参归丸在制备抑制肿瘤细胞的药物及联合化疗药物中的应用

摘要

本发明公开了参归丸在制备抑制肿瘤细胞的药物及联合化疗药物中的应用。本发明的有益效果为：本发明提供的参归丸在制备抑制肿瘤细胞的药物及联合化疗药物中的应用，参归丸具有有效的抑瘤率（>30%）；增加顺铂化疗荷瘤小鼠的有效体质量；改善荷瘤小鼠的生存状态；对顺铂化疗所致中性粒细胞和单核细胞减低有升高作用；参归丸能够拮抗顺铂化疗引起的脾脏指数和胸腺指数降低，有升高脾脏指数和胸腺指数的作用，对小鼠重要免疫器官具有一定的保护作用；能够降低HIF-1α的浓度水平，消弱肿瘤细胞耐受低氧的能力，促进肿瘤细胞死亡；降低LDH的活性，减少LDH对正常细胞的损伤，从而对顺铂化疗有减毒作用。

说明书

技术领域

本发明涉及中药的应用领域，具体涉及参归丸在制备抑制肿瘤细胞的药物及联合化疗药物中的应用。

背景技术

参归丸首见于《古今医鉴》卷九。由苦参（净末)4两，当归（净末)2两组成配方。有清热凉血之功。目前在多种数据库中搜索参归丸，仅得到《均匀设计优选当归苦参丸方药的半仿生提取工艺条件》一篇文章，未见将参归丸用于肿瘤治疗的临床或实验报道。研究证明当归多糖及其硫酸酯对活化T细胞增殖有直接促进作用，当归多糖能增强非特异性免疫功能,而对体液免疫功能有抑制作用。硫酸酯化当归多糖在体内具有显著抗肿瘤活性，当归多糖可诱导DC分化与成熟,刺激T细胞增殖和肿瘤杀伤活性。当归多糖对肉瘤S-180荷瘤小鼠具有一定的抑瘤作用并明显促进荷瘤小鼠的胸腺指数和脾脏指数的增加。氧化苦参碱与环磷酰胺合用可提高抑瘤率,对高剂量环磷酰胺引起的白细胞数减少以及肝损害具有一定的缓解作用。苦参碱可以调动机体的免疫功能,产生抑瘤效应,在肿瘤化疗辅助用药方面具有应用前景。苦参碱对于小鼠Lewis肺癌原发瘤的生长具有一定的抑制作用，并能显著抑制瘤组织微血管形成,可能与其抑制肿瘤VEGF mRNA和蛋白表达有关。苦参碱在体内体外都对小鼠H22肝癌细胞表现出较强的抗肿瘤作用和诱导凋亡作用, 促凋亡作用与其上调细胞内Bax 表达, 抑制Bc-l 2表达有关。

参归丸具有清热燥湿的功效，主治与肿瘤病机相吻合。现代研究证明当归多糖和氧化苦参碱皆具有抗肿瘤作用。恶性肿瘤的发生和转移与肿瘤细胞的耐受缺氧能力及代谢有关。HIF-1α是组织细胞对低氧的适应性反应，是独立于血氧浓度的敏感控制因子，能够激活细胞内代谢废物清除基因及VEGF的表达，促进肿瘤组织代谢产物的清除及血管生成。HIF-1α可以成为肿瘤治疗的潜在靶点，药物通过下调HIF-1α抑制肿瘤细胞内代谢产物的清除，促进肿瘤细胞死亡。LDH同工酶是诊断心肝肾损伤的重要指标，细胞膜损伤后释放到细胞外。队列研究表明LDH高，预后差。传统的抗癌药物在杀灭恶性肿瘤细胞的同时对机体的正常细胞也损伤作用，引起机体免疫等多种功能的严重下降，脾脏指数和胸腺指数的降低、白细胞减少。因此，研究具有抑瘤作用及对化疗药物具有增效减毒作用的中药逐渐成为中医药研究的热点。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了参归丸在制备抑制肿瘤细胞的药物及联合化疗药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：参归丸在制备抑制肿瘤细胞的药物中的应用。

本发明的第二个目的是提供了参归丸在制备抑制肿瘤细胞的联合化疗药物中的应用，所述联合化疗药物的组成为参归丸和顺铂。

进一步的，上述的应用，所述参归丸中，按照重量比当归：苦参为1：2。

进一步的，上述的应用，所述参归丸的入药形式为汤剂。

进一步的，上述的应用，所述肿瘤细胞为H22肝癌细胞。

参归丸在制备抑制肿瘤细胞的药物中的应用，所述参归丸的用量为每千克体重每天9g，用药方式为灌胃，用药时间为14天。

参归丸在制备抑制肿瘤细胞的联合化疗药物中的应用，所述联合化疗药物中，参归丸的用量为每千克体重每天9g，用药方式为灌胃，用药时间为14天；顺铂的用量为每千克体重每天2.0mg，用药方式为腹腔注射，用药时间为14天。

