巢式一步法RT-PCR从单个B细胞扩增鼠源抗体重链和轻链可变区基因全序列的方法

摘要

本发明涉及基因工程领域，目的在于提供一种巢式一步法RT-PCR从单个B细胞扩增鼠源抗体重链和轻链可变区基因全序列的方法。本发明根据NCBI和VBASE的小鼠免疫球蛋白重链和轻链的V基因序列设计兼并引物，可以特异性地扩增得到囊括所有V基因种类的DNA序列。然后通过特定的接头DNA片段(Linker接头)将重链和轻链的可变区基因序列连接在一起，再通过巢式PCR进行扩增，并带入酶切位点，可以克隆到特定的双向表达载体，进行真核表达。本发明优点为：覆盖面广，灵敏度高，效率高，通量大，步骤简单，简化劳动，降低成本，应用范围广，结果可靠。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种巢式一步法RT-PCR从单个B细胞扩增鼠源抗体重链和轻链可变区基因全序列的方法。

背景技术

单克隆抗体药物具有特异性强、副作用小等临床优势，抗体药物直接与靶标结合，靶向特异性强，同时，抗体识别目标的灵敏度很高，用药量少；再加上抗体药物本身属于蛋白质，其在体内代谢与其他内在抗体和蛋白质过程相同，不会额外对肝肾造成负担，因而一般副作用很小，具有广阔的应用前景，目前主要用于肿瘤、自身免疫等疾病的治疗。

    抗体分子的基因结构较复杂，抗体的轻链L由C、V和J 3个基因簇编码，抗体的重链H由C、V、D和J 4个基因簇编码。V是抗体基因编码可变区，人的总V_H基因数量约为100个，D基因片段为10-20个，J_H 基因片段有9个；小鼠V_H 的基因片段的数目约为250-1000种，D基因片段有12个，J_H基因片段有4个；抗体轻链分为κ和λ2个亚型，正常人血清免疫球蛋白κ链：λ链约为2：1，V_κ 基因的数量约为100个；而小鼠95%的抗体轻链是κ型，小鼠V_κ 基因片段约有250个，这些基因片段通过多种多样的重排，合成出的肽段再进一步进行L和H链组合，从而生成众多的抗体种类。

目前，人们已经开发出多种抗体药物筛选的方法，如杂交瘤融合技术，噬菌体展示技术和酵母展示技术等。与传统的杂交瘤融合技术相比，抗体的体外表达技术具有效率高，操作简单，实验周期短等优点（Clackson T, Nature, (1991) 352:624-628; Boder E, Nature Biotechnol, (1997) 15:553-557），其逐渐成为功能强大的抗体药物开发工具。从单个B细胞中扩增得到抗体基因的V_H和V_L的全序列是其中的关键步骤。

发明内容

本发明的目的在于提供一种巢式一步RT-PCR从单个B细胞中扩增抗体基因重链可变区V_H和轻链可变区V_L的方法。本发明根据NCBI和VBASE的小鼠免疫球蛋白重链和轻链的V基因序列设计兼并引物，可以特异性地扩增得到囊括所有V基因种类的DNA序列。然后通过特定的接头DNA片段(Linker接头)将重链和轻链的可变区基因序列连接在一起，再通过巢式PCR进行扩增，并带入酶切位点，可以克隆到特定的双向表达载体，进行真核表达。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

一种巢式一步法RT-PCR从单个B细胞扩增鼠源抗体重链和轻链可变区基因全序列的方法，所述的方法步骤如下：

（1）寡聚脱氧核糖核酸引物和接头设计

根据NCBI和VBASE上已报道的小鼠免疫球蛋白重链和轻链的V基因序列设计兼并引物，根据小鼠抗体重链和轻链的家族分类，重链可变区上游引物命名为VH1-VH13（长度为41-46bp），下游引物命名为CH1；轻链可变区上游引物命名为VK1-VK19（长度为41-46bp），下游引物命名为CK1；上述上游引物起始于小鼠重链和轻链可变区5’末端，下游引物终止于小鼠重链和轻链的恒定区；重链可变区上游引物和轻链可变区上游引物的5’端分别带入linker接头，重链可变区上游引物带入的linker接头和轻链可变区上游引物带入的linker接头互补；

重链可变区上游引物和轻链可变区上游引物的5’端分别带入的linker接头序列如下：

重链linker：5’-TCGGCCGTAGCTTGCGCGCCTCCA-3’

