蜂王浆主蛋白MRJP1特异性抗体及其制备方法与Elisa定量检测

摘要

本发明公开了一种蜂王浆主蛋白MRJP1特异性抗体及其制备方法与Elisa定量检测。首先对意大利蜜蜂（Apismellifera）蜂王浆主蛋白MRJPs家族所有成员（MRJP1-MRJP9）的蛋白质氨基酸序列作同源性分析，选定MRJP1不同于其它MRJPs家族成员的特异性多肽的氨基酸序列。采用化学法合成相关特异性多肽，作为抗原，免疫新西兰白兔、取血清，Elisa检测得到效价较高的多克隆抗体R2，再用合成的MRJP1多肽制备的亲和柱纯化该抗体。以MRJP1为抗原Elisa法检测抗体R2的效价，该抗体的效价>1:20000。本发明为蜂王浆中MRJP1的定性定量检测提供了一种非常可靠的快速检测新方法，也为蜂产品质量监管部门、加工贸易企业蜂王浆、蜂蜜产品质量控制，新鲜度检测、真假产品鉴别提供了非常可靠的技术手段。

说明书

技术领域

本发明涉及一种蜂王浆主蛋白MRJP1特异性抗体及其制备方法与Elisa定量检测。

背景技术

现行《中华人民共和国国家标准-蜂王浆》（GB 9697-2008）规定的理化指标为：水分（优级品67.5%、合格品69.0%）、10-羟基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decenoic acid,简称10-HDA; 优级品含量1.8%、合格品含量1.4%）、蛋白质（11-16%）、总糖（15%）、灰分（1.5%）、酸度及淀粉。但在这些指标中，除10-HDA外，其它指标只能反映蜂某一类物质的含量，并不能真实地反映蜂王浆的质量好坏和真伪。10-HDA作为蜂王浆所特有的活性成分，其含量的高低长期被全球王浆贸易中作为衡量质量及辨别真伪的最重要指标。但许多研究发现，10-HDA稳定性很好，即使在高温下也仅有少量降解，不适合作为判定蜂王浆新鲜度以及品质质量的指标。

而蜂王浆主蛋白1 -Major Royal Jelly Protein 1 (MRJP1)为蜂王浆中最主要的特征性蛋白，是国际上公认的可代表蜂王浆的新鲜度的质量标志性活性成分，国际上已由许多学者建议将MRJP1含量作为蜂王浆质量的检测指标。虽然经过了很多尝试，但现行蜂王浆国家标准和国际标准中仍然缺乏MRJP1检测指标和检测方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种蜂王浆主蛋白MRJP1特异性抗体及其制备方法与Elisa定量检测。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

蜂王浆主蛋白MRJP1特异性抗体的制备方法，采用以下步骤制备：

1）从国际GenBank检索并下载蜂王浆主蛋白MRJPs家族全部9个成员MRJP1-MRJP9基因所编码的氨基酸序列，采用生物信息学分析软件作同源性分析，选出MRJP1特有的多肽，所述的MRJP1特有的多肽与其他8个MRJPs成员共享的连续的同源氨基酸残基数量不超过3个；

2）用化学法合成所述的MRJP1特有的多肽；

3）用所述的MRJP1特有的多肽免疫新西兰白兔，从新西兰白兔采集血清，获得MRJP1特异性多克隆抗体，纯化后冻存。

     所述的MRJP1特有的多肽M4位于MRJP1氨基酸序列的第360-371位，序列为IKEALPHVPIFD。

     所述的MRJP1特异性多克隆抗体效价＞1: 20000。

所述的方法制备的MRJP1特异性抗体。

 蜂王浆主蛋白MRJP1的Elisa快速定量检测方法,以MRJP1为抗原，按以下步骤进行处理：包被抗原、洗涤、封闭、洗涤、加一抗、洗涤、加二抗、洗涤、加显色底物、加显色终止液，用酶标仪测定样品的吸光值450 nm-630 nm，绘制以MRJP1浓度为横坐标，以OD₄₅₀-OD₆₃₀为纵坐标的标准曲线，建立回归方程；

以新鲜蜂王浆、蜂王浆冻干粉或蛋白提取物为抗原，按以下步骤进行处理：包被抗原、洗涤、封闭、洗涤、加一抗、洗涤、加二抗、洗涤、加显色底物、加显色终止液，然后用酶标仪测定样品的吸光值450 nm-630 nm，将吸光值代入回归方程，得到新鲜蜂王浆或蜂王浆冻干粉中MRJP1含量。

