具有抗肿瘤作用的泊洛沙姆-阿霉素偶联物及其制备方法

摘要

本发明公开一种具有抗肿瘤作用的泊洛沙姆-阿霉素偶联物胶束及其制备方法。泊洛沙姆-阿霉素偶联物具有胶束性质，是通过泊洛沙姆与丁二酸酐反应获得末端含羧基的高分子聚合物，然后该聚合物中末端羧基与阿霉素中的伯氨基以酰胺键形式直接连接反应得到。与阿霉素原料药相比，泊洛沙姆-阿霉素偶联物中共价结合的阿霉素，保持了阿霉素的抗肿瘤活性，降低肿瘤的耐药性，同时具有自组装形成胶束的性质，并且其临界胶束浓度低于泊洛沙姆。泊洛沙姆-阿霉素偶联物胶束可以通过物理包载方式，包载具有抗肿瘤作用的其他药物，实现抗肿瘤药物的联合治疗目的。

说明书

【技术领域】

本发明属于药物制剂领域，涉及一种具有抗肿瘤作用的泊洛沙姆-阿霉素偶联 物及其制备方法。

【背景技术】

在肿瘤化学药物治疗中发现，90％以上的化疗药物会被正常组织吸收，毒副 作用大，而且肿瘤细胞会对多数化疗药产生耐药性。

阿霉素是一种蒽环类抗生素，具有广谱抗肿瘤作用，临床用于治疗白血病、 淋巴癌和实体瘤等。然而，由于其具有较强的心脏毒性，同时肿瘤细胞容易对 其产生耐药性，使其应用受到了限制。

高分子-药物偶联物是一种很有效的增加药物水溶性、提高载药量的方式，其 将小分子药物接入大分子载体，制成高分子前药，特别是纳米级聚合粒子由于 其小尺寸效应和表面、界面效应，其突出优势在于：被动靶向和缓控释作用； 避免被肾脏快速清除，延长药物血浆半衰期。从而提高药效、减轻不良反应， 方便患者使用。

泊洛沙姆(Poloxamer)结构为聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)组成的 三嵌段共聚物，其结构通式为HO(C₂H₄O)_a(C₃H₆O)_b(C₂H₄O)_aH，其中PEO段为聚 氧乙烯，PPO段为聚氧丙烯。泊洛沙姆124、188、237、338和407已收载在美 国国家处方集中，泊洛沙姆188收载于英国药典。泊洛沙姆188静脉注射毒理 学研究表明其系统毒性很低，老鼠静脉注射的LD50为3g/kg以上，狗可以耐受 连续3天以500mg/(kg·h)的速度输注。近些年研究发现，泊洛沙姆能够有效的克 服肿瘤多药耐药性。

已有一些高分子-药物偶联物陆续进入临床试验阶段，还有部分高分子-药物 偶联物已批准上市，但主要集中为聚乙二醇(PEG)-抗肿瘤药物偶联物，但是 聚乙二醇体内不能降解，长期应用会产生蓄积，存在着潜在安全性问题。而泊 洛沙姆安全性较高，但尚未见应用泊洛沙姆与抗肿瘤药物阿霉素形成偶联物发 挥抗肿瘤作用的研究报道。

【发明内容】

本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种具有抗肿瘤作用的泊洛沙姆- 阿霉素偶联物。泊洛沙姆-阿霉素偶联物通过共价结合方式结合的阿霉素，保持 了阿霉素的抗肿瘤活性，降低肿瘤的耐药性，同时具有自组装形成胶束的性质， 临界胶束浓度低于泊洛沙姆，并且可以通过化学反应定量控制载药量。泊洛沙 姆-阿霉素偶联物胶束可以通过物理包载方式，包载其它具有抗肿瘤作用药物， 实现抗肿瘤药物的联合治疗目的。

本发明的另一个目的是提供泊洛沙姆-阿霉素偶联物的制备方法。

通过大量实验，本发明提供了一种具有抗肿瘤作用的泊洛沙姆-阿霉素偶联 物，该泊洛沙姆-阿霉素偶联物结构通式为I或II所示，R-NH₂表示阿霉素，I 和II分别表示泊洛沙姆：与阿霉素的物质的量比为1∶1和1∶2的偶联物，可以通 过控制高分子末端羧基量和阿霉素投料量，调节偶联物中阿霉素的含量。所述 泊洛沙姆-阿霉素偶联物可以自组装形成胶束，泊洛沙姆-阿霉素偶联物胶束保持 了阿霉素的抗肿瘤活性，降低肿瘤的耐药性，并可通过物理包载埋方式包载其 它抗肿瘤药物，发挥协同治疗目的。

