沙门氏菌肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR焦磷酸法的检测引物试剂盒和检测方法

摘要

本发明公开了一种沙门氏菌肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR焦磷酸法的检测引物试剂盒和检测方法。本发明根据沙门氏菌aceA基因、肠炎沙门氏菌特异序列、鼠伤寒沙门氏菌的STM4599序列中的保守区域，分别设计扩增引物和测序引物，对目标片段进行PCR扩增，再用扩增产物制备单链模板，进行焦磷酸测序，测序引物后前30个碱基序列为GCCTGTGGGTACTTCTCCTGCCAGTATAAT判断样品中含有沙门氏菌，测序引物后前30个碱基序列为CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC和TACAACCGGAGTGCACATTAATCCCGCAGC则分别判断含有肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR-焦磷酸法的检测引物、试剂盒和检测方法。 

背景技术：

沙门氏菌（Salmonella，Sa.）是重要的食源性致病菌之一，在世界各国细菌性食物中毒病例中，Sa引起的食物中毒案例常列榜首或第二位。随着分子生物学的发展，已有针对沙门氏菌invA、16s rRNA、SpvC、invB、fimA、agfA、SEFl4、sefA、sdf、ssaQ、fimY等基因为目标基因，用普通PCR或荧光PCR检测沙门氏菌的报道，虽然这些方法可达到快速、高通量的目的，但却无法获得分子诊断的黄金标准-基因序列，因此有出现假阳性的可能。 

焦磷酸测序（pyrosequencing）技术是近年来发明的一项实时地进行短片段DNA测序技术，该技术在DNA序列分析时不需要电泳和荧光标记，直接测定引物后面的碱基序列，通过提供可靠的序列信息来确认PCR产物，同时由于主要分析PCR产物双链中的一条链的序列，避免了由于DNA链的二级结构造成的人工假象，使测序结果更加准确，目前应用于基因表达病毒检测、SNP分析、耐药基因检测、真菌鉴定、DNA甲基化分析等多个领域。焦磷酸测序是一种基于合成的新型DNA测序技术，在特异引物的引导下，根据待测序列分别加入四种核苷酸，在延伸的过程中释放焦磷酸，后者在ATP硫酸化酶和荧光酶的偶联反应中释放荧光，通过检测器检测相应的荧光强度，从而获得检测样本中的核苷酸序列，是一种非常实用的短序列实时检测技术，定量准确、易于自动化、能实现高通量的大样本的快速检测，具有DNA测序法无法比拟的优势，已应用于临床微生物的分型鉴定及耐药监测。李秀娟等以fimy为目的基因 用PCR-焦磷酸测序法从属的水平上检测159株不同来源的沙门氏菌，但该方法不能区分不同血清型沙门氏菌，文章中也未说明检测的159株沙门氏菌血清型，其特异性有待进一步验证（李秀娟，田会方）。 

发明内容：

本发明的目的是提供简便、快捷、准确性高、特异性强的沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR-焦磷酸法的检测引物、试剂盒和检测方法。 

本发明根据沙门氏菌aceA基因（GenBank:U43344.1）、肠炎沙门氏菌（SE）特异序列（GenBank:AF370707.1）、鼠伤寒沙门氏菌（ST）的STM4599序列（GenBank:AERV01000023.1），分别设计扩增引物和测序引物，建立了结合PCR-焦磷酸测序从DNA序列水平上检测沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的方法，从而实现了本发明的目的。 

本发明的沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR-焦磷酸法的检测引物，其特征在于包括PCR引物和测序引物： 

针对沙门氏菌的PCR引物： 

5’-TCACCGAAAGACCAACAGAA-3’；（如SEQ ID NO.1所示） 

5’-GGTGGAACTCGCTGAAATGA-3’；（如SEQ ID NO.2所示） 

测序引物：5’-CGAAAGACCAACAGAAG-3’；（如SEQ ID NO.3所示） 

针对肠炎沙门氏菌的PCR引物： 

5’-GCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTAT-3’；（如SEQ ID NO.4所示） 

5’-TCGTTCTTCTGGTACTTACGATGA-3’；（如SEQ ID NO.5所示） 

测序引物：5’-AAAAAGGTTTAGTAAATCAG-3’；（如SEQ ID NO.6所示） 

针对鼠伤寒沙门氏菌的PCR引物： 

5’-AAGCTAAGTGTGGGGGCTAGTAT-3’；（如SEQ ID NO.7所示） 

5’-GGGTTTGTTTTTGATGATACAGG-3’；（如SEQ ID NO.8所示） 

测序引物：5’-AGTATTGATAAATAATGGTT-3’；（如SEQ ID NO.9所示）。 

本发明的第二个目的是提供沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR-焦磷酸法的检测试剂盒，包括DNA提取试剂，PCR反应试剂，单链模板制备试剂，焦磷酸测序试剂，PCR引物和测序引物，其特征在于，所述的PCR引物和测序引物为： 

