造高纯度且相比并且现状更廉价的 CRP，有在升高宿主的产生CRP的效率的同时，降低宿主产生的CRP 的回收所要求的成本的必要。为了实现这些，不得不探索相比以往的 宿主更适宜CRP的制造的宿主。

即，在专利文献1中记载的以大肠杆菌作为宿主的CRP的制造方 法中，由kil基因的作用而在原本并周质区域中蓄积的CRP分泌到菌 体外。通过CRP分泌到培养基中，使CRP的纯化变得容易，以图CRP 回收的成本降低。但是，过量表达kil基因的菌株一般不适宜高密度 培养（Yoon,S.H.et al.,Recent Pat.Biotechnol.,4,23-29,2010）。因此， 用于得高纯度的CRP的浓缩－纯化作业变得烦琐，实现产生CRP的 效率的进一步升高困难。

鉴于此实状，本发明的课题是提供可以高效率制造5聚体CRP 的新的5聚体CRP的制造方法、适宜5聚体CRP的制造的基因重组 蚕及其制造方法、编码单体狗CRP的DNA及含该DNA的表达载体。

【解决课题的技术方案】

本发明人为了解决上述的课题而锐意研究的结果，令人惊讶地发 现，在不共表达如促进分泌的kil基因等，并且维持由非共有结合形 成的5聚体结构和活性的状态下，使基因重组蚕表达分泌5聚体CRP 而以高效率制造，另外，可从基因重组蚕容易地回收制造的5聚体 CRP，从而完成本发明。

从而，本发明涉及以下的［1］～［25］所列举的，5聚体CRP 的制造方法、制造5聚体CRP的基因重组蚕及其制造方法、编码单体 狗CRP的DNA及含该DNA的表达载体。

［1］5聚体CRP的制造方法，其具有：制成导入了编码单体 CRP的DNA的基因重组蚕的制成步骤，以及回收由制成的基因重组 蚕制造的5聚体CRP的回收步骤。

［2］［1］所述的制造方法，其中上述制成步骤是导入下列 DNA的制成基因重组蚕的步骤：编码转录因子的DNA，所述转录因 子与编码绢丝腺特异性地表达的蛋白质的DNA的启动子的下游功能 性地结合；和编码单体CRP的DNA，所述单体CRP与该转录因子的 目标启动子的下游功能性地结合。

［3］［1］所述的制造方法，其中上述制成步骤是使下列蚕交 配而制成基因重组蚕的步骤：导入编码转录因子的DNA的蚕，所述 转录因子与编码绢丝腺特异性地表达的蛋白质的DNA的启动子的下 游功能性地结合，和导入编码单体CRP的DNA的蚕，所述单体CRP 与该转录因子的目标启动子的下游功能性地结合。

［4］［2］或［3］所述的制造方法，其中上述转录因子是GAL4， 目标启动子是UAS。

［5］［2］～［4］之任一项所述的制造方法，其中上述回收步 骤是制成的基因重组蚕回收其绢丝腺中制造的5聚体CRP的步骤。

［6］［1］～［5］之任一项所述的制造方法，其中上述CRP 是狗CRP。

［7］［1］～［6］之任一项所述的制造方法，上述编码单体 CRP的DNA是编码含SEQ ID NO:1所示的序列的氨基酸序列的 DNA。

［8］［1］～［7］之任一项所述的制造方法，其中上述编码单 体CRP的DNA是含SEQ ID NO:4所示的碱基序列的DNA。

［9］基因重组蚕，其导入有编码单体CRP的DNA，且制造5 聚体CRP。

［10］基因重组蚕，其导入有编码转录因子的DNA，所述转录 因子与编码绢丝腺特异性地表达的蛋白质的DNA的启动子的下游功 能性地结合、和编码单体CRP的DNA，所述单体CRP与该转录因子 的目标启动子的下游功能性地结合，在绢丝腺中制造5聚体CRP。

［11］［10］所述的基因重组蚕，上述转录因子是GAL4，目标 启动子是UAS。

［12］［9］～［11］之任一项所述的基因重组蚕，其中上述CRP 是狗CRP。

［13］［9］～［12］之任一项所述的基因重组蚕，其中上述编 码单体CRP的DNA是编码含SEQ ID NO:1所示的序列的氨基酸序 列的DNA。

［14］［9］～［13］之任一项所述的基因重组蚕，其中上述编 码单体CRP的DNA是含SEQ ID NO:4所示的碱基序列的DNA。

［15］制造5聚体CRP的基因重组蚕的制造方法，其包括将编 码单体CRP的DNA导入蚕的导入步骤。

［16］在绢丝腺中制造5聚体CRP的基因重组蚕的制造方法， 其包括将下列DNA导入蚕的导入步骤：编码转录因子的DNA，所述 转录因子与编码绢丝腺特异性地表达的蛋白质的DNA的启动子的下 游功能性地结合，和编码单体CRP的DNA，所述单体CRP与该转录 因子的目标启动子的下游功能性地结合。

