聚乙二醇-微波辅助提取杏仁蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种聚乙二醇-微波辅助提取杏仁蛋白的方法，其是以脱脂后的杏仁粉为原料，用聚乙二醇-微波辅助提取、等电点-乙醇协同沉淀和真空冷冻干燥方法提取出杏仁蛋白，聚乙二醇为新型的绿色溶剂对杏仁蛋白有效成份具有增溶作用，能提高浸出效能和提取率，而且无毒性，微波辅助提取热效率高、升温快速均匀，大大提高了杏仁蛋白的提取效率，缩短了提取时间，此外杏仁蛋白的纯度较高，沉淀率高，提取方法简单，提取时间较短，对环境友好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种杏仁蛋白的提取方法，尤其是涉及一种以聚乙二醇为溶剂 采用微波辅助提取杏仁蛋白的方法。

背景技术

杏仁分为甜杏仁和苦杏仁两种，苦杏仁主要作为药物使用，甜杏仁则可直 接食用或用于食品加工。杏仁其味清香、营养价值很高，含有丰富的蛋白质、 糖、粗纤维、钙、磷、铁等多种人体所需的矿质元素，其中，杏仁蛋白含量达 24%～25%，含人体所需的18种氨基酸，种类齐全，可作为一种蛋白质营养强 化剂和添加剂。杏仁中含有8种人体必需的氨基酸，能够平衡膳食中的不足。 研究表明，杏仁具有良好的医疗效用，主治风寒肺病，可生津止渴、润肺化痰 和清热解毒等，长期食用可防癌、抗癌，增强抵抗力，延缓衰老，有益心脑健 康。此外，尤其是杏仁蛋白具有降压活性。因此，杏仁蛋白是一种优质的蛋白 资源，它的开发利用对人体的功能保健具有重要意义。

目前关于植物蛋白的提取方法主要有以下几种：

（1）传统的蛋白质提取方法是利用强碱溶液浸提。该方法主要是利用NaOH 等强碱溶液对蛋白质进行提取，其通常是在脱脂杏仁粉中放入碱溶液中浸提一 定时间(也可重复数次浸提)，将上清液取出，用一定浓度的酸溶液调节其pH值 至蛋白质等电点，就可使蛋白沉淀下来，离心分离、冷冻干燥即可。该方法提 取的蛋白质色泽较深，需要处理的时间长，提取率低，浪费大量的碱液，产生 大量废水，造成环境污染。

（2）盐提：利用较低浓度的盐溶液浸提，该方法主要是利用NaCl等盐溶 液对蛋白质进行提取，通常是在脱脂杏仁粉中放入低浓度的盐溶液浸提一定时 间（也可重复数次浸提），将上清液取出，用一定浓度的酸溶液调节其pH值至 蛋白质等电点，使蛋白沉淀下来，离心分离、冷冻干燥即可，但是该方法提取 所需时间长，提取率较低。

（3）反胶束法提取：在反胶束体系中，过饱和的表面活性剂溶解于非极性 溶剂中时，表面活性剂的非极性尾在外与有机溶剂接触，极性基团朝内形成一 个内表面，与平衡离子和水一起构成一个极性核心“水池”。当杏仁粉溶于反胶 束体系中时，蛋白质增溶于反胶束的极性水池内，同时油脂萃取入有机溶剂中， 改变体系水相的条件，如pH、离子强度等，使蛋白质由有机相重新返回水相。 随后有机相降温或柱层析分离出表面活性剂，蒸馏分离有机物质和油脂。下层 蛋白液经过精制得到蛋白质产品。但是该方法工艺复杂，提取时间长，提取率低， 有机溶剂的使用，对蛋白质营养价值和食用安全性影响，对环境产生污染。

（4）水酶法提取：运用蛋白酶水解法提取蛋白质，此方法虽可以提高蛋白 质的提取率，但是提取成本较高，且产品以杏仁肽为主，蛋白的乳化与起泡功 能性降低。

综上所述，目前的杏仁蛋白提取方法均存在有一定的不足，一种提取工艺 简单、成本低、提取率高、纯度高的提取方法的研究是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中杏仁蛋白的提取方法所存在的不足，提 供了一种提取率和沉淀率较高的聚乙二醇-微波辅助提取杏仁蛋白的方法。

