一种含羟基酪醇的橄榄叶提取物微乳的制备方法

摘要

本发明公开了一种富含羟基酪醇的橄榄叶提取物微乳制备方法及其应用，所述制备方法包括步骤：从油橄榄叶提取到富含羟基酪醇的橄榄叶提取物；提取物经过适当的微乳化处理，提高稳定性，扩大适应面。本发明的突出优点在于制备富含羟基酪醇的橄榄叶提取物微乳产品。在医药、食品领域有着广泛的应用。诸如可以添加到食用油脂中，防止油脂的腐败。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其是涉及一种富含羟基酪醇的橄榄叶提取物微乳制备及其应用。

背景技术

如何有效地防止油脂氧化、变质，是一个世界性的难题。油脂受氧气、水、光、热、微生物等因素的作用，会逐渐氧化或水解而变质酸败。其中性脂肪会分解为甘油和脂肪酸，或脂肪酸中的不饱和链断开形成过氧化物，再依次分解为低级脂肪酸、醛类、酮类等物质，从而产生异臭、异味。油脂的酸败变质，不但影响其风味、品质和营养价值，还会导致细胞膜、组织、酶和基因的受损，危害人体健康。在我国每年都有多起因误食了酸败的油脂或含油脂食品发生急性食物中毒的事件。人们食用变质的食用油脂，极易发生疾病，加速衰老，更重要的是，有的酸败产物还具有致癌作用。

在油脂中添加抗氧化剂，对于保证油脂及含油脂食品的质量，延长储存期具有非常重要的意义。目前，应用在油脂中的抗氧化物质主要是一些合成来源的抗氧化剂，如叔丁基对苯二酚(TBHQ)、二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)等。这些物质性质稳定、成本低廉，但是具有毒副作用，甚至有潜在的积累致癌作用。随着社会经济的急速发展，人们健康意识的不断提高，合成的抗氧化剂的安全性越来越引起人们的质疑。部分发达国家早已限量或禁用对人体有毒副作用的人工合成抗氧化剂，如北欧已禁止使用BHA、BHT。研发高效、无毒的天然来源抗氧化剂已经成为的行业研究焦点。

   现有的研究表明，多个天然产物活性物质添加在油脂类物质中具有良好的抗氧化特性，如迷迭香精油、山捻子多酚等。但是绝大多数的天然成分物质组分本身也易受外界因素，如光、热等的影响，影响其稳定的使用。另外，在水/油介质中溶解性也不理想，制约了其的广泛应用。因此引入微乳（微胶囊）化等先进技术将活性组份进行有效包埋，提高生活活性，提高与其它基质的相容性，从而扩大其应用范围。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是一种含羟基酪醇的橄榄叶提取物微乳的制备方法，包括以下几个步骤：

步骤A：采用加热循环提取。将油橄榄干叶与水、乙醇按质量比9︰1-1︰9的比例投料，温度控制在60-90℃，提取时间2个小时；

步骤B: 采用醇提水沉的方法预处理。提取液回收溶剂后，水沉，压滤，合并滤液；

步骤C：采用大孔树脂分离纯化方法纯化，滤过液经大孔树脂吸附，大孔树脂采用D101型，安徽三星树脂科技有限公司生产，平均孔径9-10 nm，用质量比为9︰1-1︰9的乙醇/水混合溶剂解吸附，收集解吸液；

步骤D：酸解/水解上述解吸液，得到含羟基酪醇的橄榄叶提取物。

优选的微乳制备方法，包括以下几个步骤：

将羟基酪醇橄榄叶提取物溶解在水中，添加极少量的表面活性剂后均质成悬浮液得到羟基酪醇乳液，压力3000Psi，均质时间5分钟。再通过高度剪切微射流的工艺处理，机器型号M-110S（美国Microfluidics International Corporation制造），压力设定为20000Psi，循环时间5-8分钟，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌。还可将纳米乳冷冻干燥或喷雾干燥成微囊粉末。

