一种pH 2.5～6.5范围内有高活性的β-甘露聚糖酶MAN5A及其基因和应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种pH 2.5～6.5范围内有高活性的β-甘露聚糖酶MAN5A及其基因和应用。本发明提供了一种新的β-甘露聚糖酶MAN5A，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述β-甘露聚糖酶MAN5A的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3或4所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明提供的pH 2.5～6.5范围内有高活性的β-甘露聚糖酶MAN5A具有强嗜酸性，作用pH范围广，较好的耐热性和抗蛋白酶能力，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的β-甘露聚糖酶。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种pH 2.5～6.5范围内有高活性的β-甘露聚糖酶MAN5A及其基因和应用。 

背景技术

植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素及木质素等物质构成。甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，是由β-1，4-D-甘露糖连接而成的线状多聚体，在多糖的侧链上主要有葡萄糖基、乙酰基和半乳糖基等取代基团。甘露聚糖具有高亲水性，在单胃动物的消化道内大量吸水，增加了消化道内容物的黏度，抵抗胃肠蠕动，直接影响动物对营养物质的消化吸收。 

β-甘露聚糖酶(β-mannanase EC3.2.1.78)是一种水解甘露聚糖的内切水解酶，以内切方式降解甘露糖主链β-1，4糖苷键，释放出短的β-1，4甘露寡糖。虽然甘露聚糖的完全酶解需要β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶、a-半乳糖苷酶和脱乙酰酶的协同作用，但其中β-甘露聚糖酶是主要发挥作用的酶，在饲料中得到比较广泛的应用。在饲料中加入β-甘露聚糖酶能分解β-甘露聚糖，使之转化为甘露低聚糖，从而降低β-甘露聚糖的抗营养作用，提高饲料利用率，促进畜禽生长，减轻环境污染。另外，β-甘露聚糖酶分解β-D-甘露聚糖生成的甘露低聚糖还是一类重要的功能性寡糖，具有一定的免疫原性，能刺激机体的免疫应答，并与病毒和毒素结合，减缓抗原的吸收，能调节肠道菌群，干扰病原菌定植，促进肠道有益菌群增殖，提高动物的生产性能，长期使用可防止沙门菌和肉毒杆菌等致病菌感染及在肠道的定植和繁殖，减少抗生素的添加量。近年来，随着豆类产品(豆粕等)在动物饲料中的广泛应用，甘露聚糖的抗营养作用也越来越受到重视，在饲料中添加酶制剂是解决这一问题的主要途径。 

近年来，随着甘露寡糖生理功能的发现，绿色饲料的兴起以及人们环保意识的增强，对β-甘露聚糖酶的研究和利用已进入了一个新的阶段。β-甘露聚糖酶已被广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。而在饲料中应用的甘露聚糖酶，主要在单胃动物的胃和小肠内发挥作用，因此饲料中使用的β-甘露聚糖酶需要具备以下特征：第一、最适pH在酸性，同时在整个酸性和中性的pH范围内又能维 持较高活性，确保其可以更好的在动物肠道内发挥作用；第二、对动物胃、胰蛋白酶具有较好的抗性，确保其在动物肠道内可以稳定的存在，而不被蛋白酶降解；第三、良好的热稳定性，同时在常温下又具有高活性等综合性质，确保其在制粒加工的过程中不容易失活，而在动物体温39℃左右能够很好的发挥作用；最后，容易发酵生产，成本低廉。因为饲料用酶仅是众多饲料添加剂中的一类，决定了其添加成本必须十分低廉。 