解决上述技术问题的技术方案是聚乙二醇-微波辅助提取杏仁蛋白的方法包 括如下步骤：

（1）将脱脂杏仁粉过60～80目筛，加入体积分数为25%的聚乙二醇溶液 配制成料液比为1：18～30g/mL的混合液，40～50℃功率为110～130w微波提 取3～6分钟，8000～10000转/分钟的条件下，离心8～10分钟，取上清液；

（2）在步骤（1）的上清液中加入乙醇，上清液与乙醇的体积比为1：0.2～0.3， 搅拌混匀，用1.0mol/L的盐酸调节pH值至4～4.5，静置3～5分钟，沉淀，离 心5～8分钟，弃去上清液，用pH值为4～4.5的水洗涤沉淀物2～4次，得杏 仁蛋白沉淀；

（3）将杏仁蛋白沉淀在-50～-60℃下功率为1.2～1.8KW、真空度为 0.06～0.09MPa的真空箱中真空冷冻干燥20～24小时，得天然杏仁蛋白粉。

上述步骤（1）中将脱脂杏仁粉过60～80目筛，加入体积分数为25%的聚 乙二醇溶液配制成料液比为1：20～25g／mL的混合液为佳。

上述步骤（2）中上清液与乙醇较佳的体积比为1：0.24～0.27。

上述步骤（2）中的上清液中加入乙醇后，用1.0mol／L的盐酸调节pH值至 4.2～4.5为佳。

上述脱脂杏仁粉可以是脱脂的甜杏仁粉，也可以是脱脂的苦杏仁粉。

上述聚乙二醇是聚乙二醇200（PEG-200）、聚乙二醇400（PEG-400）或聚 乙二醇600（PEG-600），均由天津科密欧化学试剂有限公司生产，其中聚乙二 醇200的平均分子量为190～210，聚乙二醇400的平均分子量为380～420， 聚乙二醇600的平均分子量为560～640。

本发明的聚乙二醇-微波辅助提取杏仁蛋白的方法以脱脂后的杏仁粉为原 料，用聚乙二醇-微波辅助提取、等电点-乙醇协同沉淀和真空冷冻干燥方法提取 出杏仁蛋白，聚乙二醇为新型的绿色溶剂对杏仁蛋白有效成份具有增溶作用， 能提高浸出效能和提取率，而且无毒性，微波辅助提取热效率高、升温快速均 匀，大大提高了杏仁蛋白的提取效率，缩短了提取时间，此外杏仁蛋白的纯度 较高，沉淀率高，提取方法简单，提取时间较短，对环境友好。

附图说明

图1为不同溶剂对杏仁蛋白提取率的影响效果图。

具体实施方式

现对本发明进行进一步说明，但是本发明不仅限于下述的实施方式。

实施例1

以100g脱脂甜杏仁粉为原料，聚乙二醇-微波辅助提取杏仁蛋白的方法包括 如下步骤：

（1）将100g脱脂甜杏仁粉过70目筛，加入2200mL体积分数为25%的聚 乙二醇200溶液配制成料液比为1：22g／mL的混合液，45℃功率为120w微波 提取4分钟，在9000转/分钟的条件下，离心9分钟，取上清液，提取率为93.35%。

（2）将步骤（1）的上清液中加入550mL乙醇，上清液与乙醇的体积比为 1：0.25，搅拌混匀，用1.0mol／L的盐酸调节pH值达到4.5，静置4分钟使蛋白 沉淀，离心6分钟，弃上清液，用pH值为4.5的水洗涤沉淀物3次，得杏仁蛋 白沉淀，沉淀率为98.81%。

