一种检测克罗诺杆菌属菌株的方法及其试剂盒和引物

摘要

本发明公开了一种检测克罗诺杆菌属菌株的方法及其检测试剂盒。该方法包括以下步骤：（1）提取待检样品的基因组DNA，以其为模板，以克罗诺杆菌属特异性扩增引物对为引物，进行PCR扩增，所述的引物对中，一条引物的序列为SEQ ID NO.1所示，另一条引物的序列为SEQ ID NO.2所示；和（2）检测438bp位置单一扩增产物的存在。本发明的方法，检测克罗诺杆菌属菌株时间短，降低了检测成本，提高了检测效率，具有单一特异性，检测结果可靠，结果判定简单。本发明为食品安全检测技术领域提供了一种简单快速灵敏的检测克罗诺杆菌属细菌的方法，对我国的食品安全具有较大意义。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种检测克罗诺杆菌属菌株的方 法及其试剂盒和引物。

背景技术

克罗诺杆菌属(Cronobacter spp)是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性 无芽孢杆菌。作为一种重要的食源性条件致病菌，克罗诺杆菌属菌株能够引 起婴儿致命的感染，致死率高达10%-80%。它通常能导致婴儿严重的临床症 状，例如脑脓疡，脑膜炎，坏死性小肠结肠炎和全身性败血症。曾经有在婴 儿配方粉中分离到阪崎克罗诺杆菌菌株的报道。克罗诺杆菌属菌株是通过配 方粉危害婴幼儿健康的重要条件性致病菌。新生婴儿或早产儿都存在通过食 用污染有克罗诺杆菌属的婴儿配方粉而感染克罗诺杆菌属菌株的风险。在污 染环节调查中发现,整个婴幼儿配方粉生产工艺流程中,可检测到克罗诺杆 菌的污染点占到全部取样点的31%。因此，对克罗诺杆菌属菌株快速鉴定与 鉴别是实现有效控制的基础。该菌在1980年被首次命名和定义后,又于 2008年由一个种被重新分为克罗诺杆菌新属(Cronobacter spp.),属下分为5 个新种(其中Cronobacter sakazakii称为新组合)、1个克罗诺杆菌基因种 (Genomospeciese)和3个新亚种,尽管该菌的分类和名称已变,但目前检测 仍然沿用程序式的阪崎肠杆菌标准检测方法,以传统生化反应进行鉴定,需 要18-24h，而且无法区分为哪一种,这显然已经不能满足对克罗诺杆菌属 菌株检测的需求。在鉴别方面,尽管已有扩增片段长度多态性分析(Amplified  fragment length polymorphismas,AFLP)、16S rRNA全序列比较、DNA-DNA 杂交实验及多位点测序等多种可靠方法，但这些根据遗传特征的分析方法耗 时长、工作量大。因此，目前缺少对克罗诺杆菌属菌株的高效率的鉴定与鉴 别方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有传统技术检测时间长的缺陷，提 供一种克罗诺杆菌属菌株的PCR检测方法、核酸及引物对。采用本发明的 检测方法检测克罗诺杆菌属菌株，检测时间短，成本低，更加具有实用性， 检测结果特异，结果判定简单。

本发明的技术方案如下：

本发明的技术方案之一是：一种检测克罗诺杆菌属菌株的方法，包括以 下步骤：

（1）提取待检样品的基因组DNA，以其为模板，以克罗诺杆菌属特异 性扩增引物对为引物，进行PCR扩增，所述的引物对中，一条引物的序列 为SEQ ID NO.1所示，另一条引物的序列为SEQ ID NO.2所示；和

（2）检测438bp位置单一扩增产物的存在。

根据本发明，步骤（1）中，所述PCR中，PCR的反应体系较佳的为： 1×PCR反应缓冲液，10-15mmol/L Mg²⁺，0.2-0.3mmol/L dNTP，0.1-0.3μM 引物1，0.1-0.3μM引物2，Taq酶0.01-0.1U/μL，DNA模板10-100ng/μL。 更佳的为：1×PCR反应缓冲液，12.5mmol/L Mg²⁺，0.25mmol/L dNTP， 0.2μM引物1（SEQ ID NO.1），0.2μM引物2（SEQ ID NO.2），Taq酶0.04U/μL， DNA模板50ng/μL。