上述的泊洛沙姆-阿霉素偶联物按照每1ml水中加入3-30mg的比例，可以自 组装形成泊洛沙姆-阿霉素偶联物胶束。

上述的泊洛沙姆-阿霉素偶联物胶束，进一步通过高压均质、机械过滤或强力 超声处理，得到粒径范围均一的纳米级胶束，纳米级胶束粒径分布于50-300nm 范围内。

上述的泊洛沙姆-阿霉素偶联物，其合成方法是将泊洛沙姆与丁二酸酐反应形 成末端含羧基的高聚物，然后该高聚物的末端羧基再与阿霉素中的伯氨基以酰 胺键形式直接连接形成。

上述的泊洛沙姆-阿霉素偶联物制备包括以下步骤：

a、将泊洛沙姆溶解于二氧六环中，泊洛沙姆浓度为0.1-5mol/L，加入与泊 洛沙姆物质的量比为1-3的丁二酸酐，与泊洛沙姆物质的量比为0.5-10的催化剂 4-(N，N-二甲基氨基)吡啶，与泊洛沙姆物质的量比为1-10的缚酸剂三乙胺， 进行缩合反应，室温下反应24小时，得到末端含羧基的高聚物，将反应液倒入 截留分子量为7kD的透析袋，使用二氧六环作为透析介质透析48小时，真空冷 冻干燥即得末端含羧基的高聚物，备用；

b、将经过步骤a所得的末端含羧基的高聚物溶于有机溶剂中至浓度为 0.1-10mol/L，加入与末端含羧基的高聚物物质的量比为0.5-10的催化剂a和b， 反应10-30min，加入与末端含羧基的高聚物物质的量比为0.5-3的阿霉素，反应 8-24小时；

c、将经过步骤b所得反应液转移至截留分子量为7kD的透析袋，使用10-200 倍量的步骤b中所述有机溶剂作为透析介质，透析24小时，透析过程中每6小 时换一次透析介质；然后换用相当于步骤b中所述有机溶剂体积50-1000倍的超 纯水作为透析介质，透析过程中每6小时换一次透析介质，透析48小时；透析 液真空冷冻干燥48小时，即得泊洛沙姆-阿霉素偶联物。

上述的催化剂a选自：二环己基碳化二亚胺(DCC)、1-(3-二甲基氨基丙 基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳 二亚胺(EDC)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、叠氮磷酸二苯酸(DPPA)、 对甲苯磺酰叠氮、2，4，6-三异丙基苯磺酰叠氮。

上述的催化剂b选自：羧基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺 (sulfo-NHS)、3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4酮(DEPBT)、N- 羟基苯并三氮唑(HOBT)。

上述的有机溶剂优选自：N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲氯呋喃、二甲 基亚砜或二氧六环。

上述的泊洛沙姆-阿霉素偶联物胶束保持阿霉素的抗肿瘤作用，克服耐药肿瘤 细胞对阿霉素的耐药性。

上述的泊洛沙姆-阿霉素偶联物胶束可以通过物理包埋方式包载抗肿瘤药物， 所述抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西紫杉醇、卡西他滨、顺铂、吉非替尼、川陈 皮素、羟基喜树碱和5-氟尿嘧啶。

上述的泊洛沙姆-阿霉素偶联物胶束可以采用药学公知的制剂技术制成供口 服、黏膜、注射或外用的制剂。

本发明的一种具有抗肿瘤作用的泊洛沙姆-阿霉素偶联物胶束具有以下优 点：(1)在含羟基的泊洛沙姆分子链上引入疏水药物阿霉素，增强其两亲性，使 其在水介质中可自组装成稳定的纳米胶束，相对疏水的药物聚集成内核，泊洛 沙姆分子的PEO链段形成高度亲水性外壳，具有稳定胶束、有效躲避生物体网 状内皮系统的捕捉和蛋白质吸附的作用。(2)泊洛沙姆-阿霉素偶联物既是一种良 好的高分子前体药物，又是一类优良的药物胶束载体，可以通过物理包载方式， 包载具有抗肿瘤作用药物，实现抗肿瘤药物的联合治疗目的。(3)泊洛沙姆-阿霉 素偶联物胶束临界胶束浓度低于泊洛沙姆，具有自组装形成胶束的性质，稳定 性好于泊洛沙姆。(4)泊洛沙姆-阿霉素偶联物胶束中阿霉素与洛沙姆为共价键联 接，因此阿霉素载药量和包封率较高，并且可以实现定量控制。(5)泊洛沙姆-阿 霉素偶联物胶束粒径可控，通过高压均质、机械过滤或强力超声处理，得到粒 径范围均一的纳米级胶束。