（3）将杏仁蛋白沉淀在-55℃功率为1.5KW、真空度为0.08MPa的真空箱 中真空冷冻干燥22小时，得41.50g天然甜杏仁蛋白粉，根据公式

计算得蛋白纯度为95.61%。

实施例2

以100g脱脂甜杏仁粉为原料，聚乙二醇-微波辅助提取杏仁蛋白的方法包括 如下步骤：

（1）将100g脱脂甜杏仁粉过70目筛，加入2000mL体积分数为25%的聚 乙二醇200溶液配制成料液比为1：20g／mL的混合液，45℃功率为120w微波 提取4分钟，9000转/分钟的条件下，离心9分钟，取上清液，提取率为91.65%。

（2）将步骤（1）的上清液中加入480mL乙醇，上清液与乙醇的体积比 为1：0.24，搅拌混匀，用1.0mol／L的盐酸调节pH值达到4.5，静置4分钟沉 淀，离心6分钟，弃去上清液，用pH值为4.5的水洗沉淀物3次，得杏仁蛋白 沉淀，沉淀率为97.32%。

其他的步骤与实施例1相同，得40.14g天然甜杏仁蛋白粉，其蛋白纯度为 91.92%。

实施例3

以100g脱脂甜杏仁粉为原料，聚乙二醇-微波辅助提取杏仁蛋白的方法包括 如下步骤：

（1）将100g脱脂甜杏仁粉过70目筛，加入2500mL体积分数为25%的聚 乙二醇200溶液配制成料液比为1：25g／mL的混合液，45℃功率为120w微波 提取4分钟，9000转/分钟的条件下，离心9分钟，取上清液，提取率为92.14%。

（2）将步骤（1）的上清液中加入675mL乙醇，上清液与乙醇的体积比 为1：0.27，搅拌混匀，用1.0mol／L的盐酸调节pH值达到4.5，静置4分钟沉 淀，离心6分钟，弃去上清液，用pH值为4.5的水洗涤沉淀物3次，得杏仁蛋 白沉淀，沉淀率为96.78%。

其他的步骤与实施例1相同，得40.13g天然甜杏仁蛋白粉，其蛋白纯度为 92.53%。

实施例4

以100g脱脂甜杏仁粉为原料，聚乙二醇-微波辅助提取杏仁蛋白的方法包括 如下步骤：

（1）将100g脱脂甜杏仁粉过70目筛，加入1800mL体积分数为25%的聚 乙二醇200溶液配制成料液比为1：18g／mL的混合液，45℃功率为120w微波 提取4分钟，9000转/分钟的条件下，离心9分钟，取上清液，提取率为90.26%。

（2）将步骤（1）的上清液中加入360mL乙醇，上清液与乙醇的体积比 为1：0.2，搅拌混匀，用1.0mol／L的盐酸调节pH值达到4.5，静置4分钟沉淀， 离心6分钟，弃去上清液，用pH值为4.5的水洗涤沉淀物3次，得杏仁蛋白沉 淀，沉淀率为93.31%。

其他的步骤与实施例1相同，得37.90g天然甜杏仁蛋白粉，其蛋白纯度为 90.89%。

实施例5

以100g脱脂甜杏仁粉为原料，聚乙二醇-微波辅助提取杏仁蛋白的方法包括 如下步骤：

（1）将100g脱脂甜杏仁粉过70目筛，加入3000mL体积分数为25%的聚 乙二醇200溶液配制成料液比为1：30g／mL的混合液，45℃功率120w微波提 取4分钟，在9000转/分钟的条件下，离心9分钟，取上清液，提取率为91.86%。

（2）将步骤（1）的上清液中加入900mL乙醇，上清液与乙醇的体积比 为1：0.3，搅拌混匀，用1.0mol／L的盐酸调节pH值达到4.5，静置4分钟沉淀， 离心6分钟，弃去上清液，用pH值为4.5的水洗涤沉淀物3次，得杏仁蛋白沉 淀，沉淀率为95.24%。