本发明的有益效果是：

（1）本发明筛选出的多肽特异性强，能单一地识别蜂王浆主蛋白MRJP1。蜂王浆蛋白家族有9个成员MRJP1-MRJP9，来自同一个祖先，各成员间具有高度的氨基酸序列同源性，并具备如下相同的结构：均含有四个保守的半胱氨酸位点，序列中存在一些完全相同的氨基酸区域，C末端均具有高度疏水的特征性结构。正因为蜂王浆主蛋白MRJPs家族的保守性，用重组大肠杆菌表达的MRJP1全序列蛋白免疫兔子得到的多克隆抗体只能特异性地识别蜂王浆MRJPs家族蛋白，而不能特异地识别其它非蜂王浆源蛋白。而本发明从MRJP1全序列中筛选多肽的氨基酸序列不同于同一家族中其他蛋白的氨基酸序列，化学法合成该多肽，用于免疫兔子，可制备出特异性多克隆抗体，从而实现只能特异性识别单一蛋白MRJP1的目的。

（2）建立以MRJP1作为鉴别蜂王浆真伪和质量的新指标，可填补现行蜂王浆国家标准的不足。因为现行蜂王浆国家标准（GB 9697-2008）以王浆酸10-HDA为蜂王浆的特有活性成分，也是国际贸易中衡量蜂王浆质量及真伪的关键指标。但Antinelli等（Antinelli, et al. 2003, Food Chem, 80: 85-89）研究表明：10-HDA在-18℃、4℃和室温条件下贮藏12个月，其含量分别只减少0.1%、0.2%和0.4%，非常稳定，即使在高温下也仅有少量降解。因此，不适合作为蜂王浆新鲜度以及品质的指标。而MRJP1是蜂王浆中含量最丰富，决定着蜜蜂级型分化，可使果蝇个体增大、繁殖能力增强、寿命延长，以及发育时间缩短的关键蛋白质，将其作为反映蜂王浆产品质量的主要指标是非常合理和科学的。

（3）本发明为蜂王浆中MRJP1的真实含量的测定提供了一种简便易行、准确度高的Elisa快速测定方法。Elisa法作为一种抗原抗体的定量分析法，由于酶的催化效率很高，可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的灵敏度。同时，该方法操作简单，方便迅速，成本低廉，用此方法检测蜂王浆质量十分可行。

附图说明

图1是意大利蜜蜂蜂王浆主蛋白MRJPs家族的9个成员（MRJP1-MRJP9）全基因所编码的氨基酸序列同源性分析。其中所有MRJPs家族成员共享的同源性氨基酸残基，在MRJP9序列的氨基酸残基下用“*”标出。根据同源性选出的MRJP1特异性多肽的氨基酸残基及其它MRJPs家族成员中与其共享的同源性氨基酸残基用灰色阴影标出。MRJP1下划线部分为信号肽序列，有外框的序列为成熟肽已测序的N端氨基酸序列。

图2是从蜂王浆离心分离的MRJPs 的SDS-PAGE电泳分析图，用抗体1（用插入MRJP1基因的重组大肠杆菌表达的GST-MRJP1融合蛋白免疫兔子得到的多克隆抗体）检测MRJPs 的Western blot印迹分析图。其中，图A为蜂王浆主蛋白MRJPs的SDS-PAGE电泳图，M为标准蛋白分子量Marker，MRJPs所示为蜂王浆主蛋白样品。图B、C为MRJPs 的Western blot印迹分析结果。MRJPs所示为意大利蜜蜂王浆蛋白；箭头所示为MRJPs成员: MRJP1、MRJP2、MRJP3和MRJP5的位置，位置的标示参照Schmitzova等发表的西方蜜蜂蜂王浆（Schmitzova et al 1998, Cell Mol Life Sci. 54(9): 1020-1030）。

图3是从蜂王浆离心分离的MRJPs和从蜂王浆超速离心分离的MRJP1的SDS-PAGE电泳分析图，用抗体2（用MRJP1特异性合成多肽免疫兔子得到的多克隆抗体）检测MRJP1和MRJPs 的Western blot印迹分析图。其中图A为MRJPs和MRJP1的SDS-PAGE电泳分析图, M为标准蛋白分子量Marker，MRJPs为所示为从蜂王浆主蛋白，MRJP1所示为纯化的蜂王浆主蛋白1标准样品, 箭头所示为MRJP1的蛋白条带。图B为MRJP1和MRJPs 的Western blot印迹分析结果，箭头所示为MRJP1的蛋白印迹。