β-甘露聚糖酶广泛存在于细菌、放线菌、真菌、植物、动物等生物中。细菌来源的甘露聚糖酶主要是酸偏中性的甘露聚糖酶。其分子量多在35～55kDa之间，最适反应作用温度为50～70℃。目前研究最多的是芽孢杆菌，除嗜碱性芽孢杆菌的最适作用pH达到9.0以上，大多最适反应pH在5.5～8.0之间。真菌的β-甘露聚糖酶一般呈酸性，分子量大约在45～55kDa，最适作用pH为4.0～6.0，最适作用温度为55～75℃。相对细菌而言，真菌来源的β-甘露聚糖酶最适反应pH值、pH稳定性都偏低，耐热性比细菌差。目前国内外，虽然许多β-甘露聚糖酶被克隆分离及性质测定，但这些酶的性质特征，均存在一些缺陷，例如，pH作用范围不合适，热稳定性差，表达量低等，均不能满足实际应用的需要。因此人们希望能够找到一种新的能够满足实际应用需求的β-甘露聚糖酶，从而能够进一步推广该β-甘露聚糖酶在饲料、食品、医药等行业中应用。 

本发明从云南锡矿的酸性废水中分离的Penicillium sp.WN1菌株中得到了一个新的β-甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶具有以下几个优点：宽的pH作用范围良好的热稳定性、高比活、强的蛋白酶抗性、容易发酵生产。所有这些优点都意味着本发明的新的β-甘露聚糖酶在饲料、食品、医药等行业中，与现有β-甘露聚糖酶相比，将会更有应用价值。 

发明内容

本发明的目的是提供一种pH 2.5～6.5范围内有高活性的β-甘露聚糖酶MAN5A。 

本发明的另一目的是提供编码上述β-甘露聚糖酶的基因。 

本发明的另一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组载体。 

本发明的另一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株。 

本发明的另一目的是提供制备上述β-甘露聚糖酶的方法。 

本发明的另一目的是提供上述β-甘露聚糖酶的应用。 

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的β-甘露聚糖酶。本发明分离筛选出一 种生产上述pH 2.5～6.5范围内有高活性的β-甘露聚糖酶MAN5A的嗜酸真菌：青霉WN1(Penicillium sp.)，于2011年8月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.5131。 

本发明提供了一种β-甘露聚糖酶MAN5A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1： 

MKSAILILPF LSHLAVSQTA NWGQCGGENW NGDTTCNPGW 

YCSYLNPWYS QCVPGSGSSS       60 

SSTTLSTVVS SQTSSIRTTS ATSTLAASAS TTAGSLPSAS GTSFVIDGKK 

GYFAGTNSYW                   120 

LPFLTNNADV DLVMGHLQQS GLKILRVWGF NDVNAVPSSD 

TVWFQLLANG QQTINTGSDG      180 

LQRLDYVVKS AEAHGIKLII NFVNNWDDFG GMNAYVQNYG 

GNQTSWYTNN AAQDAYKTYI       240 

KTVISRYIGS SAIFAWELAN EPRCKGCGTD VIYNWAQSTS QYIKSLEPGR 

MVCIGDEGMG                   300 

LSVDSDGSYP FGYSEGNDFE KTLAIPTIDF GTIHLYPSQW GETDSWGSSW 

ITAHGQACKN                   360 

AGKPCLLEEY GSTSLCSSEA PWQTTAISSV AADLFWQWGD TLSTGQSAHD 

EYSIFYGS SD                 420 

YTCLVTDHVS AIDSA            435 

其中，该酶全长435个氨基酸，N端20个氨基酸为其预测的信号肽序列“MKSAILILPF LSHLAVSQTA”。因此，成熟的β-甘露聚糖酶MAN5A的理论分子量为44.7kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2： 