本发明的有益效果为：本发明提供的参归丸在制备抑制肿瘤细胞的药物及联合化疗药物中的应用，参归丸具有有效的抑瘤率（>30%）；增加顺铂化疗荷瘤小鼠的有效体质量；改善荷瘤小鼠的生存状态；对顺铂化疗所致中性粒细胞和单核细胞减低有升高作用；参归丸能够拮抗顺铂化疗引起的脾脏指数和胸腺指数降低，有升高脾脏指数和胸腺指数的作用，对小鼠重要免疫器官具有一定的保护作用；能够降低HIF-1α的浓度水平，消弱肿瘤细胞耐受低氧的能力，促进肿瘤细胞死亡；降低LDH的活性，减少LDH对正常细胞的损伤，从而对顺铂化疗有减毒作用。

实验验证：

1 材料：

1.1 动物：

SPF级昆明小鼠100只，公45只，母55只，质量20-22g，由甘肃中医学院SPF级动物实验中心提供，动物合格证号: SCXK( 甘) 2011－0001，SPF级动物实验设施使用证号：SYXK(甘)2011-0001。

1.2 细胞株：

H22肝癌瘤株由甘肃中医学院中西医结合研究所传代培养。

1.3 药物与试剂：

CO₂培养箱（NAPCO法国），RPMI1640(美国Invitro公司)，顺铂注射液，10mg/支，齐鲁制约有限公司（批号: 201002CF）； HIF1α 试剂盒，上海源叶生物科技有限公司（批号：20121001A）；LDH试剂盒，南京建成生物工程研究所（批号：20121011）。参归丸为自制汤剂（每ml 药液含0.45g生药，当归0.15g/ml、苦参0.30g/ml）。

1.4 仪器：

SW-CJ-IF超净台（中国苏州净化设备厂），电子天平（LD100001, 龙腾电子有限公司），Abacus Junior vet 5动物血清分析仪（兰桥医疗），酶标仪（680型，美国BD-RAD公司），UV1101紫外-可见分光光度仪（上海天美科学有限公司）。

2 方法：

2.1 参归丸汤剂的制备：

将当归饮片15g，苦参饮片30g放在陶土药锅中，加500ml去离子水浸泡30min，沸腾后文火煎药1h，将药液倒入烧杯中，药渣仍留在药锅中，待药锅温度下降后，再加500ml去离子水浸泡30min，沸腾后文火煎药1h，将两次煎出液混合后在水浴锅中水浴加热浓缩到100ml，高压灭菌。其外观在无色玻璃量筒中呈深棕褐色、黏稠适中、透明，药物浓度按生药量计算为 0.45g/mL，SPF级实验室内常温保存3天。

2.2 动物模型制备：

在无菌条件下，在SPF级实验室内取100只KM小鼠，母55只，公45只，实验室条件下适应环境4d后，按随机数字表法分出雌雄各8只，设为正常对照组。取传代 7 天的腹水型 H22小鼠腹水，用生理盐水调至细胞浓度为 2 ×10⁶个·mL^-1，将84只小鼠以75%乙醇消毒，按常规方法皮下注射配制好的 H22肝癌细胞悬液 0.2mL，接种于昆明小鼠右前腋皮下，细胞计数约为4×10⁵个，以出现皮丘为皮下接种部位正确。5-7天内观察小鼠接种部位的肿瘤生长情况，接种部位可见或触及结节为接种成功。

2.3 模型动物分组及处理：

第8天剔除出瘤不佳或接种不成功的小鼠，随机挑选接种成功的小鼠，公母各32只随机分为模型对照组、顺铂组、参归丸组和参归丸加顺铂组，每组 16 只。分组后称重，模型对照组以生理盐水20mL·kg^-1·d^-1灌胃，顺铂组以 2.0mg·kg^-1·d^-1腹腔注射0.2ml，参归丸组以 9g·kg^-1·d^-1灌胃0.4ml 参归丸药液，参归丸加顺铂组组以 9g·kg^-1·d^-1灌胃参归丸药液，腹腔注射2.0mg·kg^-1·d^-1顺铂0.2ml，连续给药14天。观察小鼠生存状态，作为评价药物毒性的指标之一；停药后次日称取体质量，眼球取血检查血常规及离心后取血清置-20℃以下保存。剥离瘤体组织，摘取肝、脾、肾、胸腺后分别称重。计算抑瘤率、肿瘤、肝脏、肾脏、脾脏、胸腺等的指数及有效指数，以及用药前后的体质量变化。体质量变化=处死时的体质量-分组完成时的体质量。处死前死亡的小鼠，不参与平均值的计算。抑瘤率(%) = (模型对照组平均瘤质量－实验组平均瘤质量)/模型对照组平均瘤质量。器官指数= 器官质量(mg)/体质量(g)。有效器官指数=器官质量/(体质量-肿瘤质量)。有效体质量变化=处死时的体质量-瘤重-分组完成时的体质量。