【附图说明】

图1：胶束微观形态图(a：泊洛沙姆188胶束；b：泊洛沙姆188-阿霉素偶 联物胶束；c：泊洛沙姆407-阿霉素偶联物胶束)

图2：Poloxamer 188和泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束的芘荧光强度 (I339/I333)曲线图；

图3：阿霉素与泊洛沙姆188-阿霉素胶束对A549/DOX生存率的影响图。

【具体实施方式】

现结合下列实施例来进一步描述本发明。

实施例1泊洛沙姆188-阿霉素偶联物的合成

泊洛沙姆188-阿霉素偶联物的合成：取10mmol泊洛沙姆188、25mmol丁二 酸酐、20mmolDMAP、20mmol乙二胺，以30ml二氧六环为有机溶剂，室温搅 拌反应24h，反应结束后将反应液转移至截留分子量为7kD透析袋中，于使用 二氧六环作为透析介质透析48小时，冷冻干燥，得末端为羧基的泊洛沙姆聚合 物；取10mmol末端为羧基的泊洛沙姆聚合物、20mmol阿霉素、15mmol EDC、 15mmol NHS，溶解在30ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，避光、氮气保护下， 室温搅拌反应24h；反应结束后将反应液转移至透析袋中，使用1000mlDMF作 为透析介质，透析24小时，透析过程中每6小时换一次透析介质；然后换用 1000ml超纯水作为透析介质，透析过程中每6小时换一次透析介质，透析48 小时；透析液真空冷冻干燥48小时，即得泊洛沙姆188-阿霉素偶联物。

实施例2泊洛沙姆188-阿霉素偶联物的合成

泊洛沙姆188-阿霉素偶联物的合成：取10mmol泊洛沙姆188、25mmol丁二 酸酐、20mmolDMAP、20mmol乙二胺，以30ml二氧六环为有机溶剂，室温搅 拌反应24h，反应结束后将反应液转移至截留分子量为7kD透析袋中，于使用 二氧六环作为透析介质透析48小时，冷冻干燥，得末端为羧基的泊洛沙姆聚合 物；取10mmol末端为羧基的泊洛沙姆聚合物、30mmol阿霉素、15mmol EDC、 15mmol NHS，溶解在30ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，避光、氮气保护下， 室温搅拌反应24h；反应结束后将反应液转移至透析袋中，使用1000mlDMF作 为透析介质，透析24小时，透析过程中每6小时换一次透析介质；然后换用 1000ml超纯水作为透析介质，透析过程中每6小时换一次透析介质，透析48 小时；透析液真空冷冻干燥48小时，即得泊洛沙姆188-阿霉素偶联物。

实施例3泊洛沙姆188-阿霉素偶联物的合成

泊洛沙姆188-阿霉素偶联物的合成：取10mmol泊洛沙姆188、25mmol丁二 酸酐、20mmolDMAP、20mmol乙二胺，以30ml二氧六环为有机溶剂，室温搅 拌反应24h，反应结束后将反应液转移至截留分子量为7kD透析袋中，于使用 二氧六环作为透析介质透析48小时，冷冻干燥，得末端为羧基的泊洛沙姆聚合 物；取10mmol末端为羧基的泊洛沙姆聚合物、5mmol阿霉素、15mmol EDC、 15mmol NHS，溶解在30ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，避光、氮气保护下， 室温搅拌反应24h；反应结束后将反应液转移至透析袋中，使用1000mlDMF作 为透析介质，透析24小时，透析过程中每6小时换一次透析介质；然后换用 1000ml超纯水作为透析介质，透析过程中每6小时换一次透析介质，透析48 小时；透析液真空冷冻干燥48小时，即得泊洛沙姆188-阿霉素偶联物。

实施例4泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束的制备和表征

泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束制备：以实施例1得到泊洛沙姆188-阿霉 素偶联物100mg溶解于10ml水中，冰浴下高压均质循环2次，0.22μm滤膜过 滤，得到泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束。

表征观察：采用透射电镜(TEM，Hitachi，H-7500，Japan)观察泊洛沙姆188- 阿霉素偶联物胶束，记录胶束的形态及粒径，通过高效液相法测定阿霉素含药 量，观察微观性状和含药量等指标随时间的变化，通过纳米粒度及动电位测定 仪(马尔文Nano ZS90)测定胶束粒径及电位的变化。