NWGQCGGENW NGDTTCNPGW YCSYLNPWYS QCVPGSGSSS 

SSTTLSTVVS SQTSSIRTTS   60 

ATSTLAASAS TTAGSLPSAS GTSFVIDGKK GYFAGTNSYW LPFLTNNADV 

DLVMGHLQQS                 120 

GLKILRVWGF NDVNAVPSSD TVWFQLLANG QQTINTGSDG 

LQRLDYVVKS AEAHGIKLII    180 

NFVNNWDDFG GMNAYVQNYG GNQTSWYTNN AAQDAYKTYI 

KTVISRYIGS SAIFAWELAN  240 

EPRCKGCGTD VIYNWAQSTS QYIKSLEPGR MVCIGDEGMG LSVDSDGSYP 

FGYSEGNDFE                 300 

KTLAIPTIDF GTIHLYPSQW GETDSWGSSW ITAHGQACKN AGKPCLLEEY 

GSTSLCSSEA                 360 

PWQTTAISSV AADLFWQWGD TLSTGQSAHD EYSIFYGSSD YTCLVTDHVS 

AIDSA                    415 

该β-甘露聚糖酶MAN5A同时具有非常广的作用pH范围，最适pH为5.5，在pH 2.5-6.5范围内，酶活能维持80％以上；最适温度为65℃，在30～70℃间能维持55％以上的酶活性；在65℃处理30min，保持28.3％的酶活性；具有极好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶处理能力；同时高密度发酵酶活性高，易于工业化生产。该酶的性质非常适合在饲料、食品等行业中应用。这种具有宽的pH作用范围和宽的温度作用范围性质的β-甘露聚糖酶未曾有过报道。 

本发明还提供了编码上述pH 2.5～6.5范围内有高活性的β-甘露聚糖酶MAN5A的基因。该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示： 

atgaagtccg caatcctcat cctccccttc ctgtcccatc tagccgtttc ccaaacggca     60 

aattggggtc agtgtggtgg cgaaaactgg aatggagata ccacctgcaa tcccggctgg    120 

tactgctcgt atctgaaccc atggtatagc cagtgtgttc caggctcggg ctcgtcttcg    180 

tcttcaacga ctttatcaac tgtcgtatct tcacagacat cctccatccg cactaccagc    240 

gctaccagca cattagctgc tagtgcctct actactgccg gctctcttcc tagtgctagt    300 

ggcactagct tcgtgattga cggtaaaaag gggtactttg ctggtacaaa ttcgtactgg    360 

cttcccttcc tcacgaacaa tgccgatgtt gacttggtaa tgggccattt gcagcagtcg    420 

ggtctaaaga tcttacgggt ctggggattc aacgatgtca acgctgtacc cagctccgac    480 

acagtctggt ttcagcttct cgcaaacggt cagcagacaa tcaacacggg ctctgacggg    540 

ctacagcgtc ttgactatgt cgtgaagtca gctgaagccc atggtatcaa gctgatcatc    600 

aactttgtga ataactggga tgactttggc ggtatgaacg cctacgttca gaattatggt    660 

ggcaatcaga ccagttggta cacaaataac gcagcacaag acgcgtataa gacatatatc    720 

aagacggtca ttagccggta catcgggtct tctgccatct ttgcatggga attagcaaat    780 

gaaccgcgct gcaagggatg tggcaccgat gtcatttaca attgggccca gtctacaagc    840 

cagtatatca agtcgcttga accgggccgt atggtgtgca ttggagatgg taagtcgcat    900 

acttgcttca caaaagtatc cactggtgag ctttactaac gttcgtactt gatagagggc    960 

atgggtttga gcgttgactc ggatggcagc tatccctttg gatactctga aggaaatgat   1020 

tttgaaaaga ctttggccat ccccacaatc gattttggaa caatccattt atacccgagt   1080 

caatgtgagt caaagacctt cacctcttat gatgaccaaa gactaacaca tccaaatcag   1140 

ggggcgagac ggattcctgg ggctcatcct ggatcacagc ccacggccaa gcctgcaaga    1200 

acgccggcaa accatgtctc ctcgaagagt atggttcaac tagtctctgt agctccgagg    1260 

ctccctggca gacaaccgct ataagctccg ttgccgcgga tttgttctgg cagtggggtg    1320 

atacattgag tactggacag tctgcacatg acgagtacag catcttctat ggtagtagtg    1380 

attacacctg cttggtgacg gatcatgtta gtgcaattga ctcggcttga               1430 

本发明通过PCR的方法分离克隆了pH 2.5～6.5范围内有高活性的β-甘露聚糖酶MAN5A的基因man5A，DNA全序列分析结果表明，β-甘露聚糖酶MAN5A结构基因man5A全长1430bp，含有2个内含子，+881～955bp，+1085～1141bp，为其内含子序列，cDNA长1308bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.4所示： 

