一种植生拉乌尔菌及其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法

摘要

本发明公开了一种植生拉乌尔菌及其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法。该植生拉乌尔菌菌株名为Raoultella planticola VP4-4，保藏号为CCTCC M 2012005，其16SrRNA序列全长1408bp，其16S rRNA序列与Raoultella planticola的相似度达到99.563%。该方法是利用该菌株，通过菌种活化、制备种子培养液、发酵培养、转化发酵液，以得到高浓度香兰素发酵液。本发明的优选方案，碳源、氮源成本很低，来源广泛易得，其发酵液中天然香兰素浓度大、产量较高。生产工艺过程简单，条件温和，环境友好，有工业化前景，具备良好的社会效益和经济效益。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体地涉及一种植生拉乌尔菌及其生物 转化阿魏酸生产天然香兰素的方法。

背景技术

香兰素(Vanillin)，又名香草醛、香兰醛等，是香荚兰豆中的主要成 分，化学名为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，相对分子量为152.15。香兰素 外观为白色至微黄色针状结晶或粉末，呈香荚兰豆特有的香气，微甜 ，在潮湿的空气中缓慢氧化为香兰酸。

香兰素是世界上产量最大、用途最广的香料之一，被誉为“香料之王 ”，广泛应用于巧克力、冰淇淋、糖果等食品以及香烟、饮料和高档 化妆品中。它不仅可以用作增香剂和定香剂，还在食品中用作防腐剂 、保鲜剂和抗氧化剂。香兰素的世界年消费量约1.2万吨，而天然香兰 素的产量仅为1800吨，因此远不能满足需求。

目前常用的香兰素生产方法有植物原料提取法和化学合成法。香兰素 在香荚兰豆中含量约为15~20g/kg。香荚兰种植受地域和气候环境的限 制产量极少，且在种植过程中需要对花朵进行人工授粉、劳动强度大 ，难以进行大规模栽种，远远不能满足市场的需求。目前市场上绝大 多数的香兰素产品是通过化学合成的，常用合成底物包括丁香酚、木 质素、乙醛酸和愈创木酚等。国内常用的是采用愈创木酚和乌洛托品 反应的亚硝化工艺，该方法路长，分离过程复杂，收率低，环境污染 严重，原料消耗高，国外早已被淘汰。国外主要采用愈创木酚和乙醛 酸缩合工艺，该工艺设备简单，产物纯度高，原料来源广泛，但是存 在严重的缺陷，比如环境污染严重，产品香气单一，易掺杂质，合成 香兰素的安全性也受到质疑。

生物转化法是在细胞或酶等生物催化下进行的化学反应，既是指利用 微生物（微生物的生长细胞、微生物的休止细胞）、酶（来自微生物 或动植 物的纯酶或粗酶）或植物细胞，通过简单的生物转化或生物合成制备 所需物质的方法。与化学催化剂相比，生物催化剂专一性更强、催化 活性更高、条件更易控制。可接受大量的外源复杂分子作为底物，化 学选择性、区域选择性、立体选择性或对映选择性的催化底物生成相 应的产物。用生物转化法生产的香兰素与植物提取的天然香兰素等同 （Natural-identical vanillin），被称为生物香兰素（Bilogic  Vanillin）。许多天然物质如阿魏酸、1,2-二苯乙烯酚、丁香酚、木 质素、异丁香酚等都可以作为生物转化生产香兰素的前体物质。利用 微生物发酵的方法，模拟酶在香荚兰中讲解阿魏酸衍生物时产生香兰 素的过程而得的“natural vanillin”，符合EU和FDA对天然香精的 使用安全要求。

关于用多种微生物发酵法将阿魏酸转化为香兰素已有报道，培养基成 分较为复杂，生产成本较高，副产物较多包括香兰酸、香兰醇和愈创 木酚等，给产品分离提取带来了相当的困难。经文献检索，未发现与 本发明内容相同文献的公开报道。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明要解决的技术问题是提供一株植生 拉乌尔菌及用此植生拉乌尔菌生物转化阿魏酸来生产天然香兰素的方 法。