［17］［16］所述的制造方法，其中上述导入步骤是使下列蚕交 配而制成导入DNA的蚕的步骤：导入编码转录因子的DNA的蚕，所 述转录因子与编码绢丝腺特异性地表达的蛋白质的DNA的启动子的 下游功能性地结合，和导入编码单体CRP的DNA的蚕，所述单体 CRP与该转录因子的目标启动子的下游功能性地结合。

［18］［16］或［17］所述的制造方法，其中上述转录因子是 GAL4，目标启动子是UAS。

［19］［15］～［18］之任一项所述的制造方法，其中上述CRP 是狗CRP。

［20］［15］～［19］之任一项所述的制造方法，其中上述编码 单体CRP的DNA是编码含SEQ ID NO:1所示的序列的氨基酸序列 的DNA。

［21］［15］～［20］之任一项所述的制造方法，上述编码单体 CRP的DNA是含SEQ ID NO:4所示的碱基序列的DNA。

［22］编码单体狗CRP的DNA，其为编码具有编码含SEQ ID NO:1所示的序列的氨基酸序列的碱基序列的单体狗CRP的DNA。

［23］［22］所述的编码单体狗CRP的DNA，其中上述碱基序 列是含SEQ ID NO:4所示的序列的碱基序列。

［24］表达载体，其为具有［22］或［23］所述的编码单体狗 CRP的DNA的碱基序列的表达载体。

［25］［24］所述的表达载体，其中上述碱基序列与UAS的下 游功能性地结合。

再有，在本发明中，5聚体CRP是指5个单体CRP非共有结合 性地结合而形成的5聚体，在活体内有活性。其中，在活体内有活性 是指，优选为，作为在临床检查领域中利用的CRP测定试剂盒中含的 校准物，另外，在制成CRP测定试剂盒中含的抗CRP抗体之时， 作为抗原，可与血清来源的CRP同样地发挥功能而使用。

另外，本发明中“与启动子的下游功能性地结合的”是指启动子与 DNA结合至通过转录因子结合到启动子，在启动子的下游存在的DNA 的表达被诱导。其中，即便是DNA与其他基因结合，形成与其他基 因产物的融合蛋白质时，只要通过转录因子结合到启动子，此融合蛋 白质的表达被诱导，则该DNA与该启动子的下游功能性地结合。

【发明效果】

由本发明的5聚体CRP的制造方法，可以高效率制造与血清来源 CRP有同等的活性的5聚体CRP。尤其是在本发明的5聚体CRP的 制造方法中，由于基因重组蚕表达分泌5聚体CRP，5聚体CRP的回 收容易。由本发明的5聚体CRP的制造方法制造的CRP作为在临床 检查领域中利用的CRP测定试剂盒中含的校准物非常地有用。另外， 由本发明制造的CRP，可在制成CRP测定试剂盒中含的抗CRP抗体 之时，作为抗原利用。

【附图说明】

【图1】是示pBac-UAS-cfCRP-SV40的结构的图。

【图2】是示将由本发明的制造方法得到的蚕产生狗CRP的稀释 系列和作为对照的狗血清来源CRP的稀释系列在狗CRP测定ELISA 试剂盒中测定之时的稀释直线性的图。横轴表示以原液的浓度作为1 时的稀释液的浓度（n/16、0≤n≤16）。纵轴表示CRP浓度（ng/ml）。 黑色圆点示蚕产生狗CRP的稀释直线性，白色圆点示狗血清来源CRP 的稀释直线性。

【图3】是示使得由本发明的制造方法得到的蚕产生狗CRP和作 为对照的人血清来源CRP经历Superde×200凝胶过滤层析的结果的 图。横轴表示溶出时间（分）。纵轴表示各溶出级分中含的狗CRP 或人CRP的量（相对全溶出级分中含的CRP量的比例：重量%）。 黑色圆点及实线示相对于蚕产生狗CRP的凝胶过滤层析的结果，白菱 形及虚线示相对于人血清来源CRP的凝胶过滤层析的结果。

【实施方式】

作为由本发明的5聚体CRP的制造方法制造的CRP，可举出例 如，人、狗、小鼠、大鼠、兔、驴、山羊、马、猪、鸟、猫等来源的 CRP。在其中也是，人来源的CRP、或者狗或猫等的观赏用动物来源 的CRP是优选的，狗或猫来源的CRP是更优选的，狗来源的CRP 是特别优选的。这是由于在临床检查领域中人CRP的需要高，另外， 从近年的宠物医疗的发展，狗CRP或猫CRP等的观赏物用动物来源 的CRP的需要也升高。特别是狗或猫等的观赏用动物的血清来源的 CRP供给量少，无法满足日益升高的需要是现状。在其中也是，从作 为宠物的普及度，狗或猫CRP的需要和供给的不均衡极其大。通过由 本发明的5聚体CRP的制造方法以高效率制造人CRP、狗CRP、猫 CRP或其其他观赏用动物来源的CRP，对应这些的需要变得可能。 尤其是，狗CRP尚未确立基因工程学的制造方法，可由本发明的5 聚体CRP的制造方法的狗CRP的高效率制造的意义大。

本发明中共通使用的编码单体CRP的DNA是编码前述的由本发 明的5聚体CRP的制造方法制造的CRP的单体的DNA。优选为，是 编码人CRP或狗CRP的单体的DNA，更优选为是编码单体狗CRP 的DNA。

