一种金银花查尔酮合酶突变体及其用途

摘要

本发明的目的是提供一种金银花查尔酮合酶突变体，经由易错PCR筛选获得了所述突变体，相较于野生型金银花查尔酮合酶，突变体在五个氨基酸位点处发生了突变，从而产生了显著改善的酶活。当所述突变体应用于转基因植株时能够显著提升植株的黄酮类化合物的含量，在生产中应用于提升金银花黄酮含量应用方面有巨大的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种金银花查尔酮合酶突变体及其用途。

背景技术

金银花(Flos Lonicerae Japonicae)为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物忍冬(Lonicera.japonica Thunb.)的干燥花蕾，忍冬属植物在全世界约有200种，为典型的北温带广布属，分布于北美洲、欧洲、亚洲和非洲北部的温带和亚热带地区，在我国有98种，广泛分布于全国各省区，其中尤其以西南地区种类最多。目前忍冬属中研究最多的植物为金银花药材来源植物-忍冬，传统上对金银花的命名存在混乱不清的情况，2005年新版药典对金银花药材来源进行了修订，将忍冬(Lonicera.japonica Thunb.)作为金银花药材的唯一来源。金银花又叫银花、双花、鹭鸶花、二宝花、金藤花、双苞花等，其性味甘苦寒，能清热解毒、凉散风热，近年来，经过科学验证表明，金银花具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫及解热抗炎、利胆、保肝、降脂、抗生育、止血、抗溃疡等多种药理作用。

现代分析科学表明，金银花中含有多种化合物，其中主要为挥发油、黄酮类、有机酸类、三萜苷类、环烯谜萜苷类化合物，其中黄酮类化合物是金银花中的一种非常重要的有效成分，这些黄酮类物质具有降低心肌耗氧量，使冠脉、脑血管流量增加，抗心律、软化血管、降血糖血脂等作用，同时还是一种天然的抗氧化剂，具有清除人体中超氧离子自由基抗衰老、增加机体免疫力的生理活性作用。

已知在类黄酮代谢中，查尔酮合酶(chalcone synthase，CHS)是第一个关键酶，也是黄酮化合物生物合成途径中的第一个限速酶，起着决定性作用，查尔酮合酶是一种III型聚酮化合物合酶(PKS)，其催化4-香豆酸-CoA(4-coumaroyl-CoA)和丙二酰-CoA(malonyl-CoA)反应，合成4’5’7-三羟基黄烷酮(narigeninchalcone)，在此过程中，为类黄酮类物质提供了基本的碳架结构，为类黄酮、黄酮醇、黄烷酮、花青素糖苷及其他物质的合成提供了保障。查尔酮合酶在结构上具有很强的保守性，大多数由一个内含子和两个外显子构成。

因此，为了提高金银花中的黄酮类化合物的含量，有迫切需求获得金银花查尔酮合酶的突变体，从而改善金银花中黄酮类化合物的含量。

常用的蛋白突变库的构建方法主要有易错PCR、DNA改组等，其中，易错PCR法是在用PCR方法扩增目的基因时，通过改变PCR条件，诱发碱基错配，使目的基因产生随机突变，易错PCR是比较常用的构建基因突变库的方法，操作比较简单。

本发明基于易错PCR构建突变体库，并筛选获得了一种酶活显著提升的金银花查尔酮合酶突变体，本发明为后续金银花品质的改善提供了有效的实践基础。

发明内容

现有技术对金银花查尔酮合酶研究尚存在不足，作为类黄酮代谢中的关键酶，改善查尔酮合酶的酶活预计能够显著增加植株中黄酮类化合物的含量，从而大大提升以黄酮类物质作为活性物质的中药材的药材品质。为了解决上述不足，本发明提供了一种金银花查尔酮合酶(LjCHS)突变体，所述突变体相较于野生型金银花查尔酮合酶产生了五处氨基酸突变。

进一步地，所述野生型金银花查尔酮合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，SEQ ID NO：1作为参照序列，所述五处氨基酸突变分别位于第116、161、277、327和377位。