其中，羟基酪醇（hydroxytyrosol，以下简称HT）化学名为3,4-二羟基苯乙醇，是一种来源于油橄榄植物的天然多酚类化合物。分子式为C₈H₁₀O₃，分子量154.1632，闪点15°C。粉末易吸湿。国内外研究者已经证实，羟基酪醇是一种安全有效的抗氧化生物活性物质。橄榄油系列产品良好的抗氧化生物活性、抗肿瘤活性、抗衰老活性等主要来源于以本化合物为主的系列多酚。

结构式为：

目前羟基酪醇主要的应用有：1.能有效增强皮肤弹性和润泽，具除皱、抗衰老之功效； 2.有助于人体对矿物质的吸收，保持骨密度，减少骨骼疏松；3.对人体视力的保护作用，防治因吸烟导致的多种视网膜退化等病变；4.改善血管弹性，用于动脉硬化、高血压等的预防与治疗； 5.可以促进肺癌、乳腺癌等癌症后期恢复和提高化疗效果；6.还可作为天然的抗菌、抗病毒和杀真菌产品用于农业和虫害控制用途。

目前国内羟基酪醇的来源主要是油橄榄叶中提取得到，再精制而成。油橄榄 (O1eaeuropaea L.)是木犀科木犀榄属的常绿乔木，世界著名的木本油料树种之一。至今已有4000多年的栽培历史，主要分布在北纬45°到南纬37°之间，中心分布区是地中海沿岸国家，如希腊、意大利、西班牙等。现在全球均有广泛引种栽培。近十年来，在西部开发的政策支持下，国内的油橄榄的种植产业发展较快，甘肃、四川两省的基地建设己有一定规模，并配套建立起橄榄油加工厂。仅在以甘肃省陇南武都区为中心的嘉陵江上游白龙江低山河谷区，种植面积就达18万公顷。油橄榄果实得到充分利用。但每年因修剪而废弃的油橄榄叶在数千吨以上，没有得到很好利用。因此，羟基酪醇的原料获取有保障。

优选的，所述表面活性剂采用卵磷脂、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇硬脂酸酯15、吐温80、阿拉伯胶、明胶和变性淀粉中的至少一种。

优选的，所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。

本发明还提供了一种富含羟基酪醇的橄榄叶提取物微乳的制备方法，包括以下几个步骤：将HT 橄榄叶提取物溶解在水中，添加极少量的表面活性剂后均质成悬浮液得到HT 乳液，再将HT 乳液通过微射流工艺，制成纳米乳，再将纳米乳喷雾干燥成微囊粉末，留存备用。

优选的，均质时间为5分钟，温度为25℃。

优选的，悬浮液的直径不小于6μm。

优选的，纳米乳的直径为100-200nm。

优选的，所述乳液通过微射流工艺，压力为20000-24000Psi。

本发明的有益效果是：本发明所制备的富含羟基酪醇的橄榄叶提取物微乳，在水性及油性溶液中均易溶，应用范围广。添加到日常食用油中，抗氧化性能强，可替代现有的合成类抗氧化剂。制成外用搽剂，可增强皮肤的通透性。并且经实验，添加到香烟烟嘴中，可有效减少或完全抵消香烟中焦油、烟碱等多种有害成分对人体的视力、肺部器官等的伤害。

具体实施方式

下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：

实施例1：   HT橄榄提取物的在常见介质中溶解性的考察

在室温下，考察质量分数为40%的HT橄榄叶提取物在大豆色拉油、花生油、猪油等油品中的溶解情况，结果见表1：

表1 质量分数为40%的HT橄榄叶提取物在不同极性溶剂中的溶解情况

说明：“-”表示不溶，“+”表示可溶，“++”表示易溶。

结果表明：HT橄榄叶提取物原料应用在常用食用油品中的溶解性较好，外观性状的稳定性可以达到要求。

实施例2：HT橄榄叶提取物作为油脂生产中的添加剂

    油脂的生产一般经过投料、水化、脱胶、脱杂、干燥、脱色、过滤、脱臭、脱蜡等过程，最终形成产品。

在脱色工艺前将质量分数为20%的HT橄榄叶提取物，以0.3‰的质量分数添加到油脂中。经吸附脱色的脱色工艺后，其中脱色工艺中，主要吸附剂的质量分数配比：活性白土︰活性碳为12︰1，总的添加量为总油量的1%。脱色温度110℃，时间20分钟。采用硅藻土助滤，油脂清亮通透。外观、气味等指标均符合国家标准，保存期明显延长。