表1泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束的表征观察结果

结果如表1和图1所示，泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束(图1b)相对于 泊洛沙姆188胶束(图1a)，形态更圆整，粒径更小且分布均匀，并能保持长时 间稳定，表面电位和含药量随时间变化量小，说明泊洛沙姆188-阿霉素偶联物 胶束稳定性好，适于作为药物的载体。

实施例5泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束的制备

泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束制备：以实施例1得到泊洛沙姆188-阿霉 素偶联物30mg溶解于10ml水中，冰浴下高压均质循环2次，0.22μm滤膜过滤， 得到泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束。

实施例6泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束的制备

泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束制备：以实施例1得到泊洛沙姆188-阿霉 素偶联物300mg溶解于10ml水中，冰浴下高压均质循环2次，0.22μm滤膜过 滤，得到泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束。

实施例7泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束的制备

泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束制备：以实施例1得到泊洛沙姆188-阿霉 素偶联物300mg溶解于10ml水中，探头超声30min，0.22μm滤膜过滤，得到 泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束。

实施例8泊洛沙姆407-阿霉素偶联物的合成

泊洛沙姆407-阿霉素偶联物的合成：取10mmol泊洛沙姆407、25mmmol 丁二酸酐、20mmolDMAP、20mmol乙二胺，以30ml二氧六环为有机溶剂，室 温搅拌反应24h，反应结束后将反应液转移至透析袋中，于二氧六环中透析2天， 冷冻干燥，得末端为羧基的泊洛沙姆聚合物；取10mmol末端为羧基的泊洛沙姆 聚合物、10mmol阿霉素、15mmol EDC、15mmol NHS，溶解在30ml N，N-二甲 基甲酰胺(DMF)中，避光、氮气保护下，室温搅拌反应24h；反应结束后将反 应液转移至截留分子量为7kD透析袋中，于使用二氧六环作为透析介质透析48 小时，冷冻干燥，得末端为羧基的泊洛沙姆聚合物；取10mmol末端为羧基的泊 洛沙姆聚合物、10mmol阿霉素、15mmol EDC、15mmol NHS，溶解在30ml N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，避光、氮气保护下，室温搅拌反应24h；反应结束后 将反应液转移至透析袋中，使用1000mlDMF作为透析介质，透析24小时，透 析过程中每6小时换一次透析介质；然后换用1000ml超纯水作为透析介质，透 析过程中每6小时换一次透析介质，透析48小时；透析液真空冷冻干燥48小 时，即得泊洛沙姆407-阿霉素偶联物。

实施例9泊洛沙姆407-阿霉素偶联物胶束的制备和表征

泊洛沙姆407-阿霉素偶联物胶束的制备：以实施例8得到泊洛沙姆407-阿 霉素偶联物100mg溶解于10ml水中，冰浴下高压均质循环2次，然后用0.22μm 滤膜挤压过滤，即得泊洛沙姆407-阿霉素偶联物胶束。

表征观察：按照实施例4所用方法采用透射电镜(TEM，Hitachi，H-7500， Japan)观察泊洛沙姆-阿霉素偶联物胶束，记录胶束的形态及粒径随时间变化的 结果。

结果见图1：相对于泊洛沙姆188胶束(图1a)，泊洛沙姆407-阿霉素偶联 物胶束(图1c)微观形态圆整，粒径分布均匀，平均粒径为60.4nm，在64h观 察期内保持形态和粒径的稳定，说明泊洛沙姆407-阿霉素偶联物胶束稳定性好， 适于作为药物的载体。

实施例10泊洛沙姆188-阿霉素偶联物(DOX-F68)临界胶束浓度的测定

以实施例1中所得的泊洛沙姆188-阿霉素偶联物(DOX-F68)为对象，以 泊洛沙姆作为对照，采用以下方法测定偶联物的临界胶束浓度(CMC)。

临界胶束浓度(CMC)测定：以芘为荧光探针，芘是一种疏水性芳香化合 物，对环境极敏感。当两亲性分子的浓度低于CMC时，溶液不会形成胶束，芘 溶解在极性的水中；随着两亲性分子的浓度高于CMC时，胶束形成，芘向胶束 内核的疏水部分分配，从而进入非极性环境，继而在其荧光光谱在可以观察到 一系列变化：荧光强度增加，激光光谱(0，0)波段红移。因此，通过以芘的激 发光谱中I339/I333比(激发光谱中波长分别为339nm和333nm的荧光强度比) 对两亲性分子的浓度作图，其线性关系在某一浓度点发生突跃，该点对应浓度 为两亲性分子的表观CMC。