更进一步地，所述五处氨基酸突变为E116G、Q161R、K277R、T327A、L377T。

最进一步地，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供金银花查尔酮合酶突变体的编码基因。

进一步地，以SEQ ID NO：3所示的野生型金银花查尔酮合酶编码基因序列作为参照序列，所述突变体的编码基因发生了七处核苷酸碱基替换。

更进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供一种重组载体，所述重组载体包含金银花查尔酮合酶突变体的编码基因。

本发明还提供一种重组细胞，所述重组细胞包含金银花查尔酮合酶的编码基因或包含上述重组载体。

本发明还提供金银花查尔酮合酶突变体、其编码基因、含有其编码基因的重组载体或转染有上述重组载体的重组细胞在增加生物体黄酮产量中的应用。

进一步地，所述生物体优选为植物或植物细胞。

更进一步地，所述生物体为金银花、拟南芥。

有益效果

通过易错PCR筛选获得的金银花查尔酮合酶突变体相较于野生型金银花查尔酮合酶突变体具有显著改善的酶活，体外车顶，酶活提升了40％以上；当将金银花查尔酮合酶突变体在植株中过表达时，相较于过表达野生型金银花查尔酮合酶，转染植物的黄酮含量显著提升32％以上。

本发明的金银花查尔酮合酶突变体具有巨大的实际应用价值，具有提升植株尤其是中药材的黄酮类化合物含量的潜在巨大价值，有很好的推广前景。

附图说明

图1：RNA提取电泳检测图谱(28S、18S、5S)。

图2：反转cDNA琼脂糖凝胶电泳检测。

图3：金银花查尔酮合酶PCR扩增产物。

图4：重组蛋白纯化SDS-PAGE电泳图。

图5：LjCHS-mt-H与LjCHS的体外酶活HPLC检测图。

具体实施方式

在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。

应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本发明上下文中的含义一致的含义：术语的概念可以适当地由发明人为了对本发明的最佳说明而限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：金银花查尔酮合酶的克隆及原核表达载体、真核表达载体的构建

以GenBank中的金银花查尔酮合酶JQ627646.1为依据设计扩增引物对以获得金银花查尔酮合酶的基因序列。所述扩增引物对的上游引物为CHS-PF，其序列为：cgGGATCCatggtgacc；下游引物为CHS-PR，其序列为：cGAATTCctaagtggacacactatg。如下划线位置所示，在上游引物和下游引物的5’端分别加入BamH>

取金银花(购自北京同仁堂)花蕾2g，将其置于提前预冷的研钵中，快速充分研磨，期间不断加入液氮，直至组织研磨成粉末，将粉末集中于研钵底部。

取适量的RNAiso Plus提取液，使其完全覆盖粉末，室温放置20-30min待其融化后快速研磨成透明状。

将透明状研磨液转移至2ml离心管中，室温静置5min，12000×g，4℃低温离心5min；取上清液于1.5ml离心管中，加入1/5RNAiso Plus体积的氯仿，上下剧烈震荡，使其充分接触，室温静置5min，12000×g，4℃低温离心5min；取上清液于新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置5min，12000×g，4℃低温离心5min；弃上清，加入500ml75％乙醇，轻吹洗涤，12000×g，4℃低温离心5min，重复两次；弃上清，室温干燥5-8min。

用适量的Rnase free水溶解沉淀，测定浓度，琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1所示，图1中的28S、18S和5S三条谱带表明RNA提取成功，-80℃冰箱保存。

采用逆转录试剂盒(M-MLV Reverse Transcriptase逆转录试剂盒，购自Promega公司)将上述RNA逆转录为cDNA，根据已知基因(管家基因actin)进行验证，重复三次。结果如图2所示，由图2可知cDNA反转录成功，-20℃保存备用。