步骤（1）中，所述PCR中，PCR的扩增程序较佳的为：92-95℃预变 性3-6min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：92-95℃变性20-40s， 60-65℃退火20-40s，70-74℃延伸20-40s；循环共30-40个；循环结束后， 70-74℃延伸8-12min，降温至4-15℃，结束。更佳的为：94℃预变性5min， 之后开始以下循环，每个循环的程序为：94℃变性30s，63℃退火30s，72℃ 延伸30s；循环共35个；循环结束后，72℃延伸10min，降温至12℃，结束。

步骤（2）中，所述的检测结果的判断方法如下：在检测的结果中，如 果存在438bp位置的单一扩增产物，则说明待检样品中含有克罗诺杆菌菌属 菌株；如果不存在438bp位置的单一扩增产物，则待检样品中不含有克罗诺 杆菌属菌株。

步骤（2）中所述的检测方法，可以是本领域常规的方法，优选的为凝 胶电泳检测法，可以是琼脂糖凝胶，也可以是聚丙烯酰胺凝胶。

本发明的方法尤其适用于检测食品中的克罗诺杆菌属菌株，特别是奶粉 中的克罗诺杆菌属菌株的检测。

本发明的技术方案之二是：一种检测克罗诺杆菌属菌株的试剂盒，其包 括一条序列为SEQ ID NO.1所示的引物和一条序列为SEQ ID NO.2所示的引 物。较佳的，还包括10×PCR缓冲液，Taq酶，dNTP溶液和MgCl₂。所述 的10×PCR缓冲液，Taq酶，dNTP溶液和MgCl₂都如本领域常规所述。

本发明的技术方案之三是：一种扩增克罗诺杆菌属菌株的引物，其序列 如SEQ ID NO.1所示或者如SEQ ID NO.2所示。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发 明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：采用本发明的检测方法检测克罗诺杆菌属 菌株，检测时间短，降低了检测成本；提高了检测效率；本发明的检测方法， 具有单一特异性，检测结果可靠，结果判定简单。本发明为食品安全检测技 术领域提供了一种简单快速灵敏的检测克罗诺杆菌属细菌的方法，对我国的 食品安全具有较大意义。

附图说明

图1是实施例1中PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳实验结果。泳道1～ 17依次为：阪崎克罗诺杆菌ATCC29544，穆汀斯克罗诺杆菌ATCC51329， 鼠伤寒沙门氏菌ATCC14023，肠炎沙门氏菌ATCC13311，阴沟肠杆菌 ATCC13047，大肠杆菌ATCC43889，大肠杆菌ATCC25922，奇异变形杆菌 ATCC12453，普通变形杆菌ATCC33420，枸橼酸杆菌ATCC8090，肺炎克雷 伯杆菌ATCC27336，肺炎克雷伯杆菌ATCC46114，宋志氏志贺氏菌 CMCC51334，痢疾志贺氏菌CMCC51335，福氏志贺氏菌ATCC51371，绿 脓杆菌CDCB32116，100bp DNA Marker。

图2是实施列1中PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道1～17 依次为：蜡样芽胞杆菌ATCC1220,气味沙雷氏菌ATCC33077,粘质沙雷氏 菌ATCC14040,恶臭假单胞菌ATCC17485,产碱假单胞菌IQCC12604,金黄 色葡萄球菌ATCC29213,金黄色葡萄球菌ATCC8095,屎肠球菌ATCC14025, 粪肠球菌ATCC49452,产气肠杆菌ATCC13048,霍乱弧菌SJTU32001,副溶 血弧菌ATCC17802,副溶血弧菌ATCC33846,创伤弧菌ATCC27562,单核增 生李斯特菌AB97021,单核增生李斯特菌ATCC13313,100bp DNA Marker。

图3是实施列1中PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道1～17 依次为：阪崎克罗诺杆菌ATCC29544，穆汀斯克罗诺杆菌ATCC51329，克 罗诺杆菌基因种NCTC9529,丙二酸盐阳性克罗诺杆菌DSM18702,苏黎世 克罗诺杆菌DSM18703,都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种DSM18705,都柏林 克罗诺杆菌洛桑亚种DSM18706，都柏林克罗诺杆菌乳粉亚种DSM18707， 阪崎克罗诺杆菌BDCS001，阪崎克罗诺杆菌BDCS002，阪崎克罗诺杆菌 BDCS003，阪崎克罗诺杆菌BDCS004，阪崎克罗诺杆菌BDCS005，阪崎克 罗诺杆菌BDCS006，阪崎克罗诺杆菌BDCS007，阪崎克罗诺杆菌BDCS008, 100bp DNA Marker。

