双链DNA中G四聚体的形成以及利用DNA足迹实验鉴定G四聚体结构

摘要

核酸可以形成一种叫做G-quadruplex的四聚体结构，在不同物种的基因组中，具有形成G-quadruplex能力的DNA序列数量非常庞大。越来越多的研究显示这些G-quadruplex结构参与基因转录调控，因而成为癌症和其他疾病的重要治疗靶点。除了端粒3'悬突以外，基因组G-quadruplex序列大部分都分布在双链DNA中间，附近不仅有互补的DNA与之配对，其两侧还有双链DNA限制。日前为止，有关双链DNA中G-quadruplex/duplex竞争的研究很少。 在本研究中，制备了来自人基因组的含有不同G-quadruplex形成序列的双链DNA，分别在稀释溶液和PEG制造的分子拥挤环境下将双链进行加热变性退火和体外转录，结果发现，在分子拥挤条件下，加热变性退火和发生RNA转录的双链DNA中有G-quadruplex形成。使用DMS footprinting以及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验对G-quadruplex的形成进行了证明。 我们的实验结果还发现，加热变性退火后非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以提供一种衡量G-quadruplex在双链DNA中形成能力的简单方法。利用此方法研究了K离子和PEG200的浓度对G-quadruplex形成能力的影响，结果发现，PEG制造的分子拥挤环境是双链DNA中G-quadruplex稳定存在所必须的。大多数G-quadruplex在双链DNA中形成需要的PEG浓度在30-40％，和体内细胞中生物分子浓度接近。这个现象指示分子拥挤环境可能是体内基因组中G-quadruplex形成的生理基础。 基因组中G-quadruplex序列数量巨大且分布广泛，它们在基因表达调控中的作用使得G-quadruplex结构成为人们设计药物分子治疗疾病的靶点。研究生理条件下基因组双链DNA中G-quadruplex的结构特征对寻找靶向G-quadruplex的药物具有重要的指导意义。 利用上述加热变性退火后非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，筛选到一种特异性识别并结合G-quadruplex的酞菁分子Zn-TTAPc，这种小分子具有两个特殊的性质，1）可以特异性结合于G-quadruplex的G-quatert平面;2）在紫外光照射下可以在结合位点处切割DNA。在本研究中，发展了一种可以解析G-quadruplex折叠方式的光切割footprint方法。通过比较酞菁分子对G-quadruplex两个末端平面切割程度的差异，可以解析出形成G-quadruplex的四条G-tract的5'-3'走向，从而了解整个G-quadruplex的结构类型。这种方法简单明了，而且不需要非常专业的知识。并且，该酞菁分子对G-quadruplex的选择性远高于双链以及单链DNA，这种方法还可以应用于鉴定长单链和双链DNA中G-quadruplex的形成。

目录

声明

摘要

第一章背景介绍

1．3 G-quadruplex四重折叠结构的多样性

2．影响G-quadruplex结构形成的因素

2．1核酸浓度

2．2碱基序列组成

2．3离子环境

2．4溶液中的添加剂

2．5核酸骨架

2．6旁侧序列

3．G-quadruplex序列在基因组中的分布和功能

3．1真核生物染色体端粒中的G-quadruplex

3．2基因表达区的G-quadruplex

3．3重组高频区域的G-quadruplex

4．G-quadruplex在体内存在的证据

4．2 G-quadruplex在体内存在的直接证据

4．3体内G-quadruplex的其它证明途径

5．G-quadruplex与双链DNA的竞争

6．分子拥挤效应

6．1分子拥挤理论

6．2分子拥挤对核酸结构的影响

7．结合G-quadruplex的化学小分子

7．1天然小分子化合物

7．2阳离子卟啉(cationic porphyrin)类化合物

7．3 Corrole类化合物

7．4酰胺葸醌(diamidoanthraquinone)及芴酮(amidofluorenone)类化合物

7．5吖啶类化合物

7．6溴化乙锭(Ethidium Bromide)衍生物

7．7咔唑类小分子

7．8酞菁类小分子

第二章本领域中使用的实验技术

1．原子水平

1．2核磁共振(NMR)

1．3分子动力学模拟(MD)

2．单分子水平

2．1原子力显微镜(AFM)

2．2扫描电镜(SEM)

2．3单分子荧光共振能量转移(FRET)

3．光谱学

3．1圆二色光谱(CD)

3．2振动圆二色(VCD)

3．3红外光谱(IR)

3．4拉曼光谱(Raman)

3．5荧光

3．6表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)

4．电泳

5．化学方法

5．1硫酸二甲酯保护实验(DMS Footprinting)

5．2 125I放射性探针

6．酶学方法

6．1聚合酶阻滞

6．2 DNA酶I足迹实验(DNase I footprinting)

7．热力学方法

7．1 DNA熔链实验(melting)

7．2差示扫描量热法(DSC)

第三章分子拥挤为双链DNA中G-quadruplex形成提供条件

1．引言

2．材料方法

2．1 PCR制备荧光标记的基因组双链DNA

2．2搭桥PCR的方法构建含有T7启动子以及G-quadruplex序列的双链DNA

2．3双链DNA在K离子以及PEG下变性退火

2．4双链DNA在K离子以及PEG下体外转录

2．5 DMS footprinting

2．6单链内切酶实验

2．7单链DNA结合蛋白shift

2．8 FRET-Melting

3．实验结果

3．1双链DNA中G-quadruplex形成的证明

3．2 K离子浓度和PEG浓度对双链DNA中G-quadruplex形成程度的影响

3．3 G-quadruplex的稳定性与其在双链DNA中形成能力的关系

3．4 PEG200制造的分子拥挤环境为双链DNA中G-quadruplex稳定形成提供了必要条件

4．讨论

第四章利用小分子光切割DNA足迹实验鉴定单链和双链DNA中G-quadruplex的结构

1．引言

2．材料与方法

2．1小分子结构式

2．2实验中合成的DNA以及序列

2．3试剂以及溶液配方

2．5长双链DNA的制备以及G-quadruplex的形成

2．8紫外可见光吸收光谱滴定实验

2．9小分子诱导的光切割DNA足迹实验

2．10转录的双链DNA的纯化

2．11数据分析

3．实验结果

3．2选择特异性结合G-quadruplex的小分子进行光切割实验

3．3小分子Zn-TTAPc光切割端粒G-quadruplex

3．4 Zn-TTAPc光切割基因组中的G-quadruplex

3．5 DMS与Zn-TTAPc光切割DNA足迹实验检测双链DNA中的G-quadruplex

3．6 Zn-TTAPc光切割长单链和长双链DNA中G-quadruplex可以作为鉴定G-quadruplex形成的手段

4．讨论

参考文献

博士研究生期间发表文章

致谢