本发明提供一种植生拉乌尔菌，该菌株名为Raoultella planticola  VP4-4，于2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心 ，保藏号为CCTCC M 2012005，植生拉乌尔菌Raoultella plantic ola VP4-4 CCTCC M 2012005的生物学特征是：革兰氏阴性菌，能 产酸、使牛奶液化并生成吲哚产生、赖氨酸脱羧酶实验呈阳性；鸟氨 酸脱羧酶实验、H2S产生、明胶液化呈阴性；能以单糖，多糖、酯类和 氨基酸为唯一碳源生长，

所述植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4的分子鉴定特征为 ：其16SrRNA序列全长1408bp，16S rRNA序列与Raoultella planti cola的相似度达到99.563%。

本发明提供一种利用植生拉乌尔菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素的 方法，其步骤如下：

1）菌种活化：取植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CC TCC M  2012005接种到斜面培养基上，在25~38℃条件下，静置培养24~72h后 得到活化菌种；

2）制备种子培养液：将步骤1）中所得的斜面培养物，接种到种子培 养基，在25~38℃条件下，100~150rpm/min振荡培养24h~72h，连续转 接1~3次，制得种子培养液；

3）发酵：将步骤2）中所得的种子培养液，按体积百分比2~20%的接种 量接入发酵培养基，在32~40℃条件下，100~200rpm/min振荡培养24~ 72h；

4）转化：向步骤3）中所得的发酵液，加入2~10g/L的阿魏酸，在30~ 40℃条件下，100~200rpm/min振荡避光培养1~7天后停止；

5）将步骤4）中所得发酵液，在8000~10000rpm/min条件下，12~15mi n离心处理，收集上清液，得到淡黄色天然香兰素发酵液；所得到的天 然香兰素发酵液浓度可达1.2~2.1g/L，转化率为15.12~27.15%。

优选地，所述步骤1）中，斜面培养基：麦芽汁：120mL，蔗糖：20g/ L，琼脂：15g/L。

优选地，所述步骤2）中种子培养基：麦芽糖：50g/L，蛋白胨：10g/ L，氯化钠：5g/L。

优选地，所述步骤3）中，所述发酵培养基：碳源：5~20g/L，氮源： 1~3g/L，KNO₃：1~3g/L，NaCl：0.5~1.5g/L，K₂HPO₄：0.5~1.5g/L， MgSO₄·7H₂O：0.5~1.5g/L，FeSO₄·7H₂O：0.01~0.05g/L，调节pH： 3~10。

优选地，所述碳源为淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麦芽糖、麦芽浸 粉、麸皮和谷壳之中一种或多种。碳源最优选为麦芽浸粉。

优选地，所述氮源为豆粕、黄豆饼粉、牛肉膏、蛋白胨（Arg）、酵母 粉、大豆蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵和磷酸铵之中的一种或多 种。氮源最优选为蛋白胨（Arg）。

本发明研究的理论依据：

1.不同碳源、氮源和无机盐对香兰素产量的影响

以高氏一号培养基为基础培养基，对其中的碳源、氮源和无机盐进行 单因素实验，筛选出产香兰素最大的碳源、氮源和无机盐。

1.1不同碳源对天然香兰素产量的影响

以高氏一号培养基为基础培养基，固定氮源和无机盐，分别以淀粉、 葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麦芽糖、麦芽浸粉、麸皮和谷壳作为碳源， 浓度均为20g/L。由图1可知，不同碳源对香兰素产量影响由高到低依 次是麦芽浸粉、空白（淀粉）、谷壳、蔗糖、麸皮、麦芽糖、葡萄糖 和果糖。果糖明显不利于香兰素的产生，缓效碳源比速效碳源更易于 香兰素的产生，缓效碳源中的复合碳源麦芽浸粉和谷壳可能由于其中 含有生长因子而比单一碳源更易于香兰素的产生。其中以麦芽浸粉为 碳源时产生的香兰素含量最高。