其中，作为编码单体狗CRP的DNA，优选为可举出编码含SEQ ID NO:1所示的序列的氨基酸序列的DNA，更优选为可举出含SEQ ID NO:4所示的碱基序列的DNA。另外，编码作为单体人CRP的 DNA，优选为可举出编码含SEQ ID NO:7所示的序列的氨基酸序列 的DNA，更优选为可举出含SEQ ID NO:9所示的碱基序列的DNA。

再有，在编码含SEQ ID NO:1或7所示的序列的氨基酸序列的 DNA中，包括编码只要功能性地同等，向此氨基酸序列导入选自1～ 数个氨基酸的缺失、取代、附加及插入的至少1种的变异，并且，与 此序列有一定的相同性的氨基酸序列的DNA。其中，作为一定的相同 性，可举出例如，60%以上的相同性，可举出优选为70%以上的相同 性、更优选为80%以上的相同性、再优选为90%以上的相同性。

另外，在SEQ ID NO:4或9所示的碱基序列中，包括只要其所 编码的蛋白质功能性地同等，导入选自1～数个碱基的缺失、取代、 附加及插入的至少1种的变异，并且，与此序列有一定的相同性的碱 基序列。其中，作为一定的相同性，可举出例如，60%以上的相同性， 可举出优选为70%以上的相同性、更优选为80%以上的相同性、再优 选为90%以上的相同性。

SEQ ID NO:1所示的单体狗CRP的氨基酸序列与SEQ ID NO:7 所示的单体人CRP的氨基酸序列的序列相同性是60%。另外， SEQ ID NO:4所示的单体狗CRP的碱基序列与SEQ ID NO:9所示 的单体人CRP的碱基序列的序列相同性是60%。

其中，序列相同性可使用EBI提供的CLUSTALW2工具，由在 默认的条件下的配对比对算出。

在本说明书中，“功能性地同等”是指由无变异的氨基酸序列构成 的蛋白质/多肽，和由有变异的氨基酸序列构成的蛋白质/多肽有同样 的生物学或生物化学活性。其中，同样的生物学或生物化学活性是指， 具体而言，作为临床检查领域中利用的CRP测定试剂盒中含的校准 物，另外，在制成CRP测定试剂盒中含的抗CRP抗体之时，作为抗 原，可与血清来源的CRP同样地发挥功能而使用。

本发明中共通使用的编码单体CRP的DNA是编码有信号肽的单 体CRP的DNA是更优选的。通过有信号肽，由本发明的5聚体CRP 的制造方法制造的5聚体CRP的分泌被促进，5聚体CRP的回收变 得容易。

信号肽是指，在小胞体膜结合性的核糖体上合成之后，分泌蛋白 质通过脂质双层之时必要的氨基酸残基。分泌蛋白质一般地，在最终 有活性的成熟型蛋白质的N末端侧连结信号肽的状态下被合成，信号 肽在分泌后被除去。

作为编码可在本发明使用的信号肽的DNA，可举出编码例如，人、 狗、小鼠、大鼠、兔、驴、山羊、马、鸟、猫、酵母、昆虫来源的信 号肽的DNA。在其中也是，在制造狗CRP时，编码狗CRP来源的信 号肽或昆虫来源的信号肽的DNA是优选的。另外，在制造人CRP时， 编码人CRP来源的信号肽或昆虫来源的信号肽的DNA是优选的。

其中，作为编码狗CRP来源的信号肽的DNA，可举出优选为编 码含SEQ ID NO:2所示的序列的氨基酸序列的DNA，可举出更优选 为含SEQ ID NO:5所示的碱基序列的DNA。另外，作为编码人CRP 来源的信号肽的DNA，可举出优选为编码含SEQ ID NO:8所示的序 列的氨基酸序列的DNA，可举出更优选为含SEQ ID NO:10所示的碱 基序列的DNA。

可在本发明使用的编码有信号肽的单体CRP的DNA是在前述的 本发明中共通使用的编码单体CRP的DNA的5′末端连结前述的可在 本发明使用的编码信号肽的DNA的DNA。

其中，作为编码有信号肽的单体CRP的DNA，可举出优选为编 码含SEQ ID NO:3所示的序列的氨基酸序列的DNA，可举出更优选 为含SEQ ID NO:6所示的碱基序列的DNA。

再有，在编码含SEQ ID NO:3所示的序列的氨基酸序列的DNA 中，包括编码只要功能性地同等，向此氨基酸序列导入选自1～数个 氨基酸的缺失、取代、附加及插入的至少1种的变异，并且，与此序 列有一定的相同性的氨基酸序列的DNA。其中，作为一定的相同性， 可举出例如，60%以上的相同性，可举出优选为70%以上的相同性、 更优选为80%以上的相同性、再优选为90%以上的相同性。

另外，在SEQ ID NO:6所示的碱基序列中，包括只要其所编码 的蛋白质功能性地同等，导入选自1～数个碱基的缺失、取代、附加 及插入的至少1种的变异，并且，与此序列有一定的相同性的碱基序 列。其中，作为一定的相同性，可举出例如，60%以上的相同性，可 举出优选为70%以上的相同性、更优选为80%以上的相同性、再优选 为90%以上的相同性。