针对沙门氏菌的PCR引物： 

5’-TCACCGAAAGACCAACAGAA-3’；（如SEQ ID NO.1所示） 

5’-GGTGGAACTCGCTGAAATGA-3’；（如SEQ ID NO.2所示） 

测序引物：5’-CGAAAGACCAACAGAAG-3’；（如SEQ ID NO.3所示） 

针对肠炎沙门氏菌的PCR引物： 

5’-GCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTAT-3’；（如SEQ ID NO.4所示） 

5’-TCGTTCTTCTGGTACTTACGATGA-3’；（如SEQ ID NO.5所示） 

测序引物：5’-AAAAAGGTTTAGTAAATCAG-3’；（如SEQ ID NO.6所示） 

针对鼠伤寒沙门氏菌的PCR引物： 

5’-AAGCTAAGTGTGGGGGCTAGTAT-3’；（如SEQ ID NO.7所示） 

5’-GGGTTTGTTTTTGATGATACAGG-3’；（如SEQ ID NO.8所示） 

测序引物：5’-AGTATTGATAAATAATGGTT-3’；（如SEQ ID NO.9所示）。 

本发明的第三个目的是提供一种非诊断目的的沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏 菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 

（1）对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板； 

（2）分别使用上述PCR引物分别进行PCR反应，回收PCR产物，制备单链模版，然后应用上述测序引物对相应的PCR产物进行焦磷酸测序，自测序引物3\端后的第一个碱基开始测序，当前30个碱基序列为GCCTGTGGGTACTTCTCCTGCCAGTATAAT时，判断样品中含有沙门氏菌，当前30个碱基序列为CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC时，判断样品中含有肠炎沙门氏菌，当前30个碱基序列为TACAACCGGAGTGCACATTAATCCCGCAGC时，判断样品中含有鼠伤寒沙门氏菌。 

所述的样品可以为食品，肉制品，如猪肉，和海鲜，如售卖的对虾。 

优选，所述的PCR反应，其扩增体系为50μL，PCR Mix Buffer 25μl，Taq酶5μl，MgCl₂ 1μl，10μM上、下游引物各2μl，DNA模板1μl，去离子水14μl，PCR反应条件为预变性95℃5min；95℃15s，65℃30s,，72℃30s，45个循环；72℃12min。 

本发明根据沙门氏菌（Sa）aceA基因、肠炎沙门氏菌（SE）特异序列、鼠伤寒沙门氏菌（ST）的STM4599序列中的保守区域，分别设计扩增引物和测序引物，建立了PCR-焦磷酸测序，从DNA碱基序列水平上检测Sa、SE和ST的方法。本发明先对目标片段进行PCR扩增，保证扩增片段的特异性，再用扩增产物制备单链模板，在测序引物的引导下进行焦磷酸测序。检测的所得碱基序列与已知序列比对判断结果，即测序引物后前30个碱基序列为GCCTGTGGGTACTTCTCCTGCCAGTATAAT，判断样品中含有沙门氏菌，测序引物后前30个碱基序列为为CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC和TACAACCGGAGTGCACATTAATCCCGCAGC，则分别判断含有肠炎沙门氏菌（SE）和鼠伤寒沙门氏菌（ST）。PCR扩增实验结果， aceA、SE和ST扩增引物具有较好的特异性，24株不同血清型Sa、16株SE和6株ST分别扩增出大小81bp、176bp和131bp的DNA片段，而其他对照菌株未扩增出DNA条带。焦磷酸测序结果显示，24株Sa、16株SE和6株ST的测序有效DNA碱基数分别为31bp-36bp、31bp-39bp、34bp-36bp，均超过需检测的30bp DNA碱基序列，而其他对照菌株未测出DNA碱基序列。模拟样品检测结果，焦磷酸测序法与传统检测方法一致，但在检测周期上，传统方法需要培养、划线分离、生化鉴定、血清分型等，需要5d-6d，而焦磷酸测序方法BP第一次增菌10h，TTB第二次增菌18h，核酸提取、PCR扩增和焦磷酸测序3h，整个试验31h完成，简便快捷，而且可通过DNA碱基序列从属的水平上检测沙门氏菌的同时可对其分型，判定所检测Sa是否为SE和ST血清型，避免了单纯PCR扩增检测易污染造成的假阳性结果，准确性高。因此本发明具有较好的应用前景。 

