一种基于内含成分的快速初筛茶树优异资源的方法

摘要

一种基于内含成分的快速初筛茶树优异资源的方法，是取生长条件与生长势基本一致的茶树芽头第一片展开叶，用液氮冷冻处理后，将叶片捣碎，直接以甲醇快速提取，离心，取上清液，利用高效液相色谱检测茶叶中内含成分，比较各内含成分含量，从中初步筛选优异茶树种质资源，在此基础之上，采用已知方法对初筛的优异种质资源进一步进行复筛。该方法简便，设备要求低，简化了实验材料前处理工序，大幅度减少了劳动强度，且使用试剂用量少，降低了测定成本与时间，可用于高通量分析。

说明书

技术领域

本发明属于经济作物种质创新技术领域，具体涉及一种基于内含成分 的快速初筛茶树优异资源的方法。

背景技术

茶叶是中国重要的经济作物和传统的出口产品，中国茶叶种植面积和 年产量均居世界第一位。中国作为茶树原产地，茶区地跨暖温带、亚 热带和边缘热带，生态资源和茶树种质资源丰富，是茶树遗传变异的 巨大宝藏。据不完全统计，全国各产茶省/区收集入圃保存的各类茶树 种质资源已达3000余份，而尚未入圃茶树资源数目更多。这些 茶树 优异种质资源是茶树种质创新、品种选育、生产利用的物质基础。然 而如何高效快速地筛选优异资源是茶业界尚未解决的重要问题。

虽然分子标记技术的发展使早期鉴定技术从形态、生化水平发展到分 子水平，对缩短育种年限和提高育种效率具有重要、现实的意义。其 不仅可以定位目标基因，也可利用与目标基因紧密连锁标记追踪目标 基因，在育种过程早期对目标性状进行分子标记辅助选择。但是由于 茶树遗传背景复杂，茶树分子生物学研究进展缓慢，目前分子标记手 段尚未能应用于茶树优异种资源的筛选。因此，化学筛选法仍然是目 前茶树优异资源尤其是特异品质化学成分资源筛选的主流手段。

茶叶中富含茶多酚、咖啡碱、氨基酸等内含成分。茶叶的色、香、味 和茶叶中含有的多酚类化合物有很大的关系，尤其是色泽和滋味。茶 多酚中最主要的是儿茶素类化合物，影响着茶叶的品质，与人体的保 健功能有重要的关系。儿茶素类化合物包括很多种儿茶素，最重要的 有表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素 （EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（ECGG）和没食子儿茶素没食子 酸酯（GCG）等几种，EGCG 的含量占儿茶素总量的50%以上，而EGCG 和ECG对人体健康的作用引起特别的关注。茶叶中咖啡碱具有提 神、兴奋和降脂减肥的功效，但咖啡碱在茶叶中也存在多种不利影响 ，因此低咖啡碱茶叶往往深受消费者喜爱。茶叶中的氨基酸与茶叶品 质密切相关，茶叶中的氨基酸总量可达2～4%，尤其是绿茶中茶氨酸的 含量更高，占氨基酸总量的50%以上。茶氨酸具有解除疲劳、降低血压 、增效抗癌药物药效和预防人体肝脏损伤的作用。由此可见，茶叶中 各种活性成分各自具有其独特的生理活性，同时也发挥综合的协调功 能和生理调节作用。不同品种的茶叶中内含成分组成和水平差异较大 ，这些内含成分是茶树育种者考察的主要指标。而对这些指标的分析 ，目前采用的方法是将茶叶经干燥，以大量的容积回流提取，过滤获 得检测样品，再经色谱方法检测。该方法步骤繁琐，不仅花费大量时 间，而且有机溶剂用量大，提取效率低，且需要的材料量大，样品需 烘干处理。由此可见，经典的化学筛选法方法无法胜任从大量的茶树 资源中筛选出优异种质。因此，建立快速高通量的茶叶内含成分分析 方法，快速获取茶树新种质，是突破当前茶树育种和种质创新困境的 重要突破口。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种 简便、快速且适用于高通量分析的基于内含成分的快速初筛茶树优异 资源的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种基于内含 成分的快速初筛茶树优异资源的方法，该方法步骤如下：