图4实施列1中是PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道1～17 依次为：阪崎克罗诺杆菌BDCS009，阪崎克罗诺杆菌BDCS010，阪崎克罗 诺杆菌BDCS011，阪崎克罗诺杆菌BDCS012，阪崎克罗诺杆菌BDCS013， 阪崎克罗诺杆菌BDCS014，阪崎克罗诺杆菌BDCS015，阪崎克罗诺杆菌 BDCS016，阪崎克罗诺杆菌BDCS017，阪崎克罗诺杆菌BDCS018，阪崎克 罗诺杆菌BDCS019，阪崎克罗诺杆菌BDCS020，阪崎克罗诺杆菌BDCS021， 阪崎克罗诺杆菌BDCS022，阪崎克罗诺杆菌BDCS023，阪崎克罗诺杆菌 BDCS024，100bp DNA Marker。

图5是实施列1中PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道1～8 依次为：阪崎克罗诺杆菌BDCS025，阪崎克罗诺杆菌BDCS026，阪崎克罗 诺杆菌BDCS027，阪崎克罗诺杆菌BDCS028，阪崎克罗诺杆菌BDCS029， 阪崎克罗诺杆菌BDCS030，ddH₂O,100bp DNA Marker。

图6是实施列1中PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证引物灵敏度实 验图谱。泳道1～10依次为：100bp DNA Marker,141.0ng/PCR,14.1ng/PCR, 1.41ng/PCR,141pg/PCR,14.1pg/PCR,1.41pg/PCR,141fg/PCR,14.1 fg/PCR,,ddH₂O。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

克罗诺杆菌属菌株PCR检测方法

步骤一，引物合成

合成能够PCR扩增克罗诺杆菌属gyrB基因序列中的保守序列的引物 （由上海生工生物工程技术服务有限公司合成），引物序列如下：

SEN2-L：5’-ATGGATAAAGAGGGCTACAG-3’（SEQ ID NO:1），

SEN2-R：5’-CGCCTGATTCTTACGGTTAC-3’（SEQ ID NO:2）。

步骤二，PCR检测方法的体系及反应参数

采用上述引物，以克罗诺杆菌属标准菌株的基因组DNA为模板，进行 PCR反应体系和反应程序的建立和优化，经过单因素、多因素试验和杂交试 验，发现以下反应体系和反应程序都能得到单一的438bp左右的扩增产物。 所述PCR反应体系为：1×PCR反应缓冲液，10-15mmol/L Mg²⁺， 0.2-0.3mmol/L dNTP，0.1-0.3μM引物1，0.1-0.3μM引物2，Taq酶 0.01-0.1U/μL，DNA模板10-100ng/μL。所述PCR扩增程序为：92-95℃预 变性3-6min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：92-95℃变性20-40s， 60-65℃退火20-40s，70-74℃延伸20-40s；循环共30-40个；循环结束后， 70-74℃延伸8-12min，降温至4-15℃，结束。而最优的反应体系和反应程序 如下，其438bp左右的扩增产物的产量最高，电泳条带最明显清晰。最优的 PCR反应体系为：1×PCR反应缓冲液，12.5mmol/L Mg²⁺，0.25mmol/L  dNTP，0.2μM引物1，0.2μM引物2，Taq酶0.04U/μL，DNA模板40ng/μL。 最优的PCR扩增程序为：94℃预变性5min，之后开始以下循环，每个循环 的程序为：94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s；循环共35个；循 环结束后，72℃延伸10min，降温至12℃，结束。

因此，本发明建立了最优的PCR检测方法如下：先加入16.1μL无菌水 到反应管中，再依次加入10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg²⁺ 2.0μL， 2.5mmol/L的dNTP 1.0μL，5μM引物1.0μL，2.5U/μL Taq酶0.4μL，最后加 模板溶液2μL，并以无菌水为模板作为反应的阴性对照。然后将反应管离心 后，放入PCR反应仪中，按照以下PCR程序进行：在94℃预变性5min， 接着作35个循环，每个循环的程序包括94℃变性30s，退火温度63℃，退 火时间为30s，然后在72℃延伸30s，循环结束后在72℃延伸10min，最后 降温至12℃，结束所有操作程序。