制备富含HT的橄榄叶提取物（质量分数20%以上），以质量分数0.1‰的量在油脂生产工艺中添加，经上述的吸附脱色工艺后，油脂的外观等质量指标可达到国家标准。添加了抗氧化活性的HT，可明显延长油脂的质保期限，替代原有的化学合成类抗氧化剂。

表2  添加了不同抗氧化成分的油脂物理形态观察     （月）

实施例3：HT微乳的制备

   将质量分数为40%含量的HT橄榄叶提取物20克中加入到1L的纯水中，加入0.5克的表面活性物质阿拉伯胶，搅拌。然后在压力3000Psi的条件下，均质5分钟。再通过高度剪切微射流的工艺处理，机器型号M-110S，压力设定为20000Psi，制备出直径为小于200nm的极小颗粒HT微乳液。 

实施例4：HT橄榄叶提取物微乳粉直接添加成品油脂中

上述实例3的HT微乳液经喷雾干燥，出风口温度185℃,流速80ml/h，得到极细干粉，以0.05‰的质量分数比直接添加到食用油中。油液清亮透彻，无浑浊及悬浮物出现。成品油的保存期明显延长。

实施例5：HT橄榄叶提取物微乳粉直接添加日化基质中

将10g的质量分数为40%的HT 橄榄叶提取物溶解在1 L的水中,添加0.25g 的吐温80。混合物在25℃下均质5分钟，均质成悬液（直径大于6μm)。HT 乳液通过微射流工艺，压力为24000Psi。循环时间5分钟，制成纳米乳（直径100-200nm）。将纳米乳冷冻干燥成微囊粉末，留存备用。或用低变应原的乳脂调配成所需比例添加到所用基质中。

实施例6：HT橄榄叶提取物微乳粉在常见油脂中抗氧化性能的测定

采用Schaal烘箱法：取50g油样，放入100ml烧杯中，敞口，按如表3所示的比例加入不同浓度的实施例4的HT粉末微囊及对照品迷迭香油品抗氧化剂，混合均匀，将油样放入60℃恒温烘箱中强化保存。每隔24h搅拌一次，并交换它们在烘箱中的位置。按GB/T 5009.37-2003《食用植物油卫生标准的分析方法》对油脂过氧化值（peroxide value,POV）进行测定。通过保护系数（protection factor, PF）来评定HT微囊的抗氧化活性。按食用油卫生标准规定，油脂中POV值达到11.8mmol/kg时所需的时间为诱导时间，即活性氧法（active oxygen method,AOM）值。计算保护系数PF（PF = 添加HT的AOM÷未添加HT的AOM值）。

表3 不同添加量HT对猪油的抗氧化作用

实施例7：HT微乳液小鼠皮肤外搽试验

将实例5添加了乳脂的HT微乳为试验样品，进行实验动物皮肤通透性试验。采用健康日本大耳兔6只。随机分为3个组，分别为空白对照组，HT提取物组（添加了同样的乳脂调配），HT提取物微乳组。将试验兔背部裸露相同的区域，相等的面积（4×4cm）。分别涂搽上述药物1g（质量浓度为40%HT橄榄提取物），每天两次。连续3天。在第二次给药后的半小时，耳静脉取血2ml，按常规方法分离血清。采用HPLC的方法测定血清中HT的含量。结果如表4所示：

表4 HT橄榄叶提取物组与HT橄榄叶提取物组微乳组皮肤通透性的比较

实施例8：添加到香烟烟嘴的应用

丙烯醛是香烟烟雾中主要的有害成分。丙烯醛直接导致视网膜色素上皮细胞线粒体的氧化损伤和功能衰弱，并降低细胞修复损伤的能力，是吸烟烟雾损害视力的主要因素。丙烯醛还能导致身体多个组织如肺部/气管细胞的基因突变，并最终导致癌症的发生。

HT是一种公认的抗线粒体损伤的天然营养素。将实例3的HT橄榄叶提取物纳米微乳按10%的质量浓度配成水溶液。浸渍到香烟过滤嘴。将浸渍湿微胶囊后的烟嘴置于超低温冰箱中，再置于真空冷冻干燥机中干燥。形成的微胶囊壁膜致密且释放性能优良的HT微胶囊。