1）取各茶树最上端芽头第一片展开叶，无破损地装入2mL塑料离心管 ，盖上盖子，对各样品进行标记；取样时，要求取样时的茶树为茶树 资源生长条件及生长势基本一致、且取样时间点一致的茶树；采集的 样品小心放在离心管中，不能破损，可防止因细胞受损导致茶叶内含 成分发生化学或物理变化；且离心管的盖子要求盖好，以防样品失水 或风干，导致结果误差过大；

2）室温下，对各个样品进行准确称重；

3）盖紧各样品的离心管盖子，于液氮中冷冻30-60s后取出，迅速将叶 片捣碎；要求注意液氮不能进入离心管内，捣碎叶片时可用玻璃棒捣 碎，也可以加入不锈钢小珠采用振荡器振碎。

4）于各离心管中分别加入1.5 mL分析纯甲醇，盖紧离心管盖子，涡 旋30s，60-70℃孵育5-10min，再涡旋1-2min，冷却至室温，高速离心 ，得上清液；在加入甲醇时，要先用甲醇将玻璃棒或振荡钢珠淋洗， 以保证样品无损失。如当天不进行高效液相色谱分析，可将孵育再涡 旋、冷却后的甲醇溶液保存于-20℃直到下次分析，但采集的样品要求 在当天提取完毕，也就是需得到本步骤中的孵育再涡旋、冷却后的甲 醇溶液。

所述高速离心时的转速为12000-14000rpm，时间为2-5min。如果没有 高速离心机，也可以使用低速离心机，但离心时间要适当延长。低速 离心时，根据仪器的最大转速来确定时间，以使提取液中的不溶物全 部沉积到底部为宜。

5）取该上清液作高效液相色谱分析，对比液相色谱数据，根据茶叶内 含成分（主要指儿茶素、茶氨酸和咖啡碱）初步确定优异茶树种质资 源。在比较分析内含成分水平时，可以单片叶中的总量计算，也可以 根据茶叶单位鲜重的量来计算，具体采用什么方式，需根据茶叶实际 生产追求的目标来定。色谱分析时可以用紫外检测器、质谱检测器和 蒸发光散射检测器等。

采用本发明方法对茶树优异资源进行初步筛选后，根据国标方法（GB /T 8313-2008）进行采样与样品制备，采用高效液相色谱分析，可对 初步筛选的结果进一步复筛，此过程为现有技术，在此不再赘述。

上述初筛和复筛中提及的高效液相色谱分析过程的条件如下：

儿茶素、咖啡因液相色谱分析条件：Kromasil^TM C18色谱柱( 5μm, 200mm×4.6mm )，柱温为40℃，流速为1mL/min，进样量为10μL，检 测波长为278nm，流动相为水(含0.15%醋酸)-乙腈（含0.15%醋酸）， 体积比为9:1。

茶氨酸液相色谱条件：Kromasil^TM C18色谱柱( 5μm,200mm×4.6mm )，流动相为乙腈-10 mol/L十二烷基磺酸钠(含0.1%的磷酸)水(体积 比为3:7)，流速1 mL/min，柱温40℃，检测波长为200nm，进样量10 μL。

与现有技术相比，本发明的优点：本发明方法简便，不需进行样品干 燥、回流提取及过滤等步骤；取材少，不影响植株的正常生长，适用 于珍贵资源的分析；设备要求低，占地面积小；样品制备可在15分钟 内完成，大幅度缩短了 制备时间；使用试剂用量少，绿色环保，大幅度降低了检测成本；采 用本方法制备的样品溶液可用于分析茶叶中茶氨酸、咖啡碱、各种儿 茶素、黄酮类化合物、花青素和原花青素等茶叶主要活性物质；本方 法可同时完成成千上百个样品的制备，适用于高通量分析。