图4为以重组MRJP1全蛋白抗体R1为一抗，以从蜂王浆超速离心分离的纯化MRJP1为标准抗原，经梯度稀释，采用Elisa法测定450 nm、630nm处的测吸光值。以吸光值OD₄₅₀–OD₆₃₀为纵坐标，MRJP1标准蛋白溶液浓度为横坐标，绘制成的标准曲线：y=0.1100x+0.1239，R²=0.998。

图5为以MRJP1特异性抗体R2为一抗，以从蜂王浆超速离心分离的纯化MRJP1为标准抗原，经梯度稀释，采用Elisa法测定450 nm、630nm处的测吸光值。以吸光值OD₄₅₀–OD ₆₃₀为纵坐标，MRJP1标准蛋白溶液浓度为横坐标，绘制成的标准曲线：y=0.1307x+0.0496，R²=0.999。

具体实施方式

  蜂王浆主蛋白MRJP1特异性抗体的制备方法，采用以下步骤制备：

1）从国际GenBank检索并下载蜂王浆主蛋白MRJPs家族全部9个成员MRJP1-MRJP9基因所编码的氨基酸序列，采用生物信息学分析软件作同源性分析，选出MRJP1特有的多肽，所述的MRJP1特有的多肽与其他8个MRJPs成员共享的连续的同源氨基酸残基数量不超过3个；

2）用化学法合成所述的MRJP1特有的多肽；

3）用所述的MRJP1特有的多肽免疫新西兰白兔，从新西兰白兔采集血清，获得MRJP1特异性多克隆抗体，纯化后冻存。

所述的MRJP1特有的多肽M4位于MRJP1氨基酸序列的第360-371位，序列为IKEALPHVPIFD。

所述的MRJP1特异性多克隆抗体效价＞1: 20000。

所述的方法制备的MRJP1特异性抗体。

    蜂王浆主蛋白MRJP1的Elisa快速定量检测方法,以MRJP1为抗原，按以下步骤进行处理：包被抗原、洗涤、封闭、洗涤、加一抗、洗涤、加二抗、洗涤、加显色底物、加显色终止液，用酶标仪测定样品的吸光值450 nm-630 nm，绘制以MRJP1浓度为横坐标，以OD₄₅₀-OD₆₃₀为纵坐标的标准曲线，建立回归方程；以新鲜蜂王浆、蜂王浆冻干粉或蛋白提取物为抗原，按以下步骤进行处理：包被抗原、洗涤、封闭、洗涤、加一抗、洗涤、加二抗、洗涤、加显色底物、加显色终止液，然后用酶标仪测定样品的吸光值450 nm-630 nm，将吸光值代入回归方程，得到新鲜蜂王浆或蜂王浆冻干粉中MRJP1含量。

本发明所采用的意大利蜜蜂（Apis mellifera）蜂王浆主蛋白MRJP1的特异性多肽来源于从国际GenBank检索并下载的MRJP1基因所编码的氨基酸序列。通过同源性分析，所选多肽与其他8个MRJPs成员共享的连续排列的同源性氨基酸残基数量不超过3个。将化学合成的多肽作为抗原，免疫新西兰白兔、取血清得到效价较高的MRJP1特异性抗体R2。通过Western blot分析显示，MRJP1特异性抗体R2能专一性地识别蜂王浆主蛋白MRJPs家族中的MRJP1蛋白。以从蜂王浆中分离的纯MRJP1蛋白为标准蛋白（抗原），作倍比稀释，采用酶标仪Elisa法检测不同浓度MRJP1蛋白样品的吸光度450 nm-630 nm，建立吸光度与MRJP1蛋白浓度的标准曲线。将蜂王浆冻干粉稀释，作为抗原，采用Elisa法检测获得样品吸光度，代入所建立的标准曲线，计算得到样品中的实际MRJP1蛋白的含量。

蜂王浆主蛋白MRJP1特异性抗体R2的制备方法，包括如下步骤：

（1）从国际GenBank检索并下载意大利蜜蜂（Apis mellifera）蜂王浆主蛋白MRJPs家族全部9个成员（MRJP1-MRJP9）基因所编码的氨基酸序列，采用生物信息学分析软件GENTYX 作同源性分析，根据序列信息，选出一段MRJP1的所特有的多肽。这些多肽分别位于MRJP1氨基酸序列的第51-57位（M1：QDAILSG），第73-80位（M2: HDKIFVTM），第340-346位（M3:NIRTVAQ），第360-371位的多肽（M4:IKEALPHVPIFD）。所选多肽的共同特征在于：所选MRJP1多肽与其他8个MRJPs成员共享的连续排列的同源性氨基酸残基数量不超过3个。