附图说明：

图1是24株Sa的aceA扩增产物电泳图，其中M：50bp marker，1：SE ATCC13076，2：ST ATCC14028，3-24：Sa1-Sa22； 

图2是Sa的aceA特异性实验扩增产物电泳图，其中M：50bp maker，1：SE ATCC13076，2：ST ATCC14028，3：阪崎肠杆菌ATCC29544，4：大肠杆菌ATCC25922，5：小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221，6：金黄色葡萄球菌ATCC6538，7：痢疾志贺氏菌NICPBP51252，8：单增李斯特菌ATCC19115，9：肺炎克雷伯氏菌CMCC46102，10:去离子水； 

图3是SE的扩增产物电泳图，其中M：50bpmaker，1：SE ATCC13076，2-16：SE1-SE15，17：去离子水； 

图4是SE特异性实验扩增产物电泳图，其中M：50bp maker，1：SE ATCC13076，2：ST  ATCC14028，3：阪崎肠杆菌ATCC29544，4：大肠杆菌ATCC25922，5：小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221，6：金黄色葡萄球菌ATCC6538，7：痢疾志贺氏菌NICPBP51252，8：单增李斯特菌ATCC19115，9：肺炎克雷伯氏菌CMCC46102，10:去离子水； 

图5是SE特异性实验扩增产物电泳图，其中M：50bp maker，1：SE ATCC13076，2-23：Sa1-Sa22，24：去离子水； 

图6是ST扩增产物电泳图，其中M：50bp maker，1：ST ATCC14028，2-6：ST1-ST5，7：去离子水； 

图7是ST特异性实验扩增产物电泳图，其中M：50bp maker，1：ST ATCC14028，2：SE ATCC13076，3：阪崎肠杆菌ATCC29544，4：大肠杆菌ATCC25922，5：小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221，6：金黄色葡萄球菌ATCC6538，7：痢疾志贺氏菌NICPBP51252，8：单增李斯特菌ATCC19115，9：肺炎克雷伯氏菌CMCC46102，10：副溶血性弧菌ATCC33847,11：去离子水； 

图8是ST特异性实验扩增产物电泳图，其中M：50bp maker，1：ST ATCC14028，2-23：Sa1-Sa22，24：去离子水； 

图9是Sa3焦磷酸测序结果图； 

图10是阴性对照（单增李斯特氏菌）焦磷酸测序结果图； 

图11是SE2焦磷酸测序结果图； 

图12是ST2焦磷酸测序结果图； 

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。 

实施例1： 

1、材料和方法 

1.1菌株来源 

24种不同血清型沙门氏菌44株，其中SE、ST标准菌株各1株，不同食品中分离的非SE、非ST不同血清型Sa25株，SE分离株15株，ST分离株5株，菌株信息见表1。阴性对照菌株8株，分别为单增李斯特菌ATCC19115、金黄色葡萄球菌ATCC6538、阪崎肠杆菌ATCC29544、大肠杆菌ATCC25922、痢疾志贺氏菌NICPBP51252、小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102、副溶血性弧菌ATCC33847。上述菌株来自中国普通微生物菌种保藏管理中心、广东省疾病预防控制中心、中国检验检疫科学研究院、广东出入境检验检疫局技术中心。所有菌株均经VITEK2和API试剂条以及血清学实验进行确证。 

表1：沙门氏菌（Sa）菌株信息 

1.2主要仪器和试剂 

焦磷酸测序PyroMark lD系统-瑞典Biotage公司；PCR扩增仪-美国伯乐2400型；核酸提取仪-日本PSS公司；PCR用Buffer、dNTP、琼脂糖、PCR分子量标记（50-500bp）Taq酶-宝生物工程(大连)有限公司；缓冲蛋白胨水（BP）、TTB增菌液-北京陆桥有限公司。 

1.3引物和探针设计 

根据GenBank公布的Sa aceA gene（序列号:GenBank:U43344.1），SE特异序列（GenBank:AF370707.1），ST的STM4599序列（GenBank:AERV01000023.1）中的保守区域，用PyroMark Assay Design2.0软件设计PCR引物和测序引物，每对下游引物5/端标记生物素，委托大连宝生物有限公司合成。沙门氏菌(Sa)aceA基因、SE和ST扩增PCR引物和测序引物设计见表2。 