1.2不同氮源发酵生产天然香兰素的产量

以高氏一号培养基为基础培养基，固定碳源和无机盐，分别以酵母粉 、黄豆饼粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、动物蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、 磷酸铵和豆粕作为氮源，浓度均为1g/L。由图2可知，不同氮源对香兰 素产量的影响有高到低依次是蛋白胨（Arg）、空白、牛肉膏、酵母粉 、磷酸铵、蛋白胨（Pep）、硝酸铵、硫酸铵、豆粕、黄豆饼粉。有机 氮源中黄豆饼粉不利于香兰素的产生。以蛋白胨(Arg)作为氮源时比空 白产生的香兰素更多。

1.3不同无机盐离子发酵生产天然香兰素的产量

以高氏一号培养基为基础，固定碳源和氮源，分别以磷酸氢二钠、七 水硫酸镁、七水硫酸亚铁、磷酸氢二钾、氯化钙作为无机盐，浓度均 为0.5g/L。由图3可知，以钠离子、钾离子、钙离子作为无机盐离子时 香兰素的产量均很低，而以铁离子为无机盐时香兰素的产量高于其它 无机盐。

1.4最佳碳源氮源和无机盐相对含量的确定-正交试验

根据单因素实验结果分析，最佳碳源：麦芽浸粉；最佳氮源：大豆蛋 白胨；最佳无机盐：硫酸亚铁。选择麦芽浸粉、大豆蛋白胨和硫酸亚 铁对香兰素产量影响较大的因素进行正交试验，确定它们的最佳配比 ，采用L9（34）正交表，水平和因素安排见表1、表2。

根据表2中极差R值可判断谷壳对香兰素产生是主要影响因素，三个因 素对香兰素产量的影响顺序：硫酸亚铁＞麦芽浸粉＞大豆蛋白胨，根 据结果可知最佳组合为A₂B₃C₁。

表1正交设计因素表

表2正交设计实验表及结果

2.培养条件的优化

2.1pH对香兰素产量的影响

使用优化后的培养基，考察了初始培养基pH3~9对香兰素产量的影响。 由图4可以看出，初始培养基pH3~5香兰素的产量较低，初始培养基pH 6~10香兰素的产量相对较高，说明初始培养基在中性及偏碱性条件下 更有利于VP4-3将阿魏酸转化为香兰素，且当pH值为8时香兰素的浓度 最高。

2.2不同发酵温度对香兰素产量的影响

使用优化的培养基（pH=8.0），考察了发酵温度对香兰素产量的影响 。由图5可以看出，当温度在30℃~37℃之间时，香兰素的产量逐渐升 高；当温度在37~40℃时，香兰素的产量显著降低。当温度在37℃时， 发酵液中的香兰素浓度最高。

2.3接种量、底物添加量和底物添加时间对香兰素产量的影响

在上述优化的培养条件下，选取L9(34)正交表，考察了菌种接种量、 底物添加量和底物添加时间对香兰素产量的影响。试验因素和水平设 计见表3，试验结果方差分析见表4。结果表明，三个因素对香兰素产 量的影响顺序为阿魏酸加入量>阿魏酸加入时间>菌种接种量，三因素 最佳组合为菌种接种量为10%，底物添加量为8.5g/L，底物添加时间为 48h。

表3正交设计因素和水平表

表4正交设计实验表和结果分析

本发明的优点是：利用植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4- 4 CCTCC M2012005生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法，本发明 的优选方案，碳源、氮源成本很低，来源广泛易得，其发酵液中天然 香兰素浓度大、产量较高，所得到的天然香兰素发酵液浓度可达1.2~ 2.1g/L，转化率为15.12~27.15%；生产工艺过程简单，条件温和，环 境友好，有工业化前景，具备良好的社会效益和经济效益。

附图说明

图1不同碳源发酵生产天然香兰素的产量比较图；

图2不同氮源发酵生产天然香兰素的产量比较图；

图3不同无机盐离子发酵生产天然香兰素的产量比较图；

图4不同发酵培养基初始pH值下生产天然香兰素的产量比较图；

图5不同发酵温度生产天然香兰素的产量比较图。

具体实施方式

下面列举一部分实施例对本发明的有关技术问题作进一步详细的描述 ，有必要在此指出以下具体实施例只是对本发明的进一步说明，不代 表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的 修改和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

