一种高效表达乳酸脱氢酶C4的工程菌及其表达方法

摘要

本发明公开了SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，以及包含该核苷酸序列的重组载体和重组菌；本发明还公开了用该重组菌表达乳酸脱氢酶C4的方法，以及该方法制得的乳酸脱氢酶C4。本发明重组乳酸脱氢酶C4活性高，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组乳酸脱氢酶C4的工程菌及其表达方法。

背景技术

乳酸脱氢酶（LDH），是糖酵解途径中的一个酶，利用NADH为辅酶，催化丙酮酸和乳酸之间的转化。在哺乳动物中，LDH有3个编码基因，分别为LDH-A、LDH-B、LDH-C，编码A、B、C三个亚基（E.Goldberg,Reproductiveimplications of LDH-C4and other testis-specific isozymes,Exp.Clin.Immunogenet.2(1985)120-124.），对应的四聚体纯合酶为乳酸脱氢酶M4（LDH-M4）、乳酸脱氢酶H4（LDH-H4）和乳酸脱氢酶C4（LDH-C4），其中LDH-M4主要存在于骨骼肌中，LDH-H4主要存在于心肌，而LDH-C4只出现在成熟睾丸和精子中，这三种四聚体纯合酶在生化性质上也有较大的区别（C.L.Markert,J.B.Shaklee,G.S.Whitt,Evolution of agene.Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure,function andregulation,Science189(1975)102-114.），LDH-C4相对于LDH-M4和LDH-H4在溶液中具有更好的热稳定性，其还能催化一些碳链较短的a-酮酸和a-羟酸之间的转化，因而可以用于化工领域生产高纯度L-乳酸和一些a-羟酸（L.Schatz,H.L.Segal,Reduction of alpha-ketoglutarate by homogeneous lactic dehydrogenase X of testicular tissue.J Biol Chem.1969,244:4393-7.）。

LDHC4广泛应用于临床诊断（用于检测转氨酶的活性）和化工生产，如果从天然动物组织中分离纯化LDHC4，会受到来源的限制，分离纯化的成本也较高，用基因工程的方法制备是一种很好的解决办法。

国内有通过基因工程的方法来表达LDH-C基因的文献，但表达出的C亚基不能形成四聚体，不能得到LDH-C4，故没有活性或者活性不高。国外也有通过大肠杆菌表达人LDH-C基因来获得LDH-C4的报道，但是表达活性较低，粗酶的酶活最高仅为0.5U/mg，纯化后酶的酶活最高仅为106U/mg（K.M.LeVan,E.Goldberg,Properties of human testis-specific lactate dehydrogenase expressed fromEscherichia coli.Biochem J.1991,273:587-92.）。

发明内容

为了给临床诊断、化工生产提供酶活高的LDH-C4，本发明提供了一种通过基因工程的手段重组表达LDH-C4的方法，为了实现重组表达，提供了一种新的核苷酸序列，以及含有该序列的重组载体和重组菌。

本发明提供的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明重组载体包括SEQ ID NO.1或所示的核苷酸序列。优选地，所述重组载体是pET32a重组载体。

本发明重组菌，它包括前述的重组载体。优选地，所述重组菌为重组大肠杆菌。

本发明制备重组蛋白的方法，它包括如下步骤：

（1）取前述的重组菌，在大肠杆菌培养基中培养，诱导表达，得菌液，离心，得菌体；

（2）取步骤（1）所得菌体，裂解，离心，取上清，分离纯化，即得。

步骤（1）所述培养基为含有氨苄霉素的LB液体培养基中振摇培养，培养温度为37℃，诱导表达使用的诱导剂为IPTG，诱导温度为25℃，诱导时间为10h。

其中，步骤（2）所述分离纯化采用蓝胶亲和柱层析与离子交换层析。

本发明从鼠兔睾丸中LDH-C编码基因出发，用基因工程的方法制备得到了重组乳酸脱氢酶C4（LDH-C4），其粗酶酶活高达35U/mg，纯化后的酶活高达478U/mg，是现有重组乳酸脱氢酶C4纯品酶活的4.5倍，热稳定性和酸碱稳定性强，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1重组载体测序图谱。

图2重组菌的PCR检测结果，其中，M泳道为marker DL2000泳道1和2为PCR产物。

图3重组菌的酶切结果，其中，M1为marker DL2000，M2为markerΛHindⅢ片段，1和2泳道为重组子的酶切验证。

图4聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，其中，A为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后（native PAGE），进行乳酸脱氢酶活性染色，从图中可以看出重组菌表达出了大量的可溶的有活性的LDH,泳道1，转化了空载pET32a的大肠杆菌的粗提液；泳道2，转化了pET32a-pika-LDH-C的大肠杆菌的粗提液。B,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，进行考马斯亮蓝染色，泳道1,转化了pET32a-pika-LDH-C的大肠杆菌的粗提液，泳道2，热处理后的上清，泳道3,亲和层析的洗脱液，泳道4，离子交换后的穿透液，泳道M,蛋白分子量标准。

