一种牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分离方法

摘要

一种牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分离方法，它涉及一种蛋白的分离方法。本发明是要解决现有方法制备的牛乳乳脂肪球膜蛋白的纯度低以及性质不稳定的问题。分离方法：在牦牛牛乳中加入蔗糖，通过离心获得乳脂肪初提物，然后用钠离子磷酸盐缓冲溶液和超纯水进行离心洗涤，最后用聚乙二醇辛基苯基醚溶液离心，得到牦牛乳乳脂肪球膜蛋白。本发明制备的牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的性质稳定，纯度可达93.5%，解决了现有分离方法制备的牛乳乳脂肪球膜蛋白的纯度低和性质不稳定的问题。本发明适用于牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的大量生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白的分离方法。

背景技术

乳脂肪是牛乳的主要成分之一，乳脂肪以脂肪球的形式分散于牛乳中，其表面被一层 厚度为5~10nm的膜所覆盖，占脂肪球质量的2%～6%，称为乳脂肪球膜（Milk Fat Globule  Menbrane,MFGM）。乳脂肪球膜由蛋白质、磷脂、糖蛋白、三酰基甘油、胆固醇、酶和其 他微量成分组成，其中，乳脂肪球膜蛋白中以糖蛋白为主，乳脂肪球膜蛋白占乳脂肪球膜 总质量的25%-60%，占总乳蛋白总质量的1%-2%。研究表明，乳脂肪球膜蛋白具有良好的 抗癌活性，在乳脂肪球膜蛋中提取的乳腺癌易感基因具有抑制乳腺癌的作用。现有乳脂肪 球膜蛋白的分离方法主要有酸沉降法和膜过滤法。酸沉降法是通过用盐酸沉降乳脂肪球膜 蛋白，该方法的优点是操作简单、成本低，但盐酸会在一定程度上影响乳脂肪球膜蛋白活 性，导致分离得到的乳脂肪球膜蛋白的纯度偏低且性质不稳定；膜过滤法得到的乳脂肪球 膜蛋白性质较好，但该方法的成本高，操作复杂，不适合乳脂肪球膜蛋白的大量生产。

发明内容

本发明是要解决现有方法制备的牛乳乳脂肪球膜蛋白的纯度低以及性质不稳定的问 题，而提供一种牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分离方法。

本发明的一种牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分离方法按以下步骤进行：

一、按质量份数称取100份的牦牛乳和3~8份的蔗糖；

二、将步骤一称取的牦牛乳用3~5层纱布进行过滤后，加入步骤一称取的蔗糖，混合 均匀，得到牛乳蔗糖混合液；

三、将步骤二得到的牛乳蔗糖混合液在室温条件下进行离心，得到处于离心产物上层 的乳脂肪初提物；其中，离心转速为3000~4000r/min，离心时间为20~35min；

四、在步骤三得到的乳脂肪初提物中，加入1~3倍于该乳脂肪初提物体积的钠离子磷 酸盐缓冲溶液，混合均匀后，在室温条件下进行离心洗涤；其中，离心转速为 4200~5200r/min，离心时间为15~25min；所述的钠离子磷酸盐缓冲溶液的配制方法为：按 每1L钠离子磷酸盐缓冲溶液中含有Na₂HPO₄：4.2~4.4mmol、KCl：2.5~2.8mmol、KH₂PO₄： 1.6~1.8mmol和NaCl：135～140mmol的比例，将Na₂HPO₄、KCl、KH₂PO₄和NaCl加入到 去离子水中，并调节其pH至7.2~7.5，得到钠离子磷酸盐缓冲溶液；

五、将经步骤四处理的乳脂肪初提物，按步骤四的方法重复操作一次，得到处于离心 产物上层的乳脂肪；

六、在步骤五得到的乳脂肪中，加入与乳脂肪体积相同的超纯水，混合均匀后，在室 温条件下进行离心洗涤，得到处于离心产物上层的奶油；其中，离心转速为4200~5200r/min， 离心时间为15~25min；