轻链linker：5’-GGCGCGCAAGCTACGGCCGATGT-3’；

加粗斜体标注部分为加入的EagⅠ和BssHⅡ的酶切位点，下划线所示为重链linker与轻链linker的互补区。

（2）一步法RT-PCR

以单个B cell为模板通过逆转录酶将重链、轻链可变区基因的mRNA逆转录为cDNA，然后以cDNA为模板，重链可变区上游引物VH1-VH13，下游引物CH1和轻链可变区上游引物VK1-VK19，下游引物CK1为引物，扩增出重链、轻链可变区基因；扩增出重链和轻链可变区基因的上游引物带入互补的Linker接头，通过PCR产物的退火互搭，重链和轻链的可变区基因连接在一起，形成V_H-linker-V_L的DNA片段。

（3）巢式PCR

以V_H-linker-V_L的DNA片段为模板，采用巢式PCR进行扩增，扩增得到可以连接到双向表达载体中的V_H-linker-V_L的PCR产物。

 

重链可变区上游引物及下游引物的序列如下：

轻链可变区上游引物及下游引物的序列如下：

上述序列中：M=A/C， R=A/G， W=A/T ，S=G/C，Y=C/T，K=G/T，V=A/G/C，H=A/C/T，D=A/G/T， B=G/C/T，N=A/G/C/T。“/”代表和的关系。M、R、W、S、Y、 K、V、 H、D、B、N都是行业内标准的兼并碱基的代码。以M为例，M中A、C各占50%，R、W、S、Y、 K同理，以V为例，V中A、G、C各占三分之一，H、D、B同理，N中则A、G、C、T各占四分之一。

作为优选，所述linker接头内包含EagⅠ和BssHⅡ的酶切位点。通过linker上带入的EagⅠ和BssHⅡ的酶切位点，可以将真核细胞的启动子P1和P2带入到重链和轻链基因的起始端，进行抗体的真核表达。

作为优选，步骤（3）中巢式PCR使用的引物两端带入了Sfi1的酶切位点。通过此酶切位点，扩增得到的PCR产物可以连接到双向表达载体。

巢式PCR使用的引物包括重链可变区引物及轻链可变区引物，

重链可变区引物CH2序列为：

CH2a：aggccgggtgggccGGATAGACMGATGGGGCTG（SEQ ID NO.17）

CH2b：aggccgggtgggccGGATAGACWGATGGGGGTG（SEQ ID NO.18）。

轻链可变区引物CK2序列为：

CK2：acggccacataggccCCACTTGACATTGATGTC（SEQ ID NO.40）。

本发明的引物中：VH1、CH1、CH2、CK1均为兼并引物。以CH2为例，CH2包括CH2a：aggccgggtgggccGGATAGACMGATGGGGCTG、

CH2b：aggccgggtgggccGGATAGACWGATGGGGGTG两部分， CH2a、CH2b可以各占50% 组成CH2。VH1（VH1a+VH1b各50% 组成）、CH1（CH1a+CH1b各50% 组成）、CK1(CK1a+CK1b各50%组成) 的构成也同理可知。

 本发明的有益效果是：

1、覆盖面广。扩增小鼠重链和轻链可变区DNA序列的引物根据NCBI和VBASE上已报道的V基因序列设计，覆盖面包括了全部已知的VH基因片段的15个家族和VL基因片段的15个家族。

2、灵敏度高。本方法经过第一步的RT-PCR和第二步的巢式PCR的2轮反应，可以扩增出少至单个B细胞中的抗体基因片段。

3、效率高，通量大。与传统的杂交瘤细胞的抗体筛选方法相比，本方法大幅提高了抗体筛选的效率和通量。

4、步骤简单，简化劳动，降低成本。通过本方法直接获得V_H和V_L的基因进行体外表达，从而进行抗体药物的筛选。避免了杂交瘤融合技术的繁琐操作和培养细胞所需要的时间，节省了大量的财力和时间。

5、应用范围广。本方法可以应用于任何鼠源抗体进行筛选。

6、结果可靠。使用巢式PCR，用内侧引物进行特异性的扩增，提高了PCR的准确性和可靠性。对PCR产物进行测序，扩增V区的准备率达到100%。

 附图说明

图1是本发明的流程图：

CH：重链恒定区；CL：轻链恒定区 VH：重链可变区

VL：轻链可变区；P1-P2：真核细胞启动子

(a) 以单个B细胞mRNA为模板，通过特异性引物扩增得到抗体重链和轻链可变区基因，5’引物起始端带入linker，重链和轻链引物的linker互补。

(b) 重链和轻链可变区的PCR产物可以通过linker的退火互搭连接在一起，生成V_H-linker-V_L的DNA片段。再通过第二轮的巢式引物进行特异性的扩增，第二轮的巢式引物两端带入了Sfi1的酶切位点，通过此酶切位点，扩增得到的PCR产物可以连接到双向表达载体。