表2：沙门氏菌引物和测序引物序列 

1.4模板制备 

所有菌株均用BP缓冲蛋白胨水37℃培养10h，取10ml接种于TTB增菌液，44.5℃培养18h，取1ml菌悬液移入离心管，12000r/min离心8min去上清，用1ml去离子水漂浮沉淀，12000r/min离心5min去上清，重复两次，最后加200μl去离子水在核酸提取仪上提取DNA，用于PCR扩增。 

1.5PCR扩增体系及电泳参数 

扩增体系50μL，PCR Mix Buffer 25μl，Taq酶5μl，MgCl₂ 1μl，10μM上、下游引物各2μl（每个细菌或者样品分别应用上述针对Sa aceA gene、SE和ST的PCR引物分别进行PCR扩增），DNA模板1μl，去离子水14μl。循环参数为预变性95℃5min；95℃15s，65℃30s,，72℃30s，45个循环；72℃12min，4℃保存。PCR产物一部分在2%琼脂糖凝胶上电泳，另一部分用于焦磷酸测序。 

1.6单链模板制备及焦磷酸测序 

将15μl PCR产物转移至96孔PCR板中，加入2μl磁珠（sepharose beads），20μl结合缓冲液(Binding Buffer)和43μl纯水，常温震荡混20min；打开真空泵，将真空预装工具prep tool在高纯水中清洗30秒，然后将prep tool移到96孔PCR板中，抓取其中的磁珠，待磁珠基本抓取完毕后将携带有磁珠的prep tool放入70％乙醇中5秒，再分别在变性缓冲液Denaturation Buffer和洗涤缓冲液Washing Buffer中各清洗20s～30s。再prep tool放在装有退火预混液PSQ96(预先加入43μl退火缓冲液Annealing Buffer和2μl 10μM测序引物，相对应的PCR产物用相对应的测序引物）板的上方，关掉真空泵，轻轻摇动释放磁珠，将PSQ96板在80℃放置5min，自然冷却至室温。测序程序采用SQA模式，按ATCG的碱基排列顺序，依次循 环加入15次，根据软件给出的剂量在试剂仓中加入底物混合物、酶混合物和4种脱氧核糖核苷酸，将PSQ96孔板和试剂仓放入PyroMark lD系统中进行焦磷酸测序。 

1.7模拟样品检测 

用均质袋分别秤取25g猪肉、对虾，每份样品中加入225ml缓冲蛋白冻水，分别加入1ml已调好浓度的10² cfu/ml SE ATCC13076和ST ATCC14028菌悬液，用拍打器拍打20min，37℃培养10h，取10ml移入90ml TTB增菌液，44.5℃培养18h，然后取一部分按上述步骤提取DNA进行PCR-焦磷酸法检测，另一部分按GB4789.4-2010《食品卫生微生物检验沙门氏菌》继续进行检测。 

2 结果与分析 

2.1PCR扩增结果 

Sa aceA基因的PCR扩增结果，24株不同血清型沙门氏菌，即SE、ST标准株各1株、22株不同血清型沙门氏菌Sa1-Sa22均扩增出81bp大小的DNA片段（图1），而单增李斯特菌ATCC19115、金黄色葡萄球菌ATCC6538、阪崎肠杆菌ATCC29544、大肠杆菌ATCC25922、痢疾志贺氏菌NICPBP51252、小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102 7株对照菌株未见扩增条带（图2）；SE的PCR扩增结果，1株SE标准株和SE1-SE15，共16株SE均扩增出176bp大小的DNA片段（图3），而ST ATCC14028、单增李斯特菌ATCC19115、金黄色葡萄球菌ATCC6538、阪崎肠杆菌ATCC29544、大肠杆菌ATCC25922、痢疾志贺氏菌NICPBP51252、小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102 7株对照菌株以及Sa1-Sa22均未出见扩增条带（图4，图5）；ST的PCR扩增结果，1株ST标准株和ST1-ST5，6株ST均扩增出131bp大小的DNA片段（图6）， 而SE ATCC13076、单增李斯特菌ATCC19115、金黄色葡萄球菌ATCC6538、阪崎肠杆菌ATCC29544、大肠杆菌ATCC25922、痢疾志贺氏菌NICPBP51252、小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102、副溶血性弧菌ATCC33847 8株对照株以及Sa1-Sa22均未见扩增带（图7，图8），表明Sa aceA、SE及ST的PCR引物具有较好的特异性。 