图5本发明重组LDH-C4的热激活结果，插入的小图为阿利纽斯图(Arrhenius plot)，测定缓冲液为100mM磷酸钠，pH7.4，蛋白浓度为10.2ug/mL。

图6本发明重组LDH-C4的热稳定性检测，先将酶溶液在不同温度下温浴，在不同时间点取出，离心后在25°C测定残余活性，测定缓冲液为100mM磷酸钠，pH7.4，蛋白浓度为10.2ug/mL，图中的符号◇,▲,×,◆,+,-,Δ,依次表示39.9°C,51.1°C,60.1°C,61.1°C,63.7°C,65.1°C,70°C。

图7最适pH检测结果。

具体实施方式

实验材料：

保存液购自济南泰天和生物科技有限公司。反转录试剂盒、TA克隆试剂盒、3’RACE试剂盒，测序引物BcaBESTYM Sequencing Primer RV-M和BcaBESrITI1M Sequencing Primer M13-47购自宝生物工程(大连)有限公司。Trizol试剂购自Invitrogen公司。克隆宿主菌为E.coli BL21，蛋白表达宿主菌为E.coli BL21(DE3)，表达载体pET32a购自Novagen,Merck，蓝胶（Blue sepharose）购自GE healthcare(Shanghai,China).离子交换柱填料（DEAE sepharose）购自SIGMA U.S.A.4%-15%梯度预制胶购自Bio-radU.S.A.

实施例1本发明重组LDH的制备

一、重组基因工程菌的构建

1、目标基因片段的制备

（1）样品采集

在四川省阿坝县与青海省交界处的高寒草原地区(位于青海省久治县境内，海拔4015m)捕捉黑唇鼠兔，立即进行解剖，取其睾丸组织放置于样品保存液里，带回成都进行RNA提取；

（2）鼠兔LDH-C基因ORF的克隆

取鼠兔睾丸组织0．5g，按照Trizol试剂说明书提取总RNA。参照反转录试剂盒说明书进行cDNA合成。黑唇鼠兔属于兔形目，鼠兔属，在GenBank数据库里没有兔形目物种LDH-C基因的相关序列,故采用设计简并引物的方法进行克隆，正向引物刚好包含起始密码子，这样方便我们克隆全长ORF,设计的三条简并引物序列如下：D-Ps:5-atgtcmacygtcaaggagcagct-3;D-Pa1:5-gcagayacabtgtaatcttttcc-3;D-Pa2:5-ttacarccacttccratyac-3用反转录生成的cDNA作为模板，采用槽式PCR法克隆LDH-C基因的EST，第一轮PCR采用D-Ps和D-Pa2扩增，第一轮PCR的产物取0.5ul作为第二轮PCR的模板，所用引物为D-Ps和D-Pa1。PCR产物电泳显示一条260bp的条带，克隆后送出测序，经BLASTX分析，显示我们得到了鼠兔LDH-C基因的EST。克隆得到LDH-C的EST后，我们根据EST序列设计了2条基因特异引物，然后采用3’RACE技术克隆LDH-C基因的3’端，两条基因特异引物为：Pika-Ps1:5-cttgcccttgttgatgttgcaga-3;Pika-Ps2:5-ggatcttcaacatggcagtct-3。第一轮PCR采用Pika-Ps1和3’RACE Outer Primer，第一轮PCR的产物取出0.5ul作为第二轮PCR的模板，所用引物为Pika-Ps2和3’RACE Inner Primer。第二轮PCR的产物经电泳，胶回收，克隆至pMD18-T,送出测序，测序在上海Invitrogen公司完成。EST序列和RACE序列通过VectorNTI软件进行拼接，全长ORF通过引物ORF-Ps(5-ATGTCCACTGTCAAGGAGCAG-3)和ORF-Pa(5-TTAAAACACCAGGTCCTTCT-3)扩增得到，该基因的核酸序列已录入Genbank数据库（登录号：GU076486）。

（3）鼠兔LDH-C基因序列的优化

为了在E.coli中表达天然有活性的LDH-C4蛋白，鼠兔LDH-C基因ORF根据E.coli的密码使用偏好性进行了全面优化，优化后得ORF基因片段，序列如SEQ ID NO.1所示：