具体实施方式

下面，本发明将以实施例进行进一步地说明，但是本发明并不限于这 些实施例的任一个或类似实例。

实施例1：

以湖南省湘西保靖县葫芦镇黄金村野生茶树资源为考察对象，于2010 年4月6号取样，总共采集1000个样品。取样方法是，每一株野生茶树 取一个样品，剪切离地面最远的芽头上第一片展开叶，无破损地装入 2mL塑料离心管，盖好盖子，标记样品来源。取样完毕，将所采集样品 带回实验室。准确称重后，于液氮中冷冻处理30s，取出离心管，打开 盖子，迅速用玻璃棒将叶片捣碎，向离心管中加入1.5mL 分析纯甲醇 ，盖紧离心管盖子，涡旋30 s，60℃孵育10 min，再涡旋1min，冷 却至室温，12000 rpm/min高速离心5min，取上清液，利用高效液相 色谱分析儿茶素、茶氨酸和咖啡碱的含量（分析条件见前面叙述）， 以根据茶叶内含成分确定优异茶树种质资源。结果表明，1000株野生 茶树中，茶氨酸含量大于0.75%（湿重）的有5株，EGCG含量大于3%（ 湿重）的有6株。根据高通量检测结果，初步确定上述11株为特异资源 。根据国标方法（GB/T 8313-2008），复筛结果表明：茶氨酸含量大 于4%（干重）的有1株，EGCG含量大于17%的有2株。高茶氨酸茶叶适合 制作高档绿茶，高EGCG茶叶适用于制作高档红茶或EGCG提制。筛选到 的3株茶树被认为新的特异种质，可通过无性扩繁获得优良茶树品种。

实施例2：

以湖南省湘西保靖县葫芦镇葫芦村野生茶树资源为考察对象，于2011 年4月10号取样，总共采集600个样品。取样方法是，每一株野生茶树 取一个样品，剪切离地面最远的芽头上第一片展开叶，无破损地装入 2mL塑料离心管，盖好 盖子，标记样品来源。取样完毕，将所采集样品带回实验室。准确称 重后，于液氮中冷冻处理60s，取出离心管，打开盖子，迅速用玻璃棒 将叶片捣碎，向离心管中加入1.5 mL甲醇（分析纯），盖紧离心管盖 子，涡旋30s，70℃孵育5min，再涡旋2min，冷却至室温，14000rpm/ min高速离心2min，取上清液，利用高效液相色谱分析儿茶素、茶氨酸 和咖啡碱的含量（分析条件如前），以根据茶叶内含成分确定优异茶 树种质资源。结果表明，600株野生茶树中，茶氨酸含量大于0.75%（ 湿重）的有3株，EGCG含量大于3%（湿重）的有3株。根据高通量检测 结果，初步确定上述6株为特异资源。根据国标方法（GB/T 8313-20 08），复筛结果表明：茶氨酸含量大于4%（干重）的有1株，EGCG含量 大于17%的有1株。筛选到的2株茶树被认为新的特异种质。

实施例3：

以湖南省邵阳市洞口县高沙镇野生茶树资源资源为考察对象，于2012 年4月18号取样，总共采集500个样品。取样方法是，每一株野生茶树 取一个样品，剪切离地面最远的芽头上第一片展开叶，无破损地装入 2mL塑料离心管，盖好盖子，标记样品来源。取样完毕，将所采集样品 带回实验室。准确称重后，于液氮中冷冻处理45s，取出离心管，打开 盖子，迅速用玻璃棒将叶片捣碎，向离心管中加入1.5 mL 分析纯甲 醇，盖紧离心管盖子，涡旋30s，65℃孵育8 min，再涡旋90s，冷却 至室温，13000rpm/min高速离心3min，取上清液，利用高效液相色谱 分析儿茶素、茶氨酸和咖啡碱的含量（分析条件见前述），根据茶叶 内含成分确定优异茶树种质资源。结果表明，500株野生茶树中，咖啡 因含量小于0.2%（湿重）的有3株。根据高通量检测结果，初步确定上 述3株为特异资源。根据国标方法（GB/T 8313-2008），复筛结果表 明：咖啡因含量小于1%（干重）的有1株，这株茶树被认为新的特异种 质，通过无性扩繁可获得新的茶树优良品种，适用于制作低咖啡因茶 或提制低咖啡因茶叶提取物。