（2）采用化学法合成的MRJP1特异性多肽M4免疫新西兰白兔，制备多克隆抗体, 包括以下子步骤：

（2.1）采用化学法合成MRJP1特异性多肽，其氨基酸序列分别为：M1：C-QDAILSG-NH₂； M2：C-HDKIFVTM-NH₂； M3：C-NIRTVAQ -NH₂；M4：C-IKEALPHVPIFD-NH₂，最后选择序列最长的M4作为实验抗原；

（2.2）多肽与KLH偶联（偶联剂为Sulfo-SMCC）作为免疫抗原，多肽与BSA偶联（偶联剂为戊二醛）作为检测抗原；

（2.3）用PBS将抗原分别稀释为1mg/ml，分装冻存于-20℃冰箱；

PBS：NaCl 8.5g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.85g，KH₂PO₄ 0.27g，ddH₂O 950 ml，调节pH值至7.2，加ddH₂O定容至1000 ml；

（2.4）第1天，每种抗原取1ml抗原加入1ml福氏完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点（至少8点）注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔；

检验乳化程度：将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中，若不散开，表明已达到要求；

（2.5）在第15、29、43天，每种抗原取1ml加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点（至少8点）注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔；

（2.6）第53天，颈动脉取血，将兔子处死；

（2.7）兔血在4℃放置过夜，4℃、10000rpm离心30min，收集上清；上清即为多克隆抗体血清；

（2.8）化学合成的特异性多肽连接到活化的Sulfolink Resin上，制备抗原亲和柱，1ml Sulfolink Resin偶联1mg多肽；

（2.9）亲和柱用10倍柱体积PBS平衡，流尽溶液；多克隆抗体血清经0.45μm滤膜过滤；

（2.10）血清过抗原亲和柱，流尽溶液，收集流穿；

（2.11）10倍柱体积PBS平衡，流尽溶液；

（2.12）加入5ml抗体洗脱液，分管收集洗脱液，每管1ml；

抗体洗脱液：甘氨酸5g，溶于100ml ddH₂O，用浓HCl调节pH值至2.7，4℃保存；

（2.13）用分光光度计检测收集到的洗脱液在280nm处的吸光度，吸光度大于1.0的组分合并，置于透析袋中，ddH₂O中透析24h，中间换水3-4次，透析后即为特异性抗体溶液；透析袋规格为截留分子量14 kDa；

（2.14）以合成多肽和纯化的MRJP1为抗原，经Elisa法测定，该特异性抗体R2的效价为＞1: 20000。

（3）以之前我们构建的插入MRJP1基因的重组大肠杆菌表达的GST-MRJP1融合蛋白为抗原，免疫兔子得到多克隆抗体R1，按照步骤（2.4）-（2.14），以纯化的MRJP1为抗原作Elisa法测定，R1的效价为＞1:10000。

（4）用Western blot检测方法做MRJP1抗体的特异性鉴别，具体步骤如下：

（4.1）王浆蛋白MRJPs的离心分离：称取适量新鲜蜂王浆，以1:1比例溶于PBS中，4℃抽提24 h，然后在12000g、4℃下离心30 min，取上清。上清用孔径14 kDa的透析膜在超纯水中，4℃下透析24 h，中间换水3-4次，再冻干，所得冻干粉即为蜂王浆可溶性蛋白MRJPs，-20℃保存。

（4.2）王浆蛋白MRJP1的离心分离：称取适量新鲜蜂王浆，用等质量超纯水稀释，充分抽提6 h。混合液在245000 g、6℃下离心5 h，出现分层现象后，将中间层取出；用2倍质量超纯水将中间层溶解，室温下抽提1 h，混匀；将该液在30000g、6℃下离心30 min，取上清。上清液在245000 g、6℃下离心5 h，取沉淀。此沉淀即为所需蛋白样品，即MRJP-1，-20℃保存。

（4.3）取上述MRJPs、MRJP1蛋白样品，作变性聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）电泳检测。具体方法是，取适量蛋白样品溶于超纯水中，用Bradford法测定总蛋白含量，配成终浓度为1mg/ml的溶液。制备变性聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%。取MRJPs、MRJP1蛋白溶液，加上样缓冲液，煮沸，离心，取上清按15 μl/孔的上样量加入变性聚丙烯酰胺凝胶样孔，同时在同一胶上加蛋白标准品，加样后将胶置电泳仪电泳，取胶用考马氏亮蓝染色，经甲醇脱色，凝胶上样品泳道分别显示分子量范围在25-87kDa的多个条带和分子量约57 kDa的单一条带（图2A和图3A）。