步骤三，检测

取阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐阳性克罗诺杆菌等克罗诺杆菌属标准菌 株8株及30株分离菌株（如表1所示，表中所示菌株均为本领域的技术人 员可通过公开的渠道获得的），按照基因组DNA模板提取方法，分别提取基 因组DNA。提取过程如下：将阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐阳性克罗诺杆菌 等38株菌株（如表1所示）分别接种至50mL的TSB液体培养基中，在37℃ 增菌8h后，取1mL菌液，放入1.5mL离心管中；之后在3,000r/min离心10min， 取上清液，再在12,000r/min离心5min，收集菌体。用无菌双蒸水重新悬浮 菌体，离心洗涤后加入100μL无菌超纯水，在沸水浴中煮15min，立即取出， 在-20℃放置30min。在37℃解冻后，12,000r/min离心5min，取上清液放置 -20℃备用。

每株菌株的DNA溶液（DNA浓度50ng/μL）均取2μL作为PCR反应 模板添加到PCR反应体系中进行扩增反应。采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增 产物，判断在438bp位置是否存在单一扩增条带，结果见表1，电泳结果见 图1-5。

从表1中可知，除了克罗诺杆菌属菌株的标准菌株和食品分离株外，其 余阴性对照菌株均没有特异扩增条带。表1中，-：PCR结果为阴性；+：PCR 结果为阳性。表1中克罗诺杆菌属(Cronobacter spp)使用了8株标准菌株， 代表了该属内所有种的典型标准菌株。属内包括6个种(其中Cronobacter  sakazakii称为新组合)，即阪崎克罗诺杆菌ATCC25944，丙二酸盐阳性克罗 诺杆菌DSM18702，穆汀斯克罗诺杆菌ATCC51329，苏黎世克罗诺杆菌 DSM18703，克罗诺杆菌基因种1NCTC9529和都柏林克罗诺杆菌。其中都 柏林克罗诺杆菌包括三个亚种，即都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种DSM18705， 都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种DSM18706和都柏林克罗诺杆菌乳粉亚种 DSM18707。克罗诺杆菌属和肠杆菌属的亲缘关系最近，尤其和肠杆菌属内 的阴沟肠杆菌亲缘关系最近。本次试验共使用了肠杆菌属标准菌株12株， 志贺氏菌属标准菌株3株，沙雷氏菌属标准菌株2株，克雷伯属标准菌株2 株，葡萄球菌属标准菌株2株，假单胞菌属标准菌株3株，李斯特菌属标准 菌株2株，弧菌属标准菌株3株及分离菌株1株。所使用的这些菌株都是食 源性致病菌，而且绝大多数都属于肠杆菌科的，它们和克罗诺杆菌属菌株具 有较近的亲缘关系。如果这些菌株经本发明的引物通过PCR实验后扩增不 到特异的片段，那么其它的和克罗诺杆菌属菌株亲缘关系较远的菌株更加难 以扩增到目的片段（438bp）,因此经过这些亲缘关系较近的菌株的验证， 充分保证了本次试验设计的引物的特异性。上述结果充分证明本发明的方法 能扩增克罗诺杆菌属的任何菌株，而不会扩增其它的任何菌株。

表1.特异性评价所用菌株及试验结果

步骤四，灵敏度评价试验

经测定，克罗诺杆菌属基因组总DNA溶液的浓度为28.20μg/mL，用无 菌水作10倍梯度稀释，共稀释10个梯度，每个梯度分别取5μL加入PCR 反应体系，凝胶电泳检测扩增产物，在凝胶成像仪中观察凝胶电泳结果，如 图6所示，图中：泳道2～9：DNA模板浓度分别为141.0ng/PCR,14.1ng/PCR, 1.41ng/PCR,141pg/PCR,14.1pg/PCR,1.41pg/PCR,141fg/PCR,14.1 fg/PCR,；泳道10：ddH₂O；泳道：100bp分子量标准（DNA marker）。由 图6可知，在第7条泳道可以看到清晰的条带，所对应DNA浓度为1.41pg /PCR，而第8条泳道之后看不到扩增条带。因此，判定PCR检测灵敏度为 1.41pg/PCR，具有较高的灵敏度。

实施例2

人工污染阪崎克罗诺杆菌标准菌株ATCC25944的检测

人工污染样品的制备：取10mL的牛乳与89mL的液体TSB培养基混 合后，加入稀释后1mL的阪崎克罗诺杆菌ATCC2594纯培养菌液（7CFU/ mL），在37℃，150r/min条件下培养12h。每隔2h取样1次，水煮法提取 基因组DNA，按优化后的条件进行PCR检测。利用实施例1建立的克罗诺 杆菌属菌株的PCR检测方法进行PCR检测，人工污染8h后即可检测到该菌。