(c) Linker上带入EagⅠ和BssHⅡ的酶切位点，可以将真核细胞的启动子P1和P2带入到重链和轻链基因的起始端，进行抗体的真核表达。

图2以单个B淋巴细胞作为模板经本发明扩增出重链-轻链可变区序列的结果。

图3是PCR扩增目的片段的验证结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

（1）B 淋巴细胞的分离

1.1应用免疫磁珠分离CD19+ B 淋巴细胞

无菌取小鼠脾脏，研磨分散成单个细胞，40μm过滤器除去大块组织，用5% FBS-PBS重悬细胞，2000rpm离心3min，去除上清。用1×lysis buffer（0.15M NH₄Cl） 10ml重悬细胞，室温静置15min后2000rpm离心3min，去除上清，用5% FBS-PBS重悬细胞，2000rpm离心3min，去除上清。用5% FBS-PBS调节细胞浓度为2×10⁷ 个/ml，加入150μl CD19+ microbeads， 4℃孵育15min后，加入10ml 5% FBS-PBS终止反应，2000rpm离心3min，去除上清之后用10ml 5% FBS-PBS 洗涤一次。用1ml 5% FBS-PBS重悬细胞，将试管放置于磁架上，用1.5ml buffer洗脱3次。最后撤离磁场，用1.4ml buffer洗脱并收集CD19+ B 淋巴细胞。

1.2 将 B cell分到Reaction buffer中

将分离出的B cells用生理盐水洗涤2遍，之后悬浮于生理盐水中，调整至浓度为1×10⁴ cells/ml，取1μl加到10μl Reaction buffer中，即每个PCR管中B cell数目为10个。细胞分到10μl Reaction buffer 后，立即冻于-80℃ 冰箱中，用于后续PCR实验。10μl Reaction buffer配方为：5×ImpromⅡ buffer 4μl、dNTP（10mM） 1μl、MgCl₂（25mM） 2μl、RNasin（40U/ul）0.4μl、RNase free H₂O 2.6μl，其中5×ImpromⅡ buffer、MgCl₂（25mM）、RNasin（40U/μl）购买于promega公司，dNTP（10mM）、RNase free H₂O购买于Takara公司。

（2）一步法RT-PCR

以单个B cell为模板进行一步法RT-PCR。第一步PCR为RT-PCR，即反转录PCR在同一PCR管中进行，通过逆转录酶将重、轻链可变区基因的mRNA逆转录为cDNA，然后以cDNA为模板扩增出重、轻链可变区基因。

从-80℃ 冰箱中取出分好的B cell，加入引物、ImpromⅡ RTase、EX Taq、EX Taq Ab后进行第一步RT-PCR。

PCR具体条件如下：

第一步PCR：重链V区VH1-VH13共13条上游引物（其中VH1由VH1a+VH1b各50% 组成）、轻链V区VK1-VK19共19条上游引物、重链V区下游引物CH1（CH1a+CH1b各50% 组成）、轻链V区下游引物CK1的浓度均为10nm。RT引物为Random hexamer，浓度为200nm，反应体系为20μl，模板为分到PCR管中的单个B cell。PCR的反应条件如下：25℃ 5min，50℃ 60min，95℃ 15min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 40s （一共15个cycles）；72℃ 7min。

（3）巢式PCR

巢氏引物CH2（CH2a+CH2b各50% 组成）+CK2，每条浓度为0.2μm。模板为第一步 PCR产物1μl，反应体系为25μ。PCR的反应条件如下：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 90s （一共40个cycles）；72℃ 7min。扩增产物经1.5% 的琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收后进行克隆和序列测定。共挑取5个克隆进行测序，测序结果如图3所示，所得的PCR产物均来自于小鼠抗体重链和轻链可变区基因序列。

单个B细胞为模板，经本发明扩增出的重链-轻链可变区序列的电泳图谱见图2，其中NC为阴性对照。

 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  杭州鸿运华宁生物医药工程有限公司

 

<120>  巢式一步法RT-PCR从单个B细胞扩增鼠源抗体重链和轻链可变区基因全序列

       的方法

 

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<170>  PatentIn version 3.3

 

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ggcgcgcaag ctacggccga tgtsrgatat tgtgatgacg cagg                      44

 

 

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ggcgcgcaag ctacggccga tgtgtctcca gccaccctgt c                         41

 

 

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ggcgcgcaag ctacggccga tgtgcctgtg cagacattgt gat                       43

 

 

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