在本发明的5聚体CRP的制造方法的制成步骤或本发明的基因重 组蚕的制造方法的导入步骤中，将含前述的本发明中共通使用的编码 单体CRP的DNA的导入DNA导入到被转化蚕，从而制成基因重组 蚕。

其中，在本发明的5聚体CRP的制造方法的制成步骤、或者本发 明的基因重组蚕的制造方法的导入步骤中的导入DNA只要含前述的 本发明中共通使用的编码单体CRP的DNA即可，优选为，包括被编 码在蚕来源的绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的DNA的启动子直接 的或间接控制表达的前述的编码单体CRP的DNA，更优选为，包括 编码与编码在蚕来源的绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的DNA的启 动子的下游功能性地结合的转录因子的DNA，和与该转录因子的目标 启动子的下游功能性地结合的前述的编码单体CRP的DNA。这是因 为，利用编码在蚕来源的绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的DNA的 启动子，则由于作为在夹杂蛋白质少的限制的空间内高密度表达蛋白 质的器官的绢丝腺中5聚体CRP被表达，所以5聚体的回收－纯化变 得容易，高效率制造5聚体CRP变得可能。再者，通过与该启动子功 能性地结合的转录因子和该转录因子的目标启动子的组合的选择，可 升高从导入DNA的蛋白质的生产效率。

再有，在DNA的表达中，“由启动子直接的或间接控制表达”是 指，目的DNA与启动子的下游功能性地结合，或者，编码转录因子 的DNA与启动子的下游功能性地结合，由此转录因子诱导目的DNA 的表达。

再有，编码蚕来源的绢丝腺特异性地表达的蛋白质的DNA的启 动子是指，只要是在蚕细胞内有效地活动的启动子，则任何均可，加 工为在蚕的绢丝腺中特异性地诱导蛋白质的表达的启动子是优选的。 可举出例如，编码丝心蛋白L链蛋白质、丝心蛋白H链蛋白质、p25 蛋白质、由丝胶蛋白I基因合成的蛋白质、由丝胶蛋白II基因合成的 蛋白质之任何的DNA的启动子。

另外，作为与编码蚕来源的绢丝腺特异性地表达的蛋白质的DNA 的启动子的下游功能性地结合的转录因子和其目标启动子的组合，可 举出例如，转录因子GAL4和UAS序列、转录因子TetR和TRE序 列。在其中也是，GAL4和UAS是优选的。这是因为，通过利用使用 GAL4和UAS的GAL4/UAS系统（Fischer,J.A.et al.,Nature, 332,853-856,1988；Brand,A.H&Perrimon,N.,Development,118, 401-415,1993），可正确地控制目的基因的表达部位或时期、量，可 使在多种组织中容易地表达。另外，即便使表达的基因是致死性的基 因，系统的制出也变得可能。

作为本发明中使用的导入DNA的优选的一实施方式，可举出包 括编码连结到编码由丝胶蛋白I基因合成的蛋白质的DNA的启动子的 下游的GAL4的DNA，和与UAS序列的下游连结的前述的编码有信 号肽的单体CRP的DNA的DNA。

在本发明的5聚体CRP的制造方法的制成步骤、或者本发明的基 因重组蚕的制造方法的导入步骤中的被转化蚕不特别限制，但为了5 聚体CRP的高效率生产，由编码丝心蛋白蛋白质等的构成绢丝的蛋白 质的DNA区域（包括编码区域、启动子区域、非翻译区域）的变异， 构成绢丝的蛋白质的生产被抑制的蚕是优选的。作为这样的蚕，可举 出构成绢丝的蛋白质的生产被抑制的突变系统的蚕、优选为由该变异 构成绢丝的蛋白质的生产被抑制的裸蛹系统的蚕，但构成绢丝的蛋白 质的生产抑制的原因与是否人为，另外，是否依赖于自然界中发生的 变异无关，只要是构成绢丝的蛋白质的生产被抑制的蚕即可。

另外，作为被转化蚕，可使用有产下非休眠卵的性质的蚕、有产 下休眠卵的性质的蚕（例如作为实用品种的，群马200、春岭、钟月、 锦秋、钟和等）。其中，休眠卵是指产卵后胚发生暂时性地停止的卵， 非休眠卵是指产卵后胚发生不停止，幼虫孵化的卵。

在本发明的5聚体CRP的制造方法的制成步骤、或者本发明的基 因重组蚕的制造方法的导入步骤中将导入DNA导入被转化蚕的DNA 导入方法只要是导入DNA稳定整合到被转化蚕的染色体的方法，就 不特别限定。例如，可使用构建含导入DNA的基因重组载体，将此 基因重组载体微注射到蚕卵的方法（Tamura,T.et al.,Nat. Biotechnol.,18,81-84,2000）、使用基因枪的方法等。在其中也是， 在转座子的反向末端重复序列之间，在上述在本发明中，与含有导入 蚕的DNA的基因重组载体的同时，含编码转座子转移酶的DNA的辅 助载体同时微注射到蚕卵的方法（Tamura,T.et al.,Nat.Biotechnol., 18,81-84,2000）是优选的。