CATATGTCTACTGTGAAAGAACAGCTGATTGAAAACCTGATCGCGGAAGACAAAGCGTCTCAGTGCAAAATCACTATCGTTGGTACCGGTTCTGTTGGTATGGCGTGCGCGATCTGCATTCTGCTGAAAGATCTGGCGGATGAACTGGCGCTGGTGGACGTGGCAGAAGATAAGCTGAAAGGTGAAACCATGGACCTGCAGCACGGTAGCCTGTTTTTCTCTACCTCTAAGATCACTAGCGGCAAAGATTACACTGTGTCTGCAAACAGCAAACTGGTTATTGTGACCGCGGGTGCGCGTCAGCAGGAAGGTGAGGGTCGTCTGGCACTGGTGCAGCGTAACGTGACCATTATGAAAAGCATCATCCCGACCATTGTGCGTCATAGCCCGGATTGCAAGATGCTGATCGTGAGCAACCCGGTTGATATCCTGACCTATGTTGTGTGGAAAATTTCTGGTCTGCCGGCGTCTCGTGTTATCGGTTCAGGCTGCAACCTGGATTCTGCGCGTTTCCGCTACCTGATTGGTGAAAAACTGGGCGTTCACCCGACTTCTTGCCATGGTTGGATCATCGGTGAACACGGTGACAGCTCTGTTCCGCTGTGGTCTGGTGTGAACGTTGCAGGCGTGGCCCTGAAATCACTGCATCCGAAACTGGGTACCGATAGCGATAAAGAACAGTGGAAGGTGATCCACAAACAGGTTGTTGAAAGCGCGTATGAAATTATCAAACTGAAAGGTTACACCTCTTGGGCGATTGGTCTGTCTGTTACTGATCTGGCAGGCTCAATCCTGAAGAACCTGCGTCGTGTGCATCCGGTTAGCACTATGGTTAAAGGCCTGTATGGCATCAAAGAAGAGATCTTCCTGTCTATCCCGTGTATCCTGGGTCGTAACGGTGTTAGCGACATCGTGAAAGTTGCTCTGTCTCCGGAAGAGGAAGAACTGTTCAAAAAGTCTGCGAGCACTCTGTGGAACATCCAGAAAGATCTGGTTTTCTAACTCGAG

合成得到上述序列。

2、构建重组表达载体

用Nde I和Xho1分别将ORF基因片段和表达载体pET32a酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。将回收的ORF基因片段和酶切后的载体片段进行连接并克隆，通过PCR和酶切对重组表达载体进行筛选，对阳性表达载体进行测序以验证ORF的正确性。

测序结果如图1所示，说明构建的重组pET32a载体含有SEQ ID NO.1所示目标基因片段。

3、工程菌的制备

制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将重组pET32a-pika-LDH-C载体通过CaCl₂法转入细胞，将细胞转入LB液体培养基中37℃培养40min，然后将菌液涂布已倒好的LB选择培养基平板（即加了100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基），37℃过夜培养。挑取单菌落，进行PCR和酶切验证。

实验结果如图2~3所示，挑取的单菌落中含有1008bp的基因片段，说明本发明得到了含有目标片段的工程菌。

二、本发明重组LDH-C4的制备

（一）制备方法

1、大肠杆菌阳性转化子的诱导培养

将阳性表达载体克隆接种到2mL含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基，于37℃培养，待吸光值A₆₀₀为1.0时，离心去掉培养基，将细菌沉淀重悬到50mL LB培养基里(含100ug/ml的氨苄青霉素)，待吸光值A₆₀₀为1.0时，离心去掉培养基，将细菌沉淀重悬到300mL LB培养基里(含100ug/ml的氨苄青霉素)，继续培养到A₆₀₀为0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L进行诱导表达，于25℃振荡培养10h后，离心收集菌体，将细菌重悬于20mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)，使用超声波破碎后，于14000g离心，得上清。

2、重组LDH-C4纯化

粗酶：诱导表达的大肠杆菌离心收集菌体，重悬于20mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)，超声破碎(36x5s pulses with5s interval)，超声裂解液14000g离心10min，上清为粗酶进行native-PAGE和SDS-PAGE检测（乳酸脱氢酶活性染色方法：染液组分为乳酸钠,NAD⁺,吩嗪N-甲硫酸盐和硝基蓝四氮唑，只有乳酸脱氢酶才能利用底物乳酸钠和NAD，从而显色）。

蓝胶亲和柱层析：粗酶50°C加热10min，14000g离心10min，上清用0.45μm尼龙膜过滤,蓝胶层析柱(10×1.0cm)先用binding buffer(20mmol/L磷酸钠缓冲液pH7.0)进行平衡.将尼龙膜的过滤液全部上柱，柱子用3倍体积的binding buffer进行洗涤后，再用100mL洗脱缓冲液(50mgNAD⁺，77mg丙酮酸钠，20mM磷酸钠缓冲液,pH7.0)。洗脱峰10ml每管进行收集，通过native page（乳酸脱氢酶活性染色方法）进行酶活性鉴定。