（4.4）对从蜂王浆中分离的MRJP1蛋白座N-末端氨基酸序列测定，具体步骤如下：将从蜂王浆中分离的MRJP1蛋白SDS-PAGE电泳，再转电泳印到硝酸纤维素膜，用ABI PROCISETM492cLC （GC320078）仪器，按蛋白质N端测序标准方法（SCI-S-006），测定了MRJP1蛋白N-末端氨基酸序列的第1-5氨基酸序列, 结果为 NILRG，与已报道的MRJP1蛋白N-末端氨基酸序列一致。

（4.5）Western blot检测蜂王浆MRJPs和MRJP1蛋白：以MRJPs为抗原，以抗体R1为一抗；以MRJPs和MRJP1为抗原，以抗体R2为一抗，分别进行Western blot分析。结果如图2B和图3B和所示，由这两图可见，抗体R1能识别MRJPs家族的所有蛋白，显示分子量在25-87 kDa的所有蛋白印迹（图2B、2C MRJPs泳道），即不具备专一性的识别能力。而R2抗体只能与分子量为57 kDa 的MRJP1发生免疫反应（图3B MRJPs和MRJP1泳道），即具有专一识别MRJP1的特异性。

（5）用特异性抗体R2作蜂王浆原浆、冻干粉及蛋白提取物中MRJP1的Elisa快速定量检测。按以下步骤进行处理：

（5.1）以MRJP1为抗原，碳酸盐缓冲液（Carbonate Buffer solution，CBS）包被，包被浓度为1-10 μg/ml，包被体积为100 μl/孔，4℃过夜；

碳酸盐缓冲液：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，ddH₂O 950 ml，调节pH值至9.6，加ddH₂O定容至1000 ml，4℃保存；

（5.2）以MRJP1特异性抗体R2为一抗，用PBS稀释10000-20000倍，100μl/孔，37℃静置1-2 h；以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，稀释5000-10000倍，100μl/孔，37℃静置0.5-1 h；

（5.3）以5%脱脂奶粉溶于PBS为封闭液，200 μl/孔，37℃静置1-2h；以PBST（PBS+0.05% Tween-20）为洗涤液，每步洗涤5-10次，并拍干；

（5.4）以TMB为显色底物，100μl/孔，37℃放置15min；以2 M H₂SO₄为终止液，50μl/孔，加完立即在酶标仪上测量波长450 nm和630nm处的吸光值。450nm为该显色剂的最大吸收波长，而630nm处吸光值可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

（5.5）以MRJP1浓度为横坐标，以OD₄₅₀-OD₆₃₀为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程。

（5.6）以新鲜蜂王浆或蜂王浆冻干粉为抗原，包被浓度为100、200、300 ug/ml（或50、100、200μg/ml），采用（5.1）-（5.4）同样步骤测定新鲜蜂王浆或蜂王浆冻干粉溶液吸光值，将吸光值代入回归方程，得到新鲜蜂王浆或蜂王浆冻干粉中MRJP1的含量。

本发明是国际上建立的首个快速、有效、低成本检测MRJP1含量的新方法，填补了现行蜂王浆国家标准和国际标准中缺乏MRJP1检测指标和检测方法的不足。本发明的为国内外蜂王浆商品质量控制和真伪鉴别提供了十分有效的手段，也为与MRJP1相关的蜂学基础研究提供了新的手段。

下面结合具体实施例和和附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1：MRJP1特异性多肽的筛选

登入国际基因信息库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，搜索下载MRJPs家族9个成员 (MRJP1-MRJP9) 基因所编码的氨基酸序列，MRJP1的序列号为NM_001011579、MRJP2的序列号为NM_001011580、MRJP3的序列号为NM_001011601、MRJP4的序列号为NM_001011610、MRJP5的序列号为NM_001011599、MRJP6的序列号为NM_001011622、MRJP7的序列号为NM_001014429、MRJP8的序列号为NM_001011564、MRJP9的序列号为NM_001024697。将上述序列MRJP1-MRJP9基因所编码的氨基酸序列输入GENTYX软件，进行同源性分析，完成分析后输出如图1所示的同源性分析图（图1）。

根据图1同源性分析结果，筛选出MRJP1的特异性多肽, 这些多肽分别位于MRJP1氨基酸序列第51-57位（M1：QDAILSG）， 第73-80位（M2: HDKIFVTM），第340-346（M3: NIRTVAQ），第360-371位（M4: IKEALPHVPIFD）。这些从MRJP1蛋白中选出的特异性多肽的选择原则是与其它MRJPs蛋白序列共享的连续排列同源性氨基酸残基不超过3个，适合作为特异性抗原（图1）。