作为上上述辅助载体，可举出pHA3PIG（Tamura,T.et al.,Nat. Biotechnol.,18,81-84,2000），但不限于此。

作为上述转座子，piggyBac是优选的，但不限于此，可使用 mariner、minos等。

再有，将导入DNA分割而导入被转化蚕也可能。例如，可举出 向导入2分割之中之一方的DNA的蚕所产卵的卵以前述的方法人为 地导入另一方的DNA的方法、或者将2分割的DNA之中两方以前述 的方法导入一个卵的方法。

在本发明的5聚体CRP的制造方法的制成步骤、或者本发明的基 因重组蚕的制造方法的导入步骤中，将导入DNA分割而导入各自不 同的被转化蚕，接下来，使得导入各自不同的DNA的成体基因重组 蚕交配，从而制成导入DNA全部导入的基因重组蚕也可。

优选为，在前述的导入DNA之中，将编码与编码在蚕来源的绢 丝腺中特异性地表达的蛋白质的DNA的启动子的下游功能性地结合 的转录因子的DNA以前述的DNA导入方法导入被转化蚕。接下来， 在前述的导入DNA之中，将与上述转录因子的目标启动子的下游功 能性地结合的前述的本发明中共通使用的编码单体CRP的DNA以前 述的DNA导入方法导入别的被转化蚕。接下来，使得这2种的成体 蚕交配，作为第二代的蚕得到有全部前述的导入DNA的基因重组蚕。

在此方法中，可向一个被转化蚕导入转录因子，由此转录因子决 定表达的组织、时期、量等。因此，通过与导入要表达的基因的系统 交配，可有不制作多个系统而改变各组织或时期、量等的益处。另外， 通过表达目的基因，基因重组蚕变得不育时，也可制出系统。还有， 通过转录因子的选择，可增加由导入DNA的生产物的量。

作为本发明的伴随交配的基因重组蚕制成的优选的一实施方式， 使得导入编码与编码由丝胶蛋白I基因合成的蛋白质的DNA的启动子 的下游连结的GAL4的DNA的蚕，和导入含与UAS序列的下游连结 的前述的编码有信号肽的单体CRP的DNA的DNA的蚕交配而制成 基因重组蚕。

本发明的5聚体CRP的制造方法的制成步骤中制成的基因重组蚕 是含编码单体CRP的DNA的前述的导入DNA稳定整合到染色体， 制造5聚体CRP的蚕，优选为，是表达而分泌5聚体CRP的蚕。其 中，基因重组蚕分泌5聚体CRP，从而从蚕的5聚体CRP的回收变 得容易。

在更优选的实施方式中，本发明的5聚体CRP的制造方法中使用 的基因重组蚕在绢丝腺中制造5聚体CRP，在特别优选的实施方式中， 在绢丝腺中表达分泌5聚体CRP而制造。在作为在夹杂蛋白质少的限 定的空间内高密度表达蛋白质的器官的绢丝腺制造5聚体CRP，在绢 丝腺中分泌5聚体CRP，5聚体CRP的回收－纯化变得容易，高效率 制造5聚体CRP成为可能。

本发明的5聚体CRP的制造方法的回收步骤是通过将前述的基因 重组蚕制造的5聚体CRP、优选为前述的基因重组蚕表达分泌而制造 的5聚体CRP回收，纯化来制造5聚体CRP的步骤。

在本发明的5聚体CRP的制造方法的回收步骤中，作为回收前述 的基因重组蚕制造的5聚体CRP的方法，可举出从含有5聚体CRP 的分泌物提取5聚体CRP的方法。其中作为分泌物，可举出在绢丝腺 中分泌的液状绢或绢丝、或者脂肪体的分泌物。尤其是，由中部绢丝 腺或后部绢丝腺分泌的液状绢或绢丝由于其分泌量特别多而优选，由 于回收容易，液状绢是更优选的。

作为从绢丝腺的液状绢的回收方法，可举出例如，将到吐丝期的 蚕解剖，将绢丝腺摘出之后，在缓冲液中用镊子或网分割绢丝腺，或 者将绢丝腺放入缓冲液中，将缓冲液用涡旋混合器搅拌，将缓冲液中 放出的液状绢回收的方法。除此之外，可举从基因重组蚕吐丝的茧回 收的方法、使用表面活性剂的方法或用水溶液溶解等的本领域技术人 员公知的方法作为绢丝的回收方法。

另一方面，作为从脂肪体的分泌物的回收方法，可举出从幼虫体 内摘出脂肪体，在缓冲液中用镊子或网分割脂肪体，回收缓冲液中放 出的分泌物的方法或，将分泌物从脂肪体分泌到体液，将该体液分离 的等的本领域技术人员公知的方法。

作为在本发明中的含有5聚体CRP的分泌物的回收方法的优选的 一实施方式，可举出将到吐丝期的蚕解剖，将绢丝腺摘出之后，在缓 冲液中提取液状绢而回收的方法。通过此方法，回收液状绢后的5聚 体CRP的纯化变得容易。