DEAE离子交换柱层析：DEAE离子交换柱(10×1.0cm)先用上述bindingbuffer进行平衡，亲和层析后有活性的部分混合后全部上柱，用binding buffer进行洗涤，直接收集穿透峰，通过native PAGE（乳酸脱氢酶活性染色方法）进行酶活性鉴定。

（二）检测方法

1、本发明重组LDH-C4分子量测定

取步骤（一）制备得到的重组LDH-C4纯品，通过SDS-PAGE电泳检测亚基的分子量，通过毛细管电泳准确检测其亚基的分子量，通过质谱分析，测定非变性条件下的分子量。

2、酶活力的分析：

酶活性单位定义：25°C条件下,每分钟转化1μmol NAD⁺所需的酶量定义为1个酶活单位。

正向酶活性测定体系包括：100mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)，0.15mMNADH,1.0mM丙酮酸钠和一定量酶液（酶的用量为每分钟ΔE₃₄₀在0.060-0.070之间），测定时间为3min。

反向酶活性测定体系包括：100mM glycine-NaOH缓冲液(pH10.28),1.0mM NAD⁺,100mM乳酸钠和一定量酶液（酶的用量为每分钟ΔE₃₄₀为0.040-0.050），测定时间为3min。

取步骤（一）制备得到的粗品、热处理后样品、亲和层析的洗脱液以及离子交换层析后的流穿液按照该方法进行酶活测定。

3、酶的热激活分析：取步骤（一）制备得到的重组LDH-C4纯品，在10℃-70℃温度条件下，每隔5°C设一个测定点，按照上述的正向酶活性测定方法进行活力测定。

4、酶的热稳定性分析：取步骤（一）制备得到的重组LDH-C4纯品，分别在39.9℃,51.1℃,60.1℃,61.1℃,63.7℃,65.1℃,70℃温度下进行0~50min不同时间的热处理，再14000g离心10min，然后按照上述的正向酶活性测定方法对热处理后酶的残留活力进行测定。

5、最适pH检测

取步骤（一）制备得到的重组LDH-C4纯品，甘氨酸-盐酸(Glycine-HCl)或甘氨酸-氢氧化钠(glycine-NaOH)分别是正向反应和反向反应的测定缓冲液，对正向反应，所用缓冲液的pH为4.21,5.35,6.22,7.0,7.48,8.48,9.45,10.13,and11.24,酶浓度为10.2ug/mL;对反向反应，所用缓冲液的pH为6.63,7.5,8.06,8.67,9.17,9.76,10.11,10.28,11.2,and12.46,酶浓度为51ug/mL，进行酶活测定。

（三）检测结果

（1）乳酸脱氢酶活性染色结果如图4所示，转化了空载pET32a质粒的大肠杆菌的粗提液中无乳酸脱氢酶，本发明粗提液、热处理后的上清、亲和层析的洗脱液、离子交换后的穿透液中均含有乳酸脱氢酶，其中，离子交换后的穿透液为乳酸脱氢酶纯品。

（2）分子量

SDS-PAGE检测结果显示其亚基的分子约35KD，毛细管电泳显示其亚基的分子量为36kD，经质谱分析，发现非变性条件下重组蛋白的相对分子量为144kD，说明重组蛋白为四聚体，即LDH-C4。

（3）酶活

如表1所示，本发明重组LDH-C4的酶活如表1所示：

表1鼠兔LDH-C4的纯化表

由表1可以看出，本发明粗提液的比活力为35U/mg，是现有技术制备的重组LDH-C4粗酶活力的70倍，纯品酶的比活力为478U/mg，是现有技术制备的纯品重组LDH-C4酶活力的4.5倍。

实验说明，本发明方法制备得到的重组LDH-C4显著优于其他方法制备得到的重组LDH-C4。

（4）酶的热激活分析结果

如图5所示，在10℃到60℃之间，酶活性（反应速度）随温度的上升而增加，催化活性表现为热依赖型。

（5）热稳定性

如图6所示，本发明重组LDH-C4的最高耐受温度为60.1℃，稳定性强，可以满足工业应用的需要。

（6）最适pH检测

如图7所示，在pH6.22~9.45范围内，正向酶活性较高，其最适pH为7.48；在9.76~11.2范围内，反向酶活性较高，最适pH为10.28。

实验结果说明，本发明表达得到了重组LDH-C4，其酶活高，热稳定性和酸碱稳定性强。

综上，本发明构建了表达重组乳酸脱氢酶C4的基因片段、重组质粒、工程菌，表达得到了重组乳酸脱氢酶C4，其酶活非常高，是现有重组乳酸脱氢酶C4的4.5倍，热稳定性和酸碱稳定性强，特别是在偏碱性条件下具有较高活性，对临床诊断非常有利，可广泛应用于临床检测。本发明制备重组乳酸脱氢酶C4的方法操作简便、发酵周期短、表达水平高、成本低廉，可方便地用于工业生产。