其他的步骤与实施例1相同，得39.37g天然甜杏仁蛋白粉，其蛋白纯度为 90.28%。

实施例6

上述实施例1～5的聚乙二醇-微波辅助提取杏仁蛋白的方法中，在步骤（1） 中将脱脂甜杏仁粉过60目筛后加入体积分数为25%的聚乙二醇溶液，40℃功 率110w微波提取6分钟，8000转/分钟的条件下，离心10分钟，取上清液，提 取率为92.84%；在步骤（2）中是将步骤（1）的上清液中加入乙醇，搅拌混匀， 用1.0mol／L的盐酸调节pH值达到4，静置3分钟沉淀，离心5分钟，弃去上清 液，用pH值为4的水洗涤沉淀物2次，得杏仁蛋白沉淀，沉淀率为98.81%； 在步骤（3）中，将沉淀物在-50℃功率为1.2KW、真空度为0.06MPa的真空箱 内真空冷冻干燥24小时。其他的步骤与相应的实施例相同，得天然甜杏仁蛋白 粉。

实施例7

上述实施例1～5的聚乙二醇-微波辅助提取杏仁蛋白的方法中，在步骤（1） 中将脱脂甜杏仁粉过80目筛后加入体积分数为25%的聚乙二醇溶液，在微波功 率130w，温度50℃的条件下，微波提取3分钟，在10000转/分钟的条件下， 离心8分钟，取上清液，提取率为91.42%；在步骤（2）中是将步骤（1）的上 清液中加入乙醇，搅拌混匀，用1.0mol／L的盐酸调节混合液的pH值达到4.2， 静置5分钟沉淀，离心8分钟，弃去上清液，用pH值为4.2的水洗涤沉淀物4 次，得杏仁蛋白沉淀，沉淀率为98.81%；在步骤（3）中，将沉淀物在-60℃功 率为1.8KW、真空度为0.09MPa的真空箱内真空冷冻干燥20小时。其他的步骤 与相应的实施例相同，得天然甜杏仁蛋白粉。

实施例8

在上述实施例1～7的聚乙二醇-微波辅助提取杏仁蛋白的方法中，将步骤1 中的脱脂甜杏仁粉用等质量的脱脂苦杏仁粉替换，其他的步骤与相应的实施例 相同。

实施例9

在上述实施例1～8的聚乙二醇-微波辅助提取杏仁蛋白的方法中，将步骤1 中的聚乙二醇200用等浓度等体积的聚乙二醇400或者聚乙二醇600来替换， 其他的步骤与相应的实施例相同。

为了确定本发明的提取方法的最佳条件，发明人进行了大量实验研究筛选， 具体情况如下：

1、聚乙二醇溶剂的选取

（1）碱提法：该方法主要是利用NaOH强碱溶液对蛋白质进行提取，先准 确称取一定量的脱脂甜杏仁粉，以液料比为1：22g/ml的量用0.5mol／L的NaOH 调节pH值为9.0，在微波功率120W、温度45℃提取4分钟，取其上清液，用 1.0mol／L HCl调节pH值至4.5，使蛋白沉淀下来，离心分离、冷冻干燥即可。

（2）盐提法：该方法主要是利用NaCl溶液对蛋白质进行提取，先准确称 一定量的脱脂甜杏仁粉，用0.15mol／L的NaCl以液料比1：22g/ml的量溶解， 在微波功率120W、温度45℃提取4分钟，取其上清液，用1.0mol／L HCl调节 pH值至4.5，使蛋白沉淀下来，离心分离、冷冻干燥即可。

（3）本发明的提取法：称取一定量的脱脂甜杏仁粉，分别用体积分数为25% 的聚乙二醇200溶液、聚乙二醇400溶液、聚乙二醇600溶液以料液比为1：22g／mL 溶解，在微波功率120W、温度45℃提取4分钟，取其上清液，用1.0mol／L HCl 调节pH值至4.5，蛋白沉淀下来，离心分离、冷冻干燥即可。