2.4药效评价：

按照国家卫生部药政管理局制定的治疗恶性肿瘤的中药药效评价标准：

(1)对照组小鼠肿瘤均值不得低于1g；

(2)肿瘤抑制率在30%以上，与对照组比较有显著性差异；

(3)给药组动物平均体质量下降(与自身对照)不得超过15%；

(4)动物死亡数不超过20%。

2.5 联合用药疗效：

根据Webb氏分数乘积法计算q值:q=E_AB/[E_A+(1-E_A)E_B。式中E_A为A药（参归丸或参归丸）抑瘤率，E_B为B药（顺铂）抑瘤率，E_AB为联合用药组两药合用的抑瘤率，q=0.85-1.15为两药作用相加，q>1.25为两药作用增强(或协同)，q<0.85为两药拮抗。

2.6 统计处理：

实验数据均以 (                                                ±s)表示，采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，方差齐性检验后，组间比较用t检验。

2 结果：

2.1 造模成功率：

37只雄鼠在接种7天时全部出现瘤结节，平均直径3mm，造模成功率100%。47只雌鼠中有39只出现瘤结节，平均直径2.3mm，造模成功率83%。多次预实验发现个别豆粒大小的瘤体会自行消失或不生长，使得造模成功率比实际值偏大，因此本研究用于造模的小鼠数量比理论数量多。

2.2 荷瘤小鼠的一般状况：

接种成功后，瘤块体积逐渐增大，外观呈球形、半球形或山脉状。初期能活动，后来大多逐渐变硬。分组前荷瘤小鼠身形匀称（瘤体隆起处除外），动作敏捷，反应灵活，皮毛光滑，进食进水正常; 分组4天后，随着实验时间的继续延长，顺铂组小鼠最先出现精神萎靡，饮食活动减少，聚集一团，皮毛成揪失去光泽，下腹部不洁净，尿液变黄等现象，参归丸加顺铂组中上述现象的出现比顺铂组较晚。模型组中上述现象的出现又晚一些，当归贝母苦参组丸中上述现象的出现最晚。从饮食、活动及毛发色泽来看，参归丸组小鼠生存质量和生存状态均明显高于顺铂组。一般状况比较表明顺铂整体状况最差。如表1所示为接种第21天时各组小鼠一般状况比较。

表1

。

2.2 瘤体质量、抑瘤率的测定：

参归丸、顺铂、参归丸联合顺铂皆有抑瘤作用，如表2所示为各组瘤体质量及抑瘤率的比较( ± s)。顺铂组小鼠死亡3只，死亡时体质量分别为15.4g、15.8g、14.6g。3只小鼠死亡前两天蜷卧，无欲状态。死亡小鼠不参加列表统计。根据, 说明参归丸和顺铂联合应用存在相加作用。

表2

。

与模型组比较，★P ＜0.01。

2.3 荷瘤小鼠治疗前后体质量比较：

如表3所示为肝癌 H22荷瘤小鼠体质量变化比较(± s)。

表3

。

各组间比较首次给药时的体质量，★P＞0.05；与模型组比较，* *P＞0.05；与模型组比较，* P＜0.01；与参归丸组比较，*** P＜0.01。

2.4 荷瘤小鼠器官指数比较：

如表4所示为肝癌 H22荷瘤小鼠肝脏指数、肾脏指数、脾脏指数、胸腺指数(± s)。

表4

。

注: 与顺铂组比较，★ P ＜0.01；★★P ＜0.01.

2.5 荷瘤小鼠有效器官指数比较(±s)：

。如表5所示为肝癌 H22荷瘤小鼠有效的肝脏指数、肾脏指数、脾脏指数、胸腺指数比较(± s)。

表5

。

注: 与顺铂组比较，★ P ＜0.01；★★P ＜0.01。

2.6 荷瘤小鼠血细胞计数比较：

白细胞计数反映了小鼠机体的炎症及骨髓抑制情况，在2ml离心管中滴加肝素生理盐水80微升，再加入全血20微升，在动物血常规仪中进行检测，肝癌 H22荷瘤小鼠血细胞计数(n=10,± s)统计结果如表6所示。

表6

。

注:与顺铂组比较，*P>0.05；▲，★P ＜0.05。

2.7 荷瘤小鼠血清HIF1α浓度和LDH活性：

严格按照试剂盒说明书操作，将得到的OD值转化为HIF-1α的浓度值和LDH的活力值。各组小鼠血清HIF-1α、LDH水平比较结果(± s)如表7所示。

表7

。

与模型组比较，*P<0.05 ；与顺铂组比较，★P<0.01。

具体实施方式

实施例1：

参归丸在制备抑制肿瘤细胞的药物中的应用，参归丸按照重量比当归：苦参为1：2，参归丸入药形式为汤剂，肿瘤细胞为H22肝癌细胞，参归丸的用量为每千克体重每天9g，用药方式为灌胃，用药时间为14天。

实施例2：

参归丸在制备抑制肿瘤细胞的联合化疗药物中的应用，联合化疗药物的组成为参归丸和顺铂，参归丸按照重量比当归：苦参为1：2，参归丸入药形式为汤剂，肿瘤细胞为H22肝癌细胞，参归丸的用量为每千克体重每天9g，用药方式为灌胃，用药时间为14天；顺铂的用量为每千克体重每天2.0mg，用药方式为腹腔注射，用药时间为14天。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。