本发明的微生物植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CCT CC M 2012005发酵生产天然香兰素的方法如下：

1）菌种活化：取植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CC TCC M 2012005接种到斜面培养基上，在28℃条件下，静置培养24h 后得到活化菌种，置于4℃冰箱中；

所述斜面培养基：麦芽汁：120mL，蔗糖：20g/L，琼脂：15g/L，121 ℃条件下灭菌20min；

2）制备种子培养液：将步骤1）中所得的斜面培养物，接种到种子培 养基，在32℃条件下，120rpm/min振荡培养24h，连续转接2次，制得 种子培养液；

所述种子培养基：麦芽糖：50g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠：5g/L， 121℃条件下灭菌20min；

3）发酵：将步骤2）中所得的种子培养液，按体积百分比8%的接种量 接入发酵培养基，在32℃条件下，100rpm/min振荡培养72h；

所述发酵培养基：蔗糖：10g/L，酵母粉：3g/L，KNO₃：1g/L，NaCl： 0.8g/L，K₂HPO₄：0.8g/L，MgSO₄·7H₂O：0.6g/L，FeSO₄·7H₂O：0. 02g/L，调节pH至6；121℃条件下灭菌20min；

4）转化：向步骤3）中所得的发酵液，加入4.2g/L的阿魏酸，在32℃ 条件下，150rpm/min振荡避光培养3天后停止；

5）将步骤4）中所得发酵液，在8000rpm/min条件下，12min离心处理 ，收集上清液，得到淡黄色天然香兰素发酵液；所得到的天然香兰素 发酵液浓度可达1.8g/L，转化率为19.32%。

实施例2

本发明的微生物植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CCT CC M 2012005发酵生产天然香兰素的方法如下：

1）菌种活化：取植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CC TCC M 2012005接种到斜面培养基上，在35℃条件下，静置培养48h 后得到活化菌种，置于4℃冰箱中；

所述斜面培养基：麦芽汁：120mL，蔗糖：20g/L，琼脂：15g/L，121 ℃条件下灭菌20min；

2）制备种子培养液：将步骤1）中所得的斜面培养物，接种到种子培 养基，在32℃条件下，150rpm/min振荡培养48h，连续转接3次，制得 种子培养液；

所述种子培养基：麦芽糖：50g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠：5g/L， 121℃条件下灭菌20min；

3）发酵：将步骤2）中所得的种子培养液，按体积百分比8%的接种量 接入发酵培养基，在35℃条件下，120rpm/min振荡培养72h；

所述发酵培养基：麦芽糖：15g/L，牛肉膏：2g/L，KNO₃：2g/L，NaC l：1.0g/L，K₂HPO₄：1.0g/L，MgSO₄·7H₂O：0.5g/L，FeSO₄·7H₂O： 0.03g/L，调节pH至7；121℃条件下灭菌20min；

4）转化：向步骤3）中所得的发酵液，加入7.5g/L的阿魏酸，在35℃ 条件下，140rpm/min振荡避光培养2天后停止；

5）将步骤4）中所得发酵液，在10000rpm/min条件下，15min离心处理 ，收集上清液，得到淡黄色天然香兰素发酵液；所得到的天然香兰素 发酵液浓度可达1.5g/L，转化率为18.52%。

实施例3

本发明的微生物植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CCT CC M 2012005发酵生产天然香兰素的方法如下：

1）菌种活化：取植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CC TCC M 2012005接种到斜面培养基上，在38℃条件下，静置培养72h 后得到活化菌种，置于4℃冰箱中；

所述斜面培养基：麦芽汁：120mL，蔗糖：20g/L，琼脂：15g/L，121 ℃条件下灭菌20min；

2）制备种子培养液：将步骤1）中所得的斜面培养物，接种到种子培 养基，在38℃条件下，100rpm/min振荡培养72h，连续转接1次，制得 种子培养液；

所述种子培养基：麦芽糖：50g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠：5g/L， 121℃条件下灭菌20min；