atgaagtccg caatcctcat cctccccttc ctgtcccatc tagccgtttc ccaaacggca     60 

aattggggtc agtgtggtgg cgaaaactgg aatggagata ccacctgcaa tcccggctgg    120 

tactgctcgt atctgaaccc atggtatagc cagtgtgttc caggctcggg ctcgtcttcg    180 

tcttcaacga ctttatcaac tgtcgtatct tcacagacat cctccatccg cactaccagc    240 

gctaccagca cattagctgc tagtgcctct actactgccg gctctcttcc tagtgctagt    300 

ggcactagct tcgtgattga cggtaaaaag gggtactttg ctggtacaaa ttcgtactgg    360 

cttcccttcc tcacgaacaa tgccgatgtt gacttggtaa tgggccattt gcagcagtcg    420 

ggtctaaaga tcttacgggt ctggggattc aacgatgtca acgctgtacc cagctccgac    480 

acagtctggt ttcagcttct cgcaaacggt cagcagacaa tcaacacggg ctctgacggg    540 

ctacagcgtc ttgactatgt cgtgaagtca gctgaagccc atggtatcaa gctgatcatc    600 

aactttgtga ataactggga tgactttggc ggtatgaacg cctacgttca gaattatggt    660 

ggcaatcaga ccagttggta cacaaataac gcagcacaag acgcgtataa gacatatatc    720 

aagacggtca ttagccggta catcgggtct tctgccatct ttgcatggga attagcaaat    780 

gaaccgcgct gcaagggatg tggcaccgat gtcatttaca attgggccca gtctacaagc    840 

cagtatatca agtcgcttga accgggccgt atggtgtgca ttggagatga gggcatgggt    900 

ttgagcgttg actcggatgg cagctatccc tttggatact ctgaaggaaa tgattttgaa    960 

aagactttgg ccatccccac aatcgatttt ggaacaatcc atttataccc gagtcaatgg   1020 

ggcgagacgg attcctgggg ctcatcctgg atcacagccc acggccaagc ctgcaagaac   1080 

gccggcaaac catgtctcct cgaagagtat ggttcaacta gtctctgtag ctccgaggct   1140 

ccctggcaga caaccgctat aagctccgtt gccgcggatt tgttctggca gtggggtgat   1200 

acattgagta ctggacagtc tgcacatgac gagtacagca tcttctatgg tagtagtgat   1260 

tacacctgct tggtgacgga tcatgttagt gcaattgact cggcttga                1308 

其中，信号肽的碱基序列为： 

“atgaagtccgcaatcctcatcctccccttcctgtcccatctagccgtttcccaaacggca” 

成熟蛋白理论分子量为44.7kDa，该酶属于糖基水解酶第5家族。将β-甘露聚糖酶基因man5A的cDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，与Talaromyces stipitatus ATCC 10500(XP002480621)来源的一个预测蛋白内切-1，4-β-甘露糖苷酶具有最高的氨基酸序列一致性，一致性达82％。与做过功能验证的来源于Aspergillus fumigatus(ACH58410)的内切β-甘露聚糖酶最高一致性为58％。说明MAN5A是一种新的甘露聚糖酶。 

本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因man5A的重组载体，优选为pPIC9-man5A。将本发明的β-甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将β-甘露聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-man5A。 

本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/man5A。 

本发明还提供了一种制备pH 2.5～6.5范围内有高活性的β-甘露聚糖酶MAN5A的方法，包括以下步骤： 

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 

2)培养重组菌株，诱导重组β-甘露聚糖酶MAN5A的表达；以及 

3)回收并纯化所表达的β-甘露聚糖酶MAN5A。 

其中，所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/man5A。 

本发明还提供了上述pH 2.5～6.5范围内有高活性的β-甘露聚糖酶MAN5A的应用，优选该酶在水解β-甘露聚糖以及其在饲料、食品和医药工业领域的应用。运用基因工程手段来产业化生产pH作用范围广的甘露聚糖酶产品还未见报道。 