按照公式计算出上述3个实验的甜杏仁蛋白提取率，

结果见图1。由图1可知，在同等条件下，本发明的所选用的聚乙二醇200 （PEG-200）、聚乙二醇400（PEG-400）、聚乙二醇600（PEG-600）作为溶剂对 脱脂甜杏仁蛋白的提取率明显高于NaOH与NaCl作为溶剂时的提取率，特别是 聚乙二醇200为溶剂时的提取率最高。与聚乙二醇400、聚乙二醇600相比较聚 乙二醇200更适合于甜杏仁蛋白的提取，有助于提高甜杏仁蛋白的利用率。

2、微波处理方法选取

（1）聚乙二醇-超声辅助提取：取脱脂甜杏仁粉与体积分数为25%聚乙二 醇200水溶液混合，料液比1：22g／mL，在360W的功率、温度45℃下提取20 分钟，提取液在8000转/分钟离心10分钟，收集上清液，用考马斯亮蓝法测定 上清液中蛋白质的含量，用凯氏定氮法测定脱脂杏仁粉总蛋白的含量，计算出 甜杏仁蛋白的提取率，见表1；

（2）聚乙二醇-常规水浴加热提取：取与上述等质量的脱脂甜杏仁粉与体 积分数为25%聚乙二醇200水溶液混合，料液比1：22g/mL，在温度45℃下 提取60分钟，提取液在8000转/分钟的转速下高速离心10分钟，收集上清液， 用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质的含量，同理计算出甜杏仁蛋白的提取率， 结果见表1；

（3）聚乙二醇-微波辅助加热提取：取与上述等质量的脱脂甜杏仁粉与体积 分数为25%的聚乙二醇200水溶液混合，料液比1：22g／mL，在温度45℃下微 波提取4分钟，微波功率为120w，提取液在8000转/分钟的转速下高速离心10 分钟，收集上清液，用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质的含量，同理计算甜 杏仁蛋白的提取率，结果见表1；

表1不同提取方法的比较

  项目   时间（分钟）   温度（℃）   提取率（%）   聚乙二醇-微波辅助提取   4   45   93.35   聚乙二醇-超声辅助提取   20   45   84.36   聚乙二醇-常规水浴加热提取   60   45   78.61

由上述表1对比结果表明，聚乙二醇-微波辅助提取提取效率最高，提取时 间最短。与超声辅助提取法相比较，微波辅助提取所需时间降低了16分钟，杏 仁蛋白在最佳提取条件下提取率提高将近10%；与普通水浴加热提取法相比较， 微波辅助提取所需时间降低56分钟，杏仁蛋白的提取率提高了将近15%。

3、沉淀方法的选择

（1）等电点沉淀：将本发明实施例1中的杏仁蛋白上清液，用1.0mol／L 的盐酸调节混合液的pH值达到4.5，静置后沉淀，水洗沉淀，冷冻干燥，根据 公式计算出杏仁蛋白沉淀率，结果 见表2。

（2）乙醇沉淀：将本发明实施例1中的杏仁蛋白上清液，加入四倍体积的 乙醇，搅拌均匀，静置后沉淀，水洗沉淀，冷冻干燥，同理计算出杏仁蛋白沉 淀率（见表2）。

（3）等电点-乙醇协同沉淀：将本发明实施例1的杏仁蛋白上清液，加入0.25 倍体积的乙醇，搅拌均匀，用1.0mol／L的盐酸调节pH值达到4.5，静置沉淀，水 洗沉淀，冷冻干燥，同理计算杏仁蛋白沉淀率（见表2）。

表2不同沉淀方法对比

  等电点沉淀法   乙醇沉淀法   等电点-乙醇协同沉淀法   沉淀所需时间(分钟)   3～5   静置180～240   3～5   沉淀率（%）   78.75   97.56   98.81

上述表2的对比结果表明，本发明的等电点-乙醇协同法，沉淀率最高，可 达98.81%，且所需时间短、乙醇的用量少；乙醇法沉淀率为97.56%，接近等电 点-乙醇协同作用，但所需时间过长，乙醇用量多；等电点法沉淀率仅为78.75%。 由此可以看出，等电点-乙醇协同法，结合了等电点法沉淀速度快和醇沉法沉淀 完全的优点，其沉淀率高。