用主蛋白-1特异性多抗检测蜂王浆新鲜度和掺假蜂蜜的ELISA技术研究

摘要

蜂王浆是由工蜂由头部营养腺（包括脑后腺、咽下腺和上分，具有多种生理活性和营养保健功能，主蛋白1(MRJP1)是含量最高的蛋白质组分，是蜂王浆的关键功能组分。蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质。据以往研究报道，蜂蜜中含有蜜蜂自身分泌的MRJP1蛋白。本文通过研究，建立了采用MRJP1特异性抗体检测蜂王浆和蜂蜜中的MRJ颚腺等）分泌的乳状物质，它含有丰富的生物活性成P1含量的ELISA检测新方法，并通过对蜂王浆和蜂蜜中的MRJP1含量分析，进行了产品质量鉴别。主要结果如下：
　　(1)建立双抗体夹心法ELISA检测MRJP1含量的新方法
　　在原有MRJP1特异性多克隆抗体SP-1的基础上，采用根据MRJP1蛋白序列新设计的MRJP1特异性多肽，制备了新的特异性多克隆抗体SP-2，对SP-2添加了辣根过氧化酶标记(HRP-SP-2)。然后，以SP-1为捕获抗体，以酶标抗体HRP-SP-2为检测抗体，建立了双抗体夹心ELISA检测方法。经对双抗体夹心每步反应作条件优化，得到最佳反应条件:包被捕获抗体，37℃反应2h;5％脱脂奶粉，4℃封闭过夜;加入抗原，4℃反应过夜;加入酶标抗体，37℃反应2 h;加入TMB显色液，37℃反应15 min。
　　(2)间接法和夹心法ELISA检测方法优势比较
　　采用间接法和夹心法ELISA分别进行了MRJP1含量比较，包括:检测范围、重复性、精确度。结果表明:间接法检测范围为1-5.5μg/mL，样品回收率在77.96％-178.97％，变异系数在2.22％-19.39％;双抗体夹心法检测范围在2.5-10μg/mL，样品回收率在92.74％-100.72％，变异系数2.75％-12.4％。表明，相对于间接法ELISA，夹心法具有准确度高、重复性好，能满足快速检测条件的优点。
　　(3)双抗体夹心法ELISA检测蜂王浆新鲜度
　　建立了用双抗体夹心ELISA检测蜂王浆新鲜度的方法。将新鲜蜂王浆置于40℃下放置0、7、14、21、28、35 d后，然后双抗体夹心ELISA法分别检测不同处理时间样品的MRJP1降解程度，并与间接法法ELISA和SDS-PAGE电泳结果作对比验证。结果显示，鲜王浆中MRJP1在40℃下储存后明显降解，且与保温时间成正相关。
　　(4)蜂蜜中MRJP1含量的SDS-PAGE电泳检测
　　对蜂蜜样品进行SDS-PAGE电泳实验，用ImageJ软件分析MRJP1电泳条带灰度，以一定浓度的MRJP1标准品为指示蛋白，估算蜂蜜中MRJP1含量。在洋槐蜜中按比例加入玉米糖浆，分析SDS-PAGE电泳条带灰度，电泳条带灰度比与理论值接近，结果表明用SDS-PAGE电泳分析鉴定已知蜜的真伪具有可行性。分析了10个未知蜜源的商品蜂蜜样品，根据电泳条带预判真伪，显示5个样品为真蜂蜜、2个属掺假蜂蜜、3个属可能掺假蜂蜜。
　　(5)蜂蜜中MRJP1含量的ELISA检测
　　分别对6种已知蜜进行间接法和夹心法ELISA分析，同时对蜂蜜进行脱色处理，验证蜂蜜颜色对结果的影响，结果表明浅色蜜用间接ELISA法可不经脱色处理，深色蜜用间接ELISA法需经脱色处理，采用双抗体夹心法可省略脱色过程，结果较准确。
　　(6)掺假蜂蜜和商品蜂蜜真伪的ELISA检测
　　在洋槐蜜中按比例掺入玉米糖浆，再用双抗体夹心ELISA法检测掺假洋槐蜜中的MRJP1含量。结果表明，洋槐蜜中玉米糖浆含量与MRJP1含量成负相关，证实ELISA法鉴别掺假蜂蜜可行。在此基础上，对来自澳门市场的10个未知蜂蜜样品进行了ELISA检测，并与SDS-PAGE电泳结果进行了比较。结果显示，两种检测方法的结果比较类似。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 蜂王浆中关键蛋白MRJP1的功能