本发明提供了一个新的β-甘露聚糖酶基因，其编码的β-甘露聚糖酶具有强嗜酸性，作用pH范围广，较好的耐热性和抗蛋白酶能力，可应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的β-甘露聚糖酶。 

附图说明

图1man5A在毕赤酵母中表达的β-甘露聚糖酶MAN5A的SDS-PAGE分析，1，分子量标准；2，纯化的重组β-甘露聚糖酶。 

图2本发明重组β-甘露聚糖酶MAN5A的最适pH值。 

图3本发明β-甘露聚糖酶MAN5A的pH稳定性。 

图4本发明β-甘露聚糖酶MAN5A的最适反应温度。 

图5本发明β-甘露聚糖酶MAN5A的热稳定性。 

本发明分离筛选出一种生产上述pH 2.5～6.5范围内有高活性的β-甘露聚糖酶MAN5A的嗜酸真菌：青霉WN1(Penicillium sp.)，于2011年8月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.5131。 

具体实施方式

试验材料及一般实验方法： 

1、菌株及载体：菌株Penicillium sp.WN1分离于云南锡矿的酸性废水；毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)为本实验室保存；毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。 

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。 

3、培养基： 

(1)产酶培养基：将30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆粕，5g/L魔芋粉，5g/L(NH₄)SO₄，1g/L KH₂PO₄，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.01g/L FeSO₄·7H₂O，0.2g/LCaCl₂加入去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min； 

(2)大肠杆菌培养基LB(126蛋白胨、0.5％酵母提取物、126NaCI，pH 7.0)； 

(3)BMGY培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.000049＜Biotin，1％甘油(v/v)； 

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。 

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。 

实施例1提取Penicillium sp·WN1基因组DNA 

本发明从云南锡矿的酸性废水中分离的真菌WN1。根据形态及ITS序列鉴定为Penicillium属，命名为WN1(Penicillium sp.)。该菌株于2011年8月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.5131。 

将青霉WN1经马铃薯汁培养基培养后，接种于诱导培养基中((NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，CaCl₂ 0.2g/L，魔芋粉0.5％，豆粕1％，1.5％琼脂糖，pH5.0)平板上，30℃培养5～6d，测定其产β-甘露聚糖酶的活性。经测定该菌为高产β-甘露聚糖酶菌株。 

将马铃薯汁培养基培养3天的菌丝体，12,000rpm离心10min，收集的菌丝体加入已高温灭菌的研钵中，用液氮迅速研磨至粉末，然后将研磨好的菌体转移至一个新的，装有15ml CTAB裂解液50mL离心管中，轻柔上下倒置混匀，置于70℃水浴锅保温3h，每隔20min，上下倒置轻柔混匀一次，以便充分裂解菌体。4℃、12,000rpm离心10min，吸取上清至新的离心管中，加入等体积的氯仿抽提，室温放置5min，4℃、12,000rpm离心10min。取上清再加入等体积的酚/氯仿抽提，室温放置5min，4℃、12,000rpm离心10min。以便尽量除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。 

实施例2嗜酸真菌Penicillium sp·WN1β-甘露聚糖酶编码基因man5A的克隆 

根据已发表的β-甘露聚糖酶基因保守序列设计合成了兼并引物Man5P1，Man5P2(见表1)。以Penicillium sp.WN1总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃、5min；94℃、30sec，50～45℃、30sec，72℃、30sec，12个循环(其中每个循环后复性温度下降1℃)；94℃、30min，45℃、30sec，72℃、30sec，30个循环；72℃、10min。得到一约170bp片段，将该片段回收后送三博生物技术有限公司测序。 

根据测序得到的核甘酸序列设计TAIL-PCR引物usp1，usp2，usp3；dsp1，dsp2，dsp3(见表1)。通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。测序正确的片断经拼接后获得全长基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。 