3）发酵：将步骤2）中所得的种子培养液，按体积百分比8%的接种量 接入发酵培养基，在35℃条件下，120rpm/min振荡培养72h；

所述发酵培养基：淀粉：10g/L，磷酸铵：1g/L，KNO₃：1g/L，NaCl： 1.5g/L，K₂HPO₄：1.5g/L，MgSO₄·7H₂O：1.5g/L，FeSO₄·7H₂O：0. 05g/L，调节pH至8；121℃条件下灭菌20min；

4）转化：向步骤3）中所得的发酵液，加入9.2g/L的阿魏酸，在38℃ 条件下，180rpm/min振荡避光培养7天后停止；

5）将步骤4）中所得发酵液，在12000rpm/min条件下，15min离心处理 ，收集上清液，得到淡黄色天然香兰素发酵液；所得到的天然香兰素 发酵液浓度可达2.01g/L，转化率为25.34%。

实施例4

本发明的微生物植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CCT CC M 2012005发酵生产天然香兰素的方法如下：

1）菌种活化：取植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CC TCC M 2012005接种到斜面培养基上，在20℃条件下，静置培养48h 后得到活化菌种，置于4℃冰箱中；

所述斜面培养基：麦芽汁：120mL，蔗糖：20g/L，琼脂：15g/L，121 ℃条件下灭菌20min；

2）制备种子培养液：将步骤1）中所得的斜面培养物，接种到种子培 养基，在25℃条件下，120rpm/min振荡培养72h，连续转接2次，制得 种子培养液；

所述种子培养基：麦芽糖：50g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠：5g/L， 121℃条件下灭菌20min；

3）发酵：将步骤2）中所得的种子培养液，按体积百分比15%的接种量 接入发酵培养基，在40℃条件下，150rpm/min振荡培养48h；

所述发酵培养基：麦芽浸粉：10g/L，蛋白胨：2g/L，KNO₃：1g/L，N aCl：0.5g/L，K₂HPO₄：1.0g/L，MgSO₄·7H₂O：1.5g/L，FeSO₄·7H₂O：0.05g/L，调节pH至10；121℃条件下灭菌20min；

4）转化：向步骤3）中所得的发酵液，加入5/L的阿魏酸，在30℃条件 下，130rpm/min振荡避光培养4天后停止；

5）将步骤4）中所得发酵液，在8000rpm/min条件下，15min离心处理 ，收集上清液，得到淡黄色天然香兰素发酵液；所得到的天然香兰素 发酵液浓度可达1.82g/L，转化率为20.03%。

实施例5

本发明的微生物植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CCT CC M 2012005发酵生产天然香兰素的方法如下：

1）菌种活化：取植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CC TCC M 2012005接种到斜面培养基上，在25℃条件下，静置培养36h 后得到活化菌种，置于4℃冰箱中；

所述斜面培养基：麦芽汁：120mL，蔗糖：20g/L，琼脂：15g/L，121 ℃条件下灭菌20min；

2）制备种子培养液：将步骤1）中所得的斜面培养物，接种到种子培 养基，在30℃条件下，150rpm/min振荡培养24h，连续转接3次，制得 种子培养液；

所述种子培养基：麦芽糖：50g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠：5g/L， 121℃条件下灭菌20min；

3）发酵：将步骤2）中所得的种子培养液，按体积百分比8%的接种量 接入发酵培养基，在32℃条件下，200rpm/min振荡培养24h；

所述发酵培养基：麦芽浸粉：20g/L，蛋白胨：1g/L，KNO₃：2g/L，N aCl：1.0g/L，K₂HPO₄：1.0g/L，MgSO₄·7H₂O：0.5g/L，FeSO₄·7H₂O：0.02g/L，调节pH至5；121℃条件下灭菌20min；

4）转化：向步骤3）中所得的发酵液，加入5/L的阿魏酸，在30℃条件 下，100rpm/min振荡避光培养7天后停止；

5）将步骤4）中所得发酵液，在8000rpm/min条件下，12min离心处理 ，收集上清液，得到淡黄色天然香兰素发酵液；所得到的天然香兰素 发酵液浓度可达1.52g/L，转化率为17.82%。