实施例2：MRJP1特异性多克隆抗体制备

1. 抗原制备

     选择实施例中的M4多肽序列（IKEALPHVPIFD）进行化学合成。将5 mg合成多肽与KLH偶联（偶联剂为Sulfo-SMCC），作为免疫抗原，将另5 mg合成多肽与BSA偶联（偶联剂为戊二醛）作为检测抗原；分别用PBS稀释至浓度为1 mg/ml，分装，冻存于-20℃。

2. 免疫兔子

    选择健康新西兰白兔2只，在第1、15、29、43天进行免疫。免疫操作如下：取1 ml免疫抗原，加入1 ml福氏完全佐剂，乳化，将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中，用注射器在白兔颈背部皮下作多点（至少8点）注射；在第15、29、43天，每种抗原取1ml加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点（至少8点）注射。

3. 多克隆抗体血清制备

第53天，在兔子颈动脉取血，将兔血置4℃过夜，离心30 min（4℃、10000 rpm），收集上清。上清即为多克隆抗体血清。用检测抗原Elisa法 检测所获得的多克隆抗体血清效价，筛选出效价较高的抗体。

实施例3：亲和层析法纯化多克隆抗体

1. 亲和层析柱制备

以1 ml Sulfolink Resin与1 mg合成MRJP1特异性多肽偶联。将5 mg合成MRJP1多肽连接到活化的Sulfolink Resin上，制备成抗原亲和柱，亲和柱用10倍柱体积PBS平衡，流尽溶液。

2. 抗体纯化

将多克隆抗体血清用0.45 μm滤膜过滤，然后过抗原亲和柱，排尽溶液，收集流穿；再用10倍柱体积的PBS缓冲液平衡，排尽溶液；加入5 ml抗体洗脱液（甘氨酸5g，溶于100 ml 超纯水，用浓HCl调节pH值至2.7，4℃保存），按1 ml/tube分管收集洗脱液。

用分光光度在280 nm处检测收集到的洗脱液，将吸光度大于1.0的组分合并，置于截留分子量14 kDa的透析袋中，在超纯水中透析12 h，中间换水一次，透析后即为纯化的MRJP1特异性抗体溶液；共得到兔子1抗体2.1 ml，兔子2抗体2.3 ml，以1 ml/tube分装，冻存于-20℃。

实施例4：Western blot检测MRJP1特异性抗体R2的专一性

1. 蜂王浆中MRJPs蛋白的离心分离与SDS-PAGE电泳检测

称取适量新鲜蜂王浆，以1:1比例溶于PBS中，4℃抽提24 h，然后在12000g、4℃下离心30 min，取上清。上清用孔径14 k的透析膜在超纯水中，4℃下透析24 h，中间换水3-4次，再冻干，所得冻干粉即为蜂王浆可溶性蛋白MRJPs，-20℃保存。

取上述MRJPs蛋白样品，作变性聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）电泳检测。具体方法是，取适量蛋白样品溶于超纯水中，用Bradford法测定总蛋白含量，配成终浓度为1 mg/ml的溶液。制备变性聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%。取MRJPs蛋白溶液，加上样缓冲液，煮沸，离心，取上清按15 μl/孔的上样量加入变性聚丙烯酰胺凝胶样孔，同时在同一胶上加蛋白标准品，加样后将胶置电泳仪电泳，取胶用考马氏亮蓝染色，经甲醇脱色，凝胶上样品泳道显示分子量范围在25-87 kDa的多个条带，其中包括MRJP1蛋白（图2A和图3A泳道MRJPs）。

2. 蜂王浆中MRJP1蛋白的超速离心分离、鉴定与SDS-PAGE电泳检测

称取适量新鲜蜂王浆，用等质量超纯水稀释，充分抽提6 h。混合液在245000 g、6℃下离心5 h，出现分层现象后，将中间层取出；用2倍质量超纯水将中间层溶解，室温下抽提1 h，混匀；将该液在30000g、6℃下离心30 min，取上清。上清液在245000 g、6℃下离心5 h，取沉淀。此沉淀即为所需蛋白样品，即MRJP-1，-20℃保存。

取超速离心法得到的MRJP1蛋白样品，作变性聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）电泳检测。具体方法是，取适量蛋白样品溶于超纯水中，用Bradford法测定总蛋白含量，配成终浓度为1 mg/ml的溶液。制备变性聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%。取MRJP1蛋白溶液，加上样缓冲液，煮沸，离心，取上清按15μl/孔的上样量加入变性聚丙烯酰胺凝胶样孔，同时在同一胶上加蛋白标准品，加样后将胶置电泳仪电泳，取胶用考马氏亮蓝染色，经甲醇脱色，凝胶上样品泳道显示一条分子量约57 kDa的单一条带，此即为纯MRJP1蛋白（图3A  MRJP1泳道）。