表1.β-甘露聚糖酶基因克隆的简并引物及TAIL-PCR特异性引物 

实施例3β-甘露聚糖酶基因的RT-PCR分析 

提取Penicillium sp.WN1总RNA，利用Oligo(dT)₂₀和反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计扩增开放阅读框的的引物MAN5AF和MAN5AR(见表1)，扩增该单链cDNA，获得甘露聚糖酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序，测序结果如SEQ ID NO.4所示。 

通过对甘露聚糖酶的基因组序列和cDNA序列比对后发现该基因有含有2个内含子，cDNA长1308bp，编码435个氨基酸和一个终止密码子，N端20个氨基酸为其预测的信号肽序列，所测出的基因Man5A的成熟蛋白氨基酸序列与Talaromycesstipitatus ATCC 10500(XP002480621)来源的一个预测蛋白内切-1，4-β-甘露糖苷酶具有最高的一致性为82％。与做过功能验证的来源于Aspergillus fumigatus(ACH58410)的内切β-甘露聚糖酶的最高一致性为58％。证明从Penicillium sp.WN1中分离克隆得到的编码甘露聚糖酶的基因为新基因。 

实施例4β-甘露聚糖酶工程菌株的构建 

(1)表达载体的构建及在酵母中的表达 

以测序正确的β-甘露聚糖酶Man5A的cDNA为模板，设计合成了带有EcoR I和NotI限制性酶切位点的引物Man5A-m-F和Man5A-m-R(见表1)，对Man5A的成熟蛋白(去除信号肽)的编码区进行扩增。并利用EcoR I和NotI酶切PCR产物，连接进入表达载体pPIC9(Invitrogen，San Diego)，β-甘露聚糖酶Man5A成熟蛋白的序列插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构 建成酵母表达载体pPIC9-Man5A。同样，将包含有信号肽序列的β-甘露聚糖酶Man5A的cDNA通过酶切、连接方法插入已去除α-因子信号肽序列的表达载体pPIC9中，获得含信号肽序列的β-甘露聚糖酶Man5A的重组质粒pPIC9-Man5A-1。将表达载体pPIC9-Man5A与pPIC9-Man5A-1同时转化大肠杆菌感受态细胞JM109。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。重组质粒pPIC9-Man5A与pPIC9-Man5A-1分别用约8微克的限制性内切酶BglII进行线性化，电击转化酵母GS115感受态细胞，涂布于组氨酸缺陷性的RDB平板，30℃培养2-3天，挑取在RDB平板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。 

(2)高甘露聚糖酶活性转化子的筛选 

用灭过菌的牙签分别从含有经重组质粒pPIC9-Man5A与pPIC9-Man5A-1转化的转化子的RDB板上挑取单菌落，按照编号先点到MM上，再点到相应编号的MD平板上，每个平板上点100个单菌落，共计500个转化子；将点有转化子的MM、MD平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从MD平板上挑取转化子接种于装有3mL BMGY培养基的离心管中，30℃、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，离心管中再加入1mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，在30℃、220rpm诱导培养；诱导培养48h后，3,000×g离心5min，取上清用于酶活性检测，分别从经重组质粒pPIC9-Man5A与pPIC9-Man5A-1转化的转化子中筛选出高甘露聚糖酶活性的转化子，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。 

实施例5重组β-甘露聚糖酶的制备 

(1)β-甘露聚糖酶基因Man5A在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达 

将上述筛选出的经重组质粒pPIC9-Man5A与pPIC9-Man5A-1转化的酶活较高的转化子，分别接种于300mLBMGY液体培养基的1L三角瓶中，30℃，220rpm摇床振荡培养48h；5,000rpm离心5min，轻柔弃上清，再向菌体加入100mL含有0.5％甲醇的BMMY液体培养基，30℃，220rpm诱导培养72h。诱导培养期间，间隔24h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5％左右；(3)12,000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。 