在本发明的5聚体CRP的制造方法的回收步骤中，分泌物中含的 5聚体CRP的纯化可通过利用例如，凝胶过滤层析、亲和层析、阳离 子交换层析、阴离子交换层析、或者这些的组合进行。在其中也是， 优选亲和层析可容易地纯化5聚体CRP。作为亲和层析，优选使用磷 酰胆碱柱，其可不变性5聚体CRP而维持结构地纯化。

由本发明的5聚体CRP的制造方法制造的5聚体CRP的反应性， 可例如，使用本领域技术人员中公知的ELISA法评价。在ELISA法 中，可利用公知的抗CRP抗体。

如在后段的实施例中详述，由本发明的5聚体CRP的制造方法制 造的5聚体CRP，在ELISA法中的反应性评价中，与血清来源的CRP 同样地示浓度依赖性的反应性。从而，通过由本发明的5聚体CRP 的制造方法制造的5聚体CRP，可代替CRP测定试剂盒等中使用的 血清来源CRP。

本发明中提供的基因重组蚕是含编码单体CRP的DNA的前述的 导入DNA稳定整合到染色体，制造5聚体CRP的蚕，优选为，是表 达而分泌5聚体CRP的蚕。其中，基因重组蚕分泌5聚体CRP，从 而从蚕的5聚体CRP的回收变得容易。

在更优选的实施方式中，本发明中提供的基因重组蚕在绢丝腺中 制造5聚体CRP，在特别优选的实施方式中，在绢丝腺中表达分泌5 聚体CRP而制造。在作为在夹杂蛋白质少的限定的空间内高密度表达 蛋白质的器官的绢丝腺制造5聚体CRP，在绢丝腺中分泌5聚体CRP， 5聚体CRP的回收－纯化变得容易，高效率制造5聚体CRP成为可 能。

本发明中提供的基因重组蚕、或者本发明的5聚体CRP的制造方 法的制成步骤中制成的基因重组蚕表达原来蚕无的5聚体CRP，但可 以与通常的蚕同样的方法继代维持。还有，子孙的蚕可制造5聚体 CRP。

例如，可将卵在通常的条件下催青，将孵化的蚁蚕用人工饲料等 喂养，与通常的蚕在同样的条件下饲育而饲育至5令蚕。

本发明中提供的基因重组蚕、或者本发明的5聚体CRP的制造方 法中使用的基因重组蚕与通常的蚕同样地蛹化。在蛹的阶段区别雌雄， 发蛾之后使得雌雄交尾，次日采卵。蚕卵可与通常的蚕卵同样地保存。 本发明中提供的基因重组蚕、或者本发明的5聚体CRP的制造方法中 使用的基因重组蚕可通过重复这样的饲育来继代。

继代而得到的基因重组蚕可由人工饲料清洁饲育，可容易地进行 数万只规模的大量饲育。而且，使用自然界中丰富地存在的桑的叶进 行蚕的大量饲育，则可廉价并且大量地得到5聚体CRP。

即，可使用大量饲育的本发明中提供的基因重组蚕、或者本发明 的5聚体CRP的制造方法中使用的基因重组蚕以高效率制造5聚体 CRP。

本发明的基因重组蚕的制造方法是通过经前述的导入步骤制造制 造5聚体CRP的基因重组蚕的方法，优选为制造表达分泌5聚体CRP 的基因重组蚕的方法。

在更优选的实施方式中，本发明的基因重组蚕的制造方法是制造 在绢丝腺中制造5聚体CRP的基因重组蚕的方法。在特别优选的实施 方式中，本发明的基因重组蚕的制造方法是制造在绢丝腺中表达分泌 5聚体CRP的基因重组蚕的方法。

本发明中提供的编码单体狗CRP的DNA是具有编码含SEQ ID NO:1所示的序列的氨基酸序列的碱基序列的DNA，优选为，有 SEQ ID NO:4所示的碱基序列的DNA。

在再优选的实施方式中，本发明中提供的编码单体狗CRP的DNA 是编码有信号肽的单体狗CRP的DNA。作为编码有信号肽的单体狗 CRP的DNA，可举出有编码有SEQ ID NO:3所示的序列的氨基酸序 列的碱基序列的DNA、优选为，有SEQ ID NO:6所示的碱基序列的 DNA。

再有，在编码含SEQ ID NO:1或3所示的序列的氨基酸序列的 DNA中，包括编码只要功能性地同等，向此氨基酸序列导入选自1～ 数个氨基酸的缺失、取代、附加及插入的至少1种的变异，并且，与 此序列有一定的相同性的氨基酸序列的DNA。其中，作为一定的相同 性，可举出例如，60%以上的相同性，可举出优选为70%以上的相同 性、更优选为80%以上的相同性、再优选为90%以上的相同性。

另外，在SEQ ID NO:4或6所示的碱基序列中，包括只要其所 编码的蛋白质功能性地同等，导入选自1～数个碱基的缺失、取代、 附加及插入的至少1种的变异，并且，与此序列有一定的相同性的碱 基序列。其中，作为一定的相同性，可举出例如，60%以上的相同性， 可举出优选为70%以上的相同性、更优选为80%以上的相同性、再优 选为90%以上的相同性。