七、将步骤六得到的奶油置于2~6℃条件下，并在该条件下静置12~16h，得到奶油固 体；

八、将步骤七得到的奶油固体置于40~45℃的水浴条件下进行融化，得到液态奶油；

九、在步骤八得到的液态奶油中，加入体积为占液态奶油体积0.15~0.3%的聚乙二醇辛 基苯基醚溶液，在室温条件下进行离心，收集沉淀，得到牦牛乳乳脂肪球膜蛋白；其中， 离心转速为40000~50000r/min，离心时间为40~70min；所述的聚乙二醇辛基苯基醚溶液的 配制方法为：按聚乙二醇辛基苯基醚与磷酸盐缓冲液的体积比为1:2.5~2.7称取聚乙二醇辛 基苯基醚与磷酸盐缓冲液，将二者混合均匀后，置于37~40℃的水浴中，保持2~3小时； 磷酸盐缓冲液的浓度为0.07~0.1mol/L、pH为7.2~7.4。

本发明首先在牦牛牛乳中添加蔗糖，可以有效的减少乳脂肪球膜蛋白在后续分离过程 中的损失；利用钠离子磷酸盐缓冲溶液对牦牛乳乳脂肪初提物进行洗脱，本发明所使用的 钠离子磷酸盐缓冲溶液能够洗脱掉附着于乳脂肪球膜上的酪蛋白和乳清蛋白，降低了所提 取的乳脂肪球膜蛋白中杂质蛋白的含量；利用非离子去污剂聚乙二醇辛基苯基醚溶液对牦 牛乳奶油进行洗脱，所使用的非离子去污剂聚乙二醇辛基苯基醚溶液可以溶解脂质而不对 蛋白本身的性质造成影响，使蛋白的性质稳定。通过本发明方法制备的牦牛牛乳乳脂肪球 膜蛋白的纯度可达到93~95%，而现有方法制备的牦牛牛乳乳脂肪球膜蛋白的纯度仅为80% 左右，有效的提高了牦牛牛乳乳脂肪球膜蛋白的纯度。

本发明适用于牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的大量生产。

具体实施方式

本发明的技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式间的 任意组合。

具体实施方式一：本实施方式的牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分离方法按以下步骤进行：

一、按质量份数称取100份的牦牛乳和3~8份的蔗糖；

二、将步骤一称取的牦牛乳用3~5层纱布进行过滤后，加入步骤一称取的蔗糖，混合 均匀，得到牛乳蔗糖混合液；

三、将步骤二得到的牛乳蔗糖混合液在室温条件下进行离心，得到处于离心产物上层 的乳脂肪初提物；其中，离心转速为3000~4000r/min，离心时间为20~35min；

四、在步骤三得到的乳脂肪初提物中，加入1~3倍于该乳脂肪初提物体积的钠离子磷 酸盐缓冲溶液，混合均匀后，在室温条件下进行离心洗涤；其中，离心转速为 4200~5200r/min，离心时间为15~25min；所述的钠离子磷酸盐缓冲溶液的配制方法为：按 每1L钠离子磷酸盐缓冲溶液中含有Na₂HPO₄：4.2~4.4mmol、KCl：2.5~2.8mmol、KH₂PO₄： 1.6~1.8mmol和NaCl：135～140mmol的比例，将Na₂HPO₄、KCl、KH₂PO₄和NaCl加入到 去离子水中，并调节其pH至7.2~7.5，得到钠离子磷酸盐缓冲溶液；

五、将经步骤四处理的乳脂肪初提物，按步骤四的方法重复操作一次，得到处于离心 产物上层的乳脂肪；

六、在步骤五得到的乳脂肪中，加入与乳脂肪体积相同的超纯水，混合均匀后，在室 温条件下进行离心洗涤，得到处于离心产物上层的奶油；其中，离心转速为4200~5200r/min， 离心时间为15~25min；