(2)重组β-甘露聚糖酶的纯化 

收集摇瓶表达的重组β-甘露聚糖酶上清液，通过10kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10kDa超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到 一定倍数的重组Man5A，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取MAN5A浓缩液2.0mL经预先用20mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡过的HiTrap Q Sepharose XL阴离子柱，然后用0-1mol/L的NaCl进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定，利用SDS-PAGE电泳分析蛋白的纯度(图1)。 

实施例6重组β-甘露聚糖酶部分性质分析 

采用DNS法对本发明的甘露聚糖酶进行活性分析。具体方法如下：在pH 5.5，37℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物角豆胶，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。甘露聚糖酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解甘露聚糖生成1u mol还原糖所需的酶量为1个活性单位(U)。 

(1)甘露聚糖酶MAN5A的最适pH及pH稳定性 

经纯化的甘露聚糖酶MAN5A在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 0.5～2.2KCI-HCl缓冲液，pH 2.2～8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲液及pH 8.0～10.0Tris-HCl系列缓冲液。纯化的甘露聚糖酶MAN5A在不同pH的缓冲体系.37℃下测定的pH适性结果(图2)表明：MAN5A的最适pH为5.5，在pH 3.5时有87.5％的相对酶活性。在pH 2.5-6.5范围内，酶活性维持在80％以上，但在pH 8.0以上，基本检测不到酶活性。 

将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理60min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图3)，在pH 3.0～9.0之间保持最适pH下酶活的95％以上，这说明此酶具有较好的耐酸耐碱性。 

(2)甘露聚糖酶MAN5A反应最适温度及热稳定性。 

最适温度的测定在pH 5.5缓冲体系及不同温度下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果(图4)表明，其最适温度为65℃。耐温性测定为甘露聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在37℃下进行酶活性测定。酶的热稳定性试验表明(图5)，MAN5A在60℃下保温60min，酶活性基本不损失；65℃下保温10min.剩余酶活性为52％。这表明MAN5A具有较好的热稳定性。 

(3)甘露聚糖酶MAN5A的抗胰蛋白酶和胃蛋白酶能力。 

用pH 2.0KCl-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胃蛋白酶，pH 7.0Tris-HCI缓冲液配制0.1mg/mL胰蛋白酶。取pH 2.0KCl-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胃蛋白酶.pH7.0Tris-HCI缓冲液稀释后的0.6mL纯化的酶液加入0.6mL魄蛋白酶混合，蛋白酶/甘露骤糖酶(w/w)≈0.1，37℃保温，60min取样，在pH 5.5及 37℃条件下测定酶活性。实验结果表明β-甘露聚糖酶MAN5A用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理60min后，酶活性均没有降低，反而略有提高。用胰蛋白酶处理后酶活提高为原来的106.5％；用胃蛋白酶处理后酶活提高为原来的116.3％。说明β-甘露聚糖酶MAN5A具有非常好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力。 

实施例7重组β-甘露聚糖酶在模拟人工胃液条件下降解角豆胶的实验 

(1)重组β-甘露聚糖酶Man5A在模拟人工胃液条件下的稳定性 

将重组β-甘露聚糖酶Man5A在不同pH的模拟人工胃液及模拟人工胃液中37℃保温60min后，测定剩余酶活力结果表明，在pH 1.5-2.0范围内的模拟人工胃液中Man5A的酶活力被完全抑制，原因是其在胃液的过酸性条件下，酶液已丧失活性。Man5A在胃液范围内(pH 2.8-5.5)，具有非常好的稳定性，保持原有的初酶液活性。 

(2)甘露聚糖酶Man5A在动态模拟人工胃液条件下水解角豆胶的实验根据胃液pH的变化情况，体外人工模拟动态的胃液，并在整个水解过程中分析，甘露聚糖酶Man5A对动态模拟人工胃液中的角豆胶的水解情况。结果表明角豆胶中的甘露聚糖含量不断减少，还原糖的含量不断地增加，还原糖的含量比未添加Man5A的人工胃液高8.87mg/g。由此可看出在胃液条件下Man5A具有较好的降解角豆胶的能力。