2.2焦磷酸测序结果 

24株Sa焦磷酸测序结果，即SE、ST标准株各1株和Sa1-Sa25，分别测出33bp-36bp大小的DNA碱基序列（表3、图9，本发明只列出Sa3的焦磷酸测序结果图），而单增李斯特菌ATCC19115、金黄色葡萄球菌ATCC6538、阪崎肠杆菌ATCC29544、大肠杆菌ATCC25922、痢疾志贺氏菌NICPBP51252、小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102 7株对照株未测出DNA碱基序列（图10，只列出单增李斯特氏菌测序图）。SE焦磷酸测序结果测出39bp-43bp大小的DNA碱基序列（表4，图11，只列出SE2的焦磷酸测序结果图）；ST焦磷酸测序结果测出36bp-38bp大小的DNA碱基序列（表5、图12，只列出ST2的焦磷酸测序结果图），而在SE和ST焦磷酸测序中发现，23株不同血清型Sa和单增李斯特菌ATCC19115、金黄色葡萄球菌ATCC6538、阪崎肠杆菌ATCC29544、大肠杆菌ATCC25922、痢疾志贺氏菌NICPBP51252、小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102、副溶血性弧菌ATCC33847 8株对照株均未测出DNA序列。Sa、SE、ST测序DNA碱基序列分别与表3、图4、图5中测序引物后的DNA序列比对，发现比对结果完全吻合的DNA碱基数分别为31bp-36bp、31bp-39bp、34bp-36bp，所有测序结果均超过30个碱基，表明3条测序引物的特异性均较好，并且可用测序引物序列后的GCCTGTGGGT A CTTCTCCTG CCAGTATAAT、CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC和TACAACCGGA GTGCACATTA AT CCCGCAGC碱基序列特异性地检测Sa、SE和ST。 

焦磷酸测序是测序引物3\端后的第一个碱基开始测序，用NCBI的BLAST功能反复比对时发现，Sa aceA、SE和ST测序引物后的30个DNA碱基序列可分别鉴定Sa、SE和ST。判断原则为：碱基序列为GCCTGTGGGTACTTCTCCTGCCAGTATAAT则判断为Sa，碱基序列为CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC和TACAACCGGA GTGCACATTA ATCCCGCAGC，判断为SE和ST。 

表3：沙门氏菌测序检测结果 

表4：SE焦磷酸测序结果 

表5：ST焦磷酸测序结果 

2.3模拟样品焦磷酸测序检测结果，添加SE ATCC13076、ST ATCC14028的猪肉、对虾样品，分别用针对沙门氏菌的PCR引物：5’-TCACCGAAAGACCAACAGAA-3’；5’-GGTGGAACTCGCTGAAATGA-3’；测序引物：5’-CGAAAGACCAACAGAAG-3’。针对肠炎沙门氏菌的PCR引物：5’-GCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTAT-3’；5’-TCGTTCTTCTGGTACTTACGATGA-3’；测序引物：5’-AAAAAGGTTTAGTAAATCAG-3’。针对鼠伤寒沙门氏菌的PCR引物：5’-AAGCTAAGTGTGGGGGCTAGTAT-3’；5’-GGGTTTGTTTTTGATGATACAGG-3’；测序引物：5’-AGTATTGATAAATAATGGTT-3’。分别按照上述方法进行PCR-焦磷酸反应。结果显示，添加SE ATCC13076的样品（猪肉和对虾样品）扩增出CCTGTTGTCT GCTCACCATT CGCCAGCCAC CACCTCGAG（针对SE）和GCCTGTGGGT ACTTCTCCTG CCAGTATAAT TTCAGG（针对Sa），添加ST 14028的样品（猪肉和对虾样品）扩增出TACAACCGGA GTGCACATTA ATCCCGCAGC GTAAAGAC（针对ST）和GCCTGTGGGT ACTTCTCCTG CCAGTATAAT TTCAGG（针对Sa）。由此可见，样品中检测出与预期相符的SE和ST的DNA碱基序列，即CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC和TACAACCGGA GTGCACATTA AT CC CGCAGC，同时4份样品中也检测出Sa aceA基因DNA碱基序列，GCCTGTGGGT ACTTCTCCTG CCAGTATAAT。按照GB4789.4-2010《食品微生物学检验沙门氏菌检验》检测的模拟样品，均分离鉴定出与添加的菌株相符的SE、ST，结果与本发明的PCR-焦磷酸法的结果一致。