七、将步骤六得到的奶油置于2~6℃条件下，并在该条件下静置12~16h，得到奶油固 体；

八、将步骤七得到的奶油固体置于40~45℃的水浴条件下进行融化，得到液态奶油；

九、在步骤八得到的液态奶油中，加入体积为占液态奶油体积0.15~0.3%的聚乙二醇辛 基苯基醚溶液，在室温条件下进行离心，收集沉淀，得到牦牛乳乳脂肪球膜蛋白；其中， 离心转速为40000~50000r/min，离心时间为40~70min；所述的聚乙二醇辛基苯基醚溶液的 配制方法为：按聚乙二醇辛基苯基醚与磷酸盐缓冲液的体积比为1:2.5~2.7称取聚乙二醇辛 基苯基醚与磷酸盐缓冲液，将二者混合均匀后，置于37~40℃的水浴中，保持2~3小时； 磷酸盐缓冲液的浓度为0.07~0.1mol/L、pH为7.2~7.4。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中按质量份数称取 20份的牦牛乳和1份的蔗糖。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤三中离心转速为 3800r/min，离心时间为30min。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤三和步骤四 离心之后，将离心产物置于4℃条件下，并在该条件下静置10min。其它步骤及参数与具体 实施方式一至三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤四中所述的 钠离子磷酸盐缓冲溶液的配制方法为：按每1L钠离子磷酸盐缓冲溶液中含有Na₂HPO₄： 4.3mmol、KCl：2.7mmol、KH₂PO₄：1.8mmol和NaCl：137mmol的比例，将Na₂HPO₄、 KCl、KH₂PO₄和NaCl加入到去离子水中，并调节其pH至7.4，得到钠离子磷酸盐缓冲溶 液。其它步骤及参数与具体实施方式一至四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤四和步骤六 中离心转速为4800r/min，离心时间为20min。其它步骤及参数与具体实施方式一至五相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤九中加入体 积为占液态奶油体积0.2%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一 至六相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤九中离心转 速为44910r/min，离心时间为60min。其它步骤及参数与具体实施方式一至七相同。

通过以下试验验证本发明的有益效果：

试验一：本试验的一种牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分离方法按以下步骤进行：

一、挑选健康牦牛的新鲜牦牛乳，按质量份数称取20份的牦牛乳和1份的蔗糖；

二、将步骤一称取的牦牛乳用4层纱布进行过滤后，加入步骤一称取的蔗糖，用磁力 搅拌器混合均匀，得到牛乳蔗糖混合液；

三、将步骤二得到的牛乳蔗糖混合液在室温条件下进行离心，将离心产物置于4℃条 件下，并在该条件下静置10min，得到处于离心产物上层的乳脂肪初提物；其中，离心转 速为3800r/min，离心时间为30min；

四、在步骤三得到的乳脂肪初提物中，加入2倍于该乳脂肪初提物体积的钠离子磷酸 盐缓冲溶液，用磁力搅拌器混合均匀后，在室温条件下进行离心洗涤，将离心产物置于4 ℃条件下，并在该条件下静置10min；其中，离心转速为4800r/min，离心时间为20min； 所述的钠离子磷酸盐缓冲溶液的配制方法为：按每1L钠离子磷酸盐缓冲溶液中含有 Na₂HPO₄：4.3mmol、KCl：2.7mmol、KH₂PO₄：1.8mmol和NaCl：137mmol的比例，将 Na₂HPO₄、KCl、KH₂PO₄和NaCl加入到去离子水中，并调节其pH至7.4，得到钠离子磷 酸盐缓冲溶液；

五、将经步骤四处理的乳脂肪初提物，按步骤四的方法重复操作一次，得到处于离心 产物上层的乳脂肪；

六、在步骤五得到的乳脂肪中，加入与乳脂肪体积相同的超纯水，用磁力搅拌器混合 均匀后，在室温条件下进行离心洗涤，得到处于离心产物上层的奶油；其中，离心转速为 4800r/min，离心时间为20min；