3. 对从蜂王浆中分离得到的MRJP1蛋白作N-末端氨基酸序列测定

   将从蜂王浆中分离的MRJP1蛋白SDS-PAGE电泳，再转电泳印到硝酸纤维素膜，用ABI PROCISETM492cLC （GC320078）仪器，按蛋白质N端测序标准方法（SCI-S-006），测定了MRJP1蛋白N-末端氨基酸序列的第1-5氨基酸序列, 结果为 NILRG，与已报道的MRJP1蛋白N-末端氨基酸序列一致。

4. Western blot检测蜂王浆MRJPs和MRJP1蛋白

以MRJPs为抗原，用之前我们构建的插入MRJP1基因的重组大肠杆菌表达的GST-MRJP1融合蛋白免疫兔子得到的多克隆抗体（抗体R1）为一抗；以MRJPs和MRJP1为抗原，用MRJP1特异性合成多肽免疫兔子得到的多克隆抗体（抗体R2）为一抗，分别进行Western blot分析。结果如图2B和图3B和所示，由这两图可见，抗体R1能识别MRJPs家族的所有蛋白，显示分子量在25-87 kDa的所有蛋白印迹（图2B、2C MRJPs泳道），即不具备专一性的识别能力。而R2抗体只能与分子量为57 kDa 的MRJP1发生免疫反应（图3B MRJPs和MRJP1泳道），即具有专一识别MRJP1的特异性。

实施例5：Elisa法检测抗体效价

    分别用实施例4所述抗体R1（用MRJP1基因的重组大肠杆菌表达产物GST-MRJP1融合蛋白制备的多克隆抗体）、抗体R2（用筛选出的MRJP1特异性合成多肽制备的多克隆抗体）为一抗，按以下步骤操作：

（1）包被：分别用MRJP1标准蛋白、蜂王浆作为抗原，用CBS稀释为1 μg/ml，100 μl/孔加入96孔板中，4℃过夜；

    （2）封闭：将包被液弃去，以200 μl/孔将封闭液加入96孔板中，37℃放置1.5 h；

    （3）加入一抗：弃去封闭液，分别加入不同稀释倍数（5000、10000、20000和40000）的抗体R1或抗体R2（分别来自2只兔子），以及对照BSA，100 μl/well，37℃放置1 h；

    （4）洗涤：用自来水冲洗10次，拍干；

    （5）加入二抗：酶标羊抗兔用封闭液稀释5000倍，以100 μl/孔加入96孔板中，37℃放置30 min；

    （6）洗涤：用自来水冲洗10次，拍干；

    （7）加入TMB显色底物：100 μl/孔加入96孔板中，37℃放置15 min；

    （8）加入终止液：以50 μl/孔将2M H₂SO₄加入96孔板中；

    （9）读数：立即置于酶标仪上，450n m处测吸光值；

对MRJP1标准蛋白检测结果方差分析如表1所示。

表1  Elisa 测定比较MRJP1全蛋白多克隆抗体（R1抗体）和特异性多克隆抗体（R2抗体）对MRJP1标准蛋白的效价

备注：*吸光值测定波长为450 nm；**平均值所标字母相同的表示无显著差异，显著性水平为p<0.01。

从表1可知，在1%显著水平上，稀释10000的抗体R1的OD值极显著高于对照BSA，稀释20000倍的R2抗体的OD值极显著地高于对照BSA；因此，R1抗体的Elisa效价＞1: 10000，而R2抗体的Elisa效价＞1:20000，即是R1抗体的2倍；同时R2抗体（即MRJP1特异性抗体）的效价极显著地高于的R1抗体（MRJP1全蛋白抗体）。

对蜂王浆检测结果方差分析如表2所示。

表2  Elisa 测定比较MRJP1全蛋白多克隆抗体（R1抗体）和特异性多克隆抗体（R2抗体）对蜂王浆的效价

备注：*吸光值测定波长为450 nm；**平均值所标字母相同的表示无显著差异，显著性水平为p<0.01。

从表2可知，在1%显著水平上，R1抗体的Elisa效价也是＞1:10000，R2抗体的Elisa效价也是＞1: 20000，即是R1抗体的2倍；同时R2抗体（即MRJP1特异性抗体）的效价极显著地高于的抗体1（MRJP1全蛋白抗体）。这与表1的趋势非常一致。