通过将本发明中提供的编码单体狗CRP的DNA导入5聚体CRP 的制造可能的宿主，如在后段的实施例中详述，有活性的5聚体狗CRP 的基因工程学的制造变得可能。

本发明中提供的表达载体是含前述的编码单体狗CRP的DNA的 表达载体，优选为，前述的编码单体狗CRP的DNA与UAS的下游 功能性地结合的表达载体。其中，通过向有编码与编码位点特异性地 表达的蛋白质的DNA的启动子的下游功能性地结合的GAL4的DNA 的宿主，导入与UAS的下游功能性地结合编码单体狗CRP的DNA 的表达载体，从而可正确地控制CRP的表达部位或时期、量。

成本发明中提供的表达载体的基础的载体不特别限定，可举出 M13系载体、pUC系载体、pBac系载体、pBP322、pBluescript、 pCR-Script等。

本发明中提供的表达载体，在本发明的5聚体CRP的制造方法的 制成步骤或本发明的基因重组蚕的制造方法的导入步骤中，将编码单 体狗CRP的DNA导入被转化蚕之时利用之外、可在向蚕以外的宿主 的DNA导入中利用。

再有，表达载体的向宿主的导入可用本领域技术人员中公知的方 法、例如电穿孔法等来实施。

通过将本发明中提供的表达载体导入5聚体CRP的制造可能的宿 主，如在后段的实施例中详述，有活性的5聚体狗CRP的基因工程学 的制造变得可能。

以下，通过实施例再详细地说明本发明，本发明不受这些实施例 的任何局限。

【实施例】

【实施例1】

如接下来详细地记载，使导入与UAS序列的下游连结的编码有信 号肽的单体狗CRP的DNA的蚕，和导入编码与编码由丝胶蛋白I基 因合成的蛋白质的DNA的启动子的下游连结的GAL4的DNA的蚕交 配而制成基因重组蚕，回收该基因重组蚕在其绢丝腺中产生的狗 CRP，研究其性质。

（1）质粒载体pBac-UAS-cfCRP-SV40的构建

构建含与UAS序列及其下游连结的编码有信号肽的单体狗CRP 的DNA（cfCRP）的质粒载体。即，确定相当于狗CRP基因中的成 熟区的碱基序列，构建含该碱基序列的图1中所示的质粒载体。再有， 作为狗CRP基因的碱基序列，参照被预测为狗CRP的序列（NCBI Reference Sequence：XM 545746）。

具体而言，在将被预测为狗CRP基因的碱基序列翻译而得到的氨 基酸序列，和氨基酸序列鉴定的人、小鼠、兔、猪、牛的各种动物CRP 的天然形式的氨基酸序列之间进行相同性检索，将相同性高的区域作 为成熟区。再有，此成熟区是指推定为成为CRP的单体的部分，有 SEQ ID NO:4的碱基序列，其分子量从氨基酸序列推定为22.9kDa。 另外，使用各种动物CRP的信号肽的氨基酸序列同样地进行相同性检 索，将相同性高的区域作为有SEQ ID NO:5的碱基序列的信号肽。

接下来，设计向相当于成熟区的SEQ ID NO:4的碱基序列的5’ 末端附加相当于有SEQ ID NO:5的碱基序列的信号肽的碱基序列的 有SEQ ID NO:6的碱基序列的碱基序列（cfCRP）。全合成设计的碱 基序列之后，将合成DNA插入pUC57质粒而构建pUC57-cfCRP质 粒。再有，在cfCRP的ORF的两端设置限制酶位点（SpeI）。

接下来，将pUC57-cfCRP质粒SpeI处理，得cfCRP片段。最后， 将cfCRP片段插入pBac-UAS-SV40的BlnI位点，构建用于制成基因 重组蚕的质粒载体pBac-UAS-cfCRP-SV40（图1）。

（2）产生狗CRP的基因重组蚕的制成

制成导入上述（1）中构建的质粒载体pBac-UAS-cfCRP-SV40的 蚕，和导入编码与编码由丝胶蛋白I基因合成的蛋白质的DNA的启动 子（Ser1）及其下游连结的GAL4的DNA（GAL4）的蚕，使得它们 交配而制成产生狗CRP的基因重组蚕。

具体而言，通过将（1）中构建的pBac-UAS-cfCRP-SV40，和编 码转移酶基因的辅助质粒pA3PIG(Tamura,T.et al.,Nat.Biotechnol., 18,p81-84,2000）微注射到433粒的发生初期的蚕卵而导入。其中， 基因导入根据特开2003-88273号公报记载的多核苷酸导入方法进行。

接下来，使从导入基因的蚕卵孵化的第1世代的蚕交配，研究在 得到的第2世代的幼虫的体表的KMO标志物基因的表达。

从交配的62蛾区中1蛾区鉴定表达KMO标志物基因的幼虫8 个体。通过继代饲育这些的个体而将具有狗CRP基因的蚕系统化。

接下来，使得狗CRP系统的蚕，和导入编码与编码由丝胶蛋白I 基因合成的蛋白质的DNA的启动子（Ser1）及其下游连结的GAL4 的DNA（GAL4）的，已经系统化的Ser1GAL4系统的蚕（田村俊树 等，日蚕讲要，74，p51，2004）交配。从由交配得到的第二代的蚕之 中，选拔表达狗CRP系统有的KMO标志物基因和Ser1GAL4系统有 的DsRed标志物基因的双方的个体。