香烟燃烧时，HT微胶囊受热，同步释放出HT烟雾，从人体的口腔、眼部等暴露处吸收，可有效减少或抵消香烟中焦油、烟碱等多种有害成分对人体的视力、肺部器官等的伤害。

我们通过体外试验研究，考察了HT对于丙烯醛对于人ARPE-19培养细胞系（眼睛）损伤保护的功能。

1）      样品的配制：

丙烯醛和质量分数为20%的HT橄榄叶提取物分别溶于PBS中,HT配成储备液，保存在4℃冰箱中，丙烯醛于每次实验使用前配制。

2）  细胞培养及分组：

人类ARPE-19细胞系，分按0.05×10⁶，0.1×10⁶，0.5×10⁶的细胞密度种植于100mm²培养皿中、96孔和6孔细胞培养液（DMEM-F12,购自Sigma公司）中。置37℃，5%CO₂培养箱内。在培养过程中，每3-4天更换培养液一次，倒置显微镜下观察，选生长状况良好并贴满培养瓶或培养板底部80%左右的细胞，施加以下的处理因素。实验组：将不同浓度的丙烯醛（0、5、10、25、50、100μmol/L）分别加入ARPE-19细胞培养液中培养24小时。干预组：将不同浓度的HT橄榄叶提取物（以HT纯品计，0、10、20、50、100、200μmol/L）预先加入到ARPE-19细胞培养液中培养48小时，再换成含丙烯醛（50 μmol/L）的培养液培养24小时。以上试验每个浓度组均设3个平行样，每个试验重复3次。

3）测定方法：

①细胞存活率测定：96孔培养板每孔加入20μl（5mg/ml）MTT（四氮唑盐）溶液，培养3小时后，弃去培养液，加入100μl的DMSO，37℃下放置10min，混匀555nm下测量OD值。

②细胞线粒膜电位测定：96孔培养板每孔加入100μ UC-1（MolecularProbes公司提供，浓度为2μg/ml） 继续培养30min，然后用稀释的细胞培养液冲洗二次，再每孔加入100μl细胞培养液，用多孔荧光计数仪分别在485 nm激发光和535nm、590nm发射光下测定红、绿荧光强度，以红/绿荧光比值代表细胞线粒体膜电位。

4）结果及讨论：

表5 不同浓度的丙烯醛对人ARPE-19培养细胞生存率的影响

表6 不同浓度的丙烯醛对人ARPE-19培养细胞线粒体膜电位的影响

结果说明：不同浓度的丙烯醛分别与ARPE-19细胞作用24小时后，通过上述测定结果显示：与对照组比较，50 μM和100 μM丙烯醛产生了细胞毒作用，使细胞存活率分别下降到54.3%，22.2%。使线粒体膜电位比值分别下降到3.80，2.76。

 

表7 不同浓度的HT对于丙烯醛降低人ARPE-19培养细胞生存率的保护作用

注：与表5第5项比较，p<0.05,** p<0.01;

表8 不同浓度的HT对于丙烯醛降低人ARPE-19培养细胞线粒体膜电位的保护作用

注：与表6第5项比较,** p<0.01;

结果说明：含不同浓度HT橄榄叶提取物的培养液预先与ARPE-19细胞作用48小时后，再与含50μM丙烯醛的培养液共同培育24小时。我们的试验研究结果显示：0-50μM的HT对于ARPE-19细胞降低的细胞存活率和线粒体膜电位没有明显影响。但100-200μM的HT对于50μM 丙烯醛降低的细胞ARPE-19细胞的存活率和线粒体膜电位下降有显著的改善作用（p<0.05-0.01），提示具有保护作用。

结果讨论：一般认为，丙烯醛造成人ARPE-19细胞的死亡主要是通过对细胞线粒体损伤进行的。本研究试验结果证实，HT橄榄叶提取物能对此类损伤具有较好的保护作用，主要机理可能与其良好的抗氧化性能有关。提示HT橄榄叶提取物对于人吸烟烟雾中主要的有毒成分——丙烯醛导致的视力损伤、细胞变异具有保护作用。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。