1．2 当前蜂王浆品质评价与新鲜度检测指标及方法

1．2．1 基于美拉德反应产物的检测

1．2．2 基于蛋白质结构与含量的检测

1．2．3 基于其他物质的检测

1．3 蜂蜜品质评价与掺假鉴定

1．3．1 稳定性碳同位素比率法检测技术

1．3．2 利用光谱技术鉴别蜂蜜掺假

1．3．3 核磁共振法(NMR)

1．3．4 利用蜂蜜的元素组成分析

1．3．5 酶活力测定

1．4 研究的目的、意义及技术路线

1．4．1 研究的目的、意义

1．4．2 研究内容

第二章 基于主蛋白-1特异性多抗的王浆新鲜度夹心法ELISA检测

2．1 材料、试剂与设备

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂及耗材

2．1．3 实验设备

2．1．4 实验试剂的配制

2．2 实验方法

2．2．1 特异性抗体抗体(SP-2)的设计与制备

2．2．2 双抗体夹心ELISA反应条件优化

2．2．3 双抗体夹心ELISA标准曲线绘制

2．2．4 夹心法与间接法ELISA比较

2．2．5 用双抗体夹心法检测蜂王浆新鲜度

2．2．6 数据分析

2．3 结果与分析

2．3．1 MRJP1特异性抗体SP-2的特性及效价

2．3．2 双抗体夹心法条件优化

2．3．3 双抗体夹心法测定MRJP1含量标准曲线

2．3．4 双抗体夹心法与夹心法比较

2．3．5 双抗体夹心法检验蜂王浆新鲜度

2．4 讨论

第三章 基于SDS-PAGE电泳技术的蜂蜜MRJP1含量测定

3．1 材料、试剂与设备

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂

3．1．3 实验设备

3．1．4 实验试剂的配制

3．2 实验方法

3．2．1 蜂蜜样品预处理

3．2．2 SDS-PAGE电泳及Western Blot分析

3．2．3 掺假蜂蜜SDS-PAGE电泳分析

3．2．4 商品蜂蜜SDS-PAGE电泳分析

3．2．5 数据分析

3．3 结果与分析

3．3．1 已知蜜源蜂蜜的SDS-PAGE电泳检测结果

3．3．2 掺假蜂蜜SDS-PAGE电泳分析

3．3．3 未知蜂蜜SDS-PAGE电泳分析

3．4 讨论

第四章 蜂蜜中MRJP1含量的ELISA检测研究

4．1 材料、试剂与设备

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验试剂及耗材

4．1．3 实验设备

4．1．4 实验试剂的配制

4．2 实验方法

4．2．1 蜂蜜样品预处理

4．2．2 ELISA分析

4．2．3 脱色蜂蜜MRJP1含量分析

4．2．4 蜂蜜人为掺假实验鉴定

4．2．5 商品蜂蜜样品真伪判别

4．2．6 数据分析

4．3 结果与讨论

4．3．1 用ELISA法分析蜂蜜中MRJP1含量

4．3．2 掺假蜂蜜的ELISA检测

4．3．3 商品蜂蜜样品的真伪判别

4．4 讨论

第五章 结论与展望

5．1 本研究主要研究成果

5．2 主要创新点

5．3 研究展望

参考文献

附录

作者简介及科研成果