（3）狗CRP的提取

从上述（2）中选拔的基因重组蚕的吐丝期的幼虫，提取狗CRP， 确认反应性。

具体而言，从制成的产生狗CRP的基因重组蚕的绢丝腺，在缓冲 液（50mM Tris-HCl（pH7.4）、150mM NaCl、10mM CaCl2）中提 取狗CRP，在4℃、24000rpm、15min离心，回收离心上清。

用狗CRP测定ELISA试剂盒（ICL公司制）确认得到的离心上 清中存在狗CRP。另外，阶段性地稀释离心上清，测定稀释液中的狗 CRP量而确认稀释直线性（图2）。

作为对照，阶段性地稀释狗血清，使用狗CRP测定ELISA试剂 盒（ICL公司制）测定稀释液中的狗CRP量而确认稀释直线性（图2）。

由此结果确认，从产生狗CRP的基因重组蚕得到的重组狗CRP 与狗血清来源的CRP有同等的反应性。

（4）狗CRP的纯化

从在上述（3）从产生狗CRP的基因重组蚕提取的狗CRP溶液 分离纯化狗CRP。

具体而言，将提取的狗CRP溶液用0.45μm的滤器过滤而作为纯 化样品。使得此纯化样品通过固定的p-氨基苯基磷酰胆碱柱（PIERCE 公司制；1ml）。再有，将此柱预先用50mM Tris-HCl（pH7.4）、150mM NaCl、10mM CaCl₂平衡化。

接下来，用20ml的50mM Tris-HCl（pH7.4）、2M NaCl、10mM CaCl₂清洗柱后，使得50mM Tris-HCl（pH7.4）、150mM NaCl、10mM 磷酰胆碱通过而由柱溶出狗CRP。

在得到的狗CRP级分中，由狗CRP测定ELISA试剂盒（ICL 公司制）确认吸光度的升高（表1）。

【表1】由狗CRP测定ELISA试剂盒的纯化狗CRP测定结果

  吸光度（OD） 生理盐水 0.058 纯化狗CRP 0.588

（5）狗CRP的分子量分析

测定在上述（4）纯化的狗CRP的分子量。

具体而言，将狗CRP纯化溶液作为凝胶过滤层析用样品，使此样 品通过Superde×200凝胶过滤层析柱（图3）。再有，将此柱预先用 50mM Tris-HCl（pH8.0）、0.5M NaCl平衡化。另外，将各溶出级分 中的CRP量用狗CRP测定ELISA试剂盒（ICL公司制）测定。

使得作为分子量标志物的甲状球蛋白（M.W.670kDa）、r-球蛋白 （M.W.158kDa）、卵白蛋白（M.W.44kDa）、肌红蛋白（M.W.17kDa）、 维生素B12（M.W.1.35kDa）在同条件化通过，通过将溶出时间与狗 CRP的比较来测定狗CRP的分子量。

作为对照，使得人血清来源人CRP在同条件下通过，将溶出时间 与狗CRP的比较（图3）。再有，将各溶出级分中的CRP量用LA CRP-S （D）（NITTOBO MEDICAL公司制）测定。

其中，相对于狗CRP的单体的分子量被推定为其22.9kDa，人 CRP的其单体的分子量是23.0kDa，血清中存在5聚体。

作为结果，通过与分子量标志物的比较，确认狗CRP的分子量是 约100kDa。另外，确认基因组换蚕产生的狗CRP与人血清来源人CRP 示相同的溶出时间。从此分子量分析结果确认，由蚕纯化的狗CRP 形成5聚体。再有，单体的狗CRP不含在此纯化级分中，可获得与活 体内存在的同样的5聚体狗CRP。

【工业实用性】

由本发明的5聚体CRP的制造方法，可以高效率制造与血清来源 CRP有同等的活性的5聚体CRP。由本发明的5聚体CRP的制造方 法制造的CRP可作为临床检查领域中使用的CRP测定试剂盒中含的 校准物利用。另外，由本发明制造的CRP可在制成CRP测定试剂盒 中含的抗CRP抗体之时作为抗原利用。

SEQ ID NO:1-狗CRP的氨基酸序列

SEQ ID NO:2-狗CRP来源的信号肽的氨基酸序列

SEQ ID NO:3-人工序列的说明：将狗CRP的氨基酸序列（SEQ ID NO:1）与狗CRP来源的信号肽的氨基酸序列（SEQ ID NO:2） 连结的氨基酸序列

SEQ ID NO:4-狗CRP的碱基序列

SEQ ID NO:5-狗CRP来源的信号肽的碱基序列

SEQ ID NO:6-人工序列的说明：将狗CRP的碱基序列 （SEQ ID NO:4）与狗CRP来源的信号肽的碱基序列 （SEQ ID NO:5）连结的碱基序列

SEQ ID NO:7-人CRP的氨基酸序列

SEQ ID NO:8-人CRP来源的信号肽的氨基酸序列

SEQ ID NO:9-人CRP的碱基序列

SEQ ID NO:10-人CRP来源的信号肽的碱基序列