根据Western blot检测结果，R1抗体除了能与MRJP1产生免疫识别反应外，还能与MRJPs家族中的其他蛋白产生免疫识别反应。而R2抗体只能识别MRJP1。因此，抗体2的效价高于抗体1与Western blot检测结果是相吻合的。

实施例6： Elisa间接法定量测定蜂王浆中MRJP1的含量

1. 抗原、抗体溶液的配制

将超速离心法得到的MRJP1标准蛋白溶于CBS中，配成10 μg/ml的溶液。分别以MRJP1全蛋白多克隆抗体（R1抗体，1: 5000稀释）和特异性多克隆抗体（R2抗体，1: 10000稀释）为一抗；以HRP标记的羊抗兔IgG为酶标二抗，按1: 5000加入PBS中，配成二抗溶液。

2. MRJP1标准曲线的建立

将10 μg/ml的MRJP1标准蛋白溶液，分别按倍比梯度稀释法加样于96孔板，每孔加100 μl/孔，4℃包被过夜。弃孔中液体，用PBST缓冲液洗5遍，以200 μl/孔的量加入脱脂牛奶封闭液，37℃封闭1.5 h。弃脱脂牛奶封闭液，用PBST缓冲液洗5遍，以100 μl/孔的量，分别加入一抗R1抗体、R2抗体溶液，37℃反应1 h。弃一抗溶液，用PBST缓冲液洗涤5次，以100 μl/孔的量加入二抗溶液，37℃反应0.5 h。弃二抗溶液，用PBST缓冲液洗涤5次，以100 μl/孔的量加入显色液TMB，37℃反应15 min，以50μl/孔的量加TMB终止液2M H₂SO₄。立即置于酶标仪上，测定450 nm、630 nm处的测吸光值。

（1）用上述R1抗体检测得到表3。

表3  用R1抗体测定梯度稀释的MRJP1得到的吸光度

以OD₄₅₀-OD₆₃₀吸光值平均值（n=3）为纵坐标，MRJP1标准蛋白溶液浓度为横坐标，得到标准曲线（图4）：（R1）y=0.1100x+0.1239，R²=0.998；

（2）用上述R2抗体得到表4。以OD₄₅₀-OD₆₃₀吸光值平均值（n=3）为纵坐标，MRJP1标准蛋白溶液浓度为横坐标，得到标准曲线（图5）：（R2）y=0.1307x+0.0496，R²=0.999。

表4  用R2抗体测定梯度稀释的MRJP1得到的吸光度

3．用抗体R1和R2测定蜂王浆中MRJP1含量的效果比较

分别准确称量蜂王浆冻干粉0.1 g，溶于PBS中，配成浓度为100 μg/ml的溶液，分别按倍比梯度稀释法加样于96孔板，每孔加100 μl/孔。按以上方法，分别用R1和R2作为一抗测定蜂王浆冻干粉的OD₄₅₀-OD₆₃₀值。结果如下：

（1） R1抗体测定结果

用R1抗体测定得到的吸光值平均值为1.306±0.110（表5）；代入方程y=0.1100x+0.1239的X项，得到蜂王浆冻干粉溶液的MRJP1含量为10.75±1.00 μg/ml。

（2）R2抗体测定结果

用R2抗体测定得到的吸光值平均值为0.822±0.024（表5）；代入方程y=0.1307x+0.0496的Y项，得到蜂王浆冻干粉溶液的MRJP1含量（X )为5.91±0.19  μg/ml（%）。

表5  用R1抗体和R2抗体测定同种蜂王浆冻干粉MRJP含量结果比较

备注：* ：t=0.0012，** ：表示两个测定结果存在极显著差异。

（3）R1抗体和R2抗体测定结果及分析

对上述两个测定结果进行t检验，发现结果存在极显著差异（t<0.001），用R1抗体测定得到的蜂王浆冻干粉中MRJP1含量为10.75±1.00 μg/ml （%），高于用R2抗体测定得到的蜂王浆冻干粉中MRJP1含量（5.91±0.19 % μg/ml） 4.84 μg/ml （%），即R1比R1的检测结果高81.90%。根据R2抗体测定得到的MRJP1含量是R1抗体测定结果的55% (100×5.91/10.75)。

根据Western blot检测结果，R1能识别MRJPs家族的所有蛋白, R2抗体只能识别MRJP1蛋白。因此，R1的测定结果是MRJPs，R1的测定结果是MRJP1。

根据报道，MRJP1约占水溶性蛋白（MRJPs家族）的48%以上（Hanes and Simuth., J. 1992, J. Apicult. Res. 31: 22-26)。因此，本MRJP1占MRJPs的55%的结果与文献报道是一致的。