结果见图2，通过对线性关系分析找到突跃点，求出对应浓度，对比泊洛沙 姆188，实施例1中所得的泊洛沙姆188-阿霉素偶联物(DOX-F68)的CMC与泊 洛沙姆188的CMC相比，由0.340mg/mL变为0.050mg/mL，表明泊洛沙姆188-阿 霉素偶联物胶束保持了泊洛沙姆188胶束的自组装性能，在应用环境中不容易因 溶液稀释而影响胶束形态，具有更好的稳定性。

实施例11包载紫杉醇的泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束的制备及紫杉醇含量 测定

包载紫杉醇的泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束的制备工艺：实施例1所得 泊洛沙姆188-阿霉素偶联物20mg，溶解在3ml水中搅拌1h。紫杉醇10mg溶解 在适量乙醇中。然后将二者混合，探头超声30min后，超纯水透析过夜，离心 (3000rpm)，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥后得到包载紫杉醇的泊洛沙姆188- 阿霉素偶联物胶束，于制备后的0月、6月、12月进行紫杉醇的含量测定。

紫杉醇的含量测定：用RP-HPLC方法进行含量测定。流动相为乙睛/35mM 乙酸胺缓冲液(乙酸调至pH5.0)＝50/45(v/v)，色谱柱为(Gemini 5μm C18， 150x4.6mm，phenomenex，Califomia，USA)，流速为1.0ml/min，检测波长为 227nm(SPD-10A，Uvdetector，Shimadzu，Japan)，柱温为30℃，注射样品体积为 20μl，以如下公式计算样品的载药量。

载药量(％)＝(载入胶束的药物量/载体量+药物量)×100％

结果：包载紫杉醇的泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束中紫杉醇的载药量达 30％，载药量数据保持长时间稳定，不随时间延长而出现显著性变化，表明包载 紫杉醇的泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束具有较高的稳定性，适于作为药物的 载体。

实施例12泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束抗肿瘤实验考察

以实施例4中所得的泊洛沙姆188-阿霉素偶联物(DOX-F68)胶束为对象， 应用MTT法，以人肺癌细胞A549为模型观察其抗肿瘤活性。以阿霉素为对照 组。

抗肿瘤实验：将调好浓度的A549细胞以4×10³个/孔的数量接种于96孔细 胞培养板，在37℃5％CO2的细胞培养箱中培养24h。采用MTT细胞毒性检测 试剂盒(凯基生物)检测细胞生存率，使用酶标仪(Spectramax M2，MD，美国) 在570nm测定吸光度，细胞生存率(％)＝(加药细胞吸光值/空白对照细胞吸 光值)×100，将游离DOX及实施例4所得的DOX-Poloxamer188胶束中DOX 浓度与细胞生存率作图，计算得到IC50。

结果：泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束对A549细胞的IC50为10.7μg/ml， 阿霉素对A549细胞的IC50为12.8μg/ml，表明泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束 仍具有较好的抗肿瘤细胞的活性。

实施例13泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束克服肿瘤细胞A549/DOX耐药性实验

肿瘤细胞A549/DOX耐药性实验：为了保持人肺腺癌细胞A549/DOX细胞 的耐药性，需培养在含1μg/ml的培养液中，MTT试验前1周脱药培养。细胞毒 性检测采用MTT法，将调好浓度的A549/DOX细胞以4×10³个/孔的数量接种于 96孔细胞培养板，在37℃5％CO2的细胞培养箱中培养24h。采用MTT细胞毒 性检测试剂盒(凯基生物)检测细胞生存率，使用酶标仪(Spectramax M2，MD，美 国)在570nm测定吸光度，细胞生存率(％)＝(加药细胞吸光值/空白对照细胞 吸光值)×100，将游离DOX及实施例4所得的DOX-Poloxamer188胶束中DOX 浓度与细胞生存率作图，计算得到IC50。

结果见图3：泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束对A549/DOX细胞的IC50为 44.5μg/ml，而阿霉素对A549/DOX细胞的IC50为550.1μg/ml，由此可见，泊洛 沙姆188-阿霉素偶联物胶束提高肿瘤细胞对于阿霉素的敏感性，克服肿瘤细胞 对阿霉素的耐药性。

在上述实施例中，仅对本发明进行了示范性描述，但是本领域技术人员在 阅读本专利申请后可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本发明进行各 种修改。