七、将步骤六得到的奶油置于4℃条件下，并在该条件下静置15h，得到奶油固体；

八、将步骤七得到的奶油固体置于40~45℃的水浴条件下进行融化，得到液态奶油；

九、在步骤八得到的液态奶油中，加入体积为占液态奶油体积0.2%的聚乙二醇辛基苯 基醚溶液，在室温条件下进行离心，收集沉淀，得到牦牛乳乳脂肪球膜蛋白；其中，离心 转速为44910r/min，离心时间为60min；所述的聚乙二醇辛基苯基醚溶液的配制方法为： 按聚乙二醇辛基苯基醚与磷酸盐缓冲液的体积比为1:2.6称取聚乙二醇辛基苯基醚与磷酸 盐缓冲液，将二者混合均匀后，置于37℃的水浴中，保持2小时；磷酸盐缓冲液的浓度为 0.1mol/L、pH为7.3。

试验一的对照试验：

一、挑选健康牦牛的新鲜牦牛乳，按质量份数称取20份的牦牛乳和1份的蔗糖；

二、将步骤一称取的牦牛乳用4层纱布进行过滤后，加入步骤一称取的蔗糖，用磁力 搅拌器混合均匀，得到牛乳蔗糖混合液；

三、将步骤二得到的牛乳蔗糖混合液在室温条件下进行离心，将离心产物置于4℃条 件下，并在该条件下静置10min，得到处于离心产物上层的乳脂肪初提物；其中，离心转 速为3800r/min，离心时间为30min；

四、在步骤三得到的乳脂肪初提物中，加入2倍于该乳脂肪初提物体积的钠离子磷酸 盐缓冲溶液，用磁力搅拌器混合均匀后，在室温条件下进行离心洗涤，将离心产物置于4 ℃条件下，并在该条件下静置10min；其中，离心转速为4800r/min，离心时间为20min； 所述的钠离子磷酸盐缓冲溶液的配制方法为：按每1L钠离子磷酸盐缓冲溶液中含有 Na₂HPO₄：4.3mmol、KCl：2.7mmol、KH₂PO₄：1.8mmol和NaCl：137mmol的比例，将 Na₂HPO₄、KCl、KH₂PO₄和NaCl加入到去离子水中，并调节其pH至7.4，得到钠离子磷 酸盐缓冲溶液；

五、将经步骤四处理的乳脂肪初提物，按步骤四的方法重复操作一次，得到处于离心 产物上层的乳脂肪；

六、在步骤五得到的乳脂肪中，加入与乳脂肪体积相同的超纯水，用磁力搅拌器混合 均匀后，在室温条件下进行离心洗涤，得到处于离心产物上层的奶油；其中，离心转速为 4800r/min，离心时间为20min；

七、将步骤六得到的奶油置于4℃条件下，并在该条件下静置15h，得到奶油固体；

八、将步骤七得到的奶油固体置于40~45℃的水浴条件下进行融化，得到液态奶油；

九、将步骤八得到的液态奶油用搅拌器搅拌10min，再加入与液态奶油体积相同的去 离子水，分离得到黄油和酪乳；

十、将步骤九得到的黄油在60℃的水浴中加热融化，然后加入与黄油体积相同的去离 子水，在转速为4800r/min的条件下离心20min，弃去上层黄油，得到下层清液；

十一、将步骤十得到的下层清液与步骤十得到的酪乳混合，用浓度为0.01mol/L的 HCL调节其pH至4.8，于室温条件下静置30min后，在转速为12000r/min的条件下离心 15min，收集沉淀物和悬浮物，即得到牦牛乳乳脂肪球膜蛋白。

通过高效液相色谱法（HPLC）对试验一得到的牦牛乳乳脂肪球膜蛋白和对照试验得到 的牦牛乳乳脂肪球膜蛋白进行分析。试验一得到的牦牛乳乳脂肪球膜蛋白中杂质峰的峰面 积仅为对照试验得到的牦牛乳乳脂肪球膜蛋白中杂质峰峰面积的60%，并且杂峰α_S2-CN、 κ-CN的低含量酪蛋白组分已经基本消失，牦牛乳乳脂肪球膜蛋白性质稳定。通过计算得出 试验一得到的牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的纯度为93.5%，而对照试验得到的牦牛乳乳脂肪球 膜蛋白的纯度仅为82.7%，说明试验一得到的牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的纯度得到了明显的 提高。