以上述cDNA作为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系为：Premix Ex Taq 10μl，引物1、引物2各1.5μl、cDNA 1.0μl，ddH2O 6.0μl，总体积20μl；PCR反应程序为：94℃预变性10min；94℃变性30s；54℃退火30s；72℃延伸30s；72℃终延伸10min；共计38个循环。PCR产物纯化回收。

将PCR产物与T载体pBR322分别利用BamH I、EcoR I进行双酶切，双酶切产物经凝胶电泳纯化回收后进行连接，连接产物转入菌体JM109中，挑取单克隆进行PCR验证以及测序验证。

电泳结果如图3所示，由图3可知，以阳性质粒为模板，通过PCR方法克隆得到大小约1170bp的特异性产物；且测序结果与参照序列JQ627646.1完全一致，测序结果正确的载体命名为pBR322-LjCHS。

原核表达载体的构建：

以CHS-PF和CHS-PR为引物进行PCR扩增，得到含有BamH I和EcoR I两个酶切位点的金银花查尔酮合酶，PCR产物进行胶回收。

用BamH I和EcoR I分别双酶切PCR产物和pET28a(+)载体质粒，酶切产物胶回收目的基因片段和pET28a(+)载体片段，将带有酶切末端的目的基因片段用T4连接酶与带有酶切末端pET28a(+)载体片段连接，转化，PCR验证，测序，测序正确的保存菌种和质粒，命名为pET28-LjCHS。

将pET28-LjCHS重组质粒转染到BL21(DE3)细胞中，PCR验证，测序，测序正确的保存菌种和质粒，命名为pET28-LjCHS(BL21)。

真核表达载体的构建：

以CHS-PF和CHS-PR为引物进行PCR扩增，得到含有BamH I和EcoR I两个酶切位点的金银花查尔酮合酶，PCR产物进行胶回收，用BamH I和EcoR I分别双酶切PCR产物和pBASTA载体质粒，酶切产物胶回收目的基因片段和pBASTA载体片段，将带有酶切末端的目的基因片段用T4连接酶与带有酶切末端的pBASTA载体片段连接，转化农杆菌，PCR验证，测序，测序正确的保存菌种和质粒，命名为pBASTA-LjCHS。

实施例2：连续易错PCR筛选金银花查尔酮合酶突变体

以实施例1获得的pBRdu322-LjCHS作为易错PCR的模板，易错PCR同样采用CHS-PF和CHS-PR作为扩增引物对，易错PCR的反应体系如下：

10×buffer10μl

MgCl₂>

dATP、dGTP各0.2μl

dCTP、dTTP各1μl

引物 各1μl

DNA模板1μl

Taq聚合酶1μl

MnCl₂(10mM)1μl

ddH₂O补至100μl。

其中Mg²⁺在反应体系中的浓度优选为8mmol/L、Mn²⁺在反应体系中的浓度优选为0.1mmol/L。

易错PCR的反应条件为：

95℃预变性2min，94℃变性1min，49.5℃退回1min，72℃延伸2min，30个循环后，72℃延伸7min。

同时设立有模板无引物的对照组1和有引物无模板的对照组2，反应结束后使用纯化试剂盒对易错PCR产物进行纯化回收，取1μl PCR产物进行1％琼脂糖电泳检测其大小和含量。

第二至第五轮易错PCR的反应体系、反应条件均同上，且依次以上一轮的PCR扩增产物作为PCR模板进行下一轮的易错PCR扩增。

取最终获得的易错PCR产物(均命名为LjCHS-mt)、pET28a(+)载体质粒分别进行BamH I和EcoR I双酶切，酶切产物胶回收目的基因片段和pET28a(+)载体片段，将带有酶切末端的目的基因片段用T4连接酶与带有酶切末端pET28a(+)载体片段连接，重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中，获得的菌株均命名为pET28-LjCHS-mt(BL21)。

突变体库的高通量筛选：

将突变菌株pET28-LjCHS-mt(BL21)与野生型菌株pET28-LjCHS在48深孔板(有盖子)上进行同批次发酵培养以便于初筛。

培养体系为1.2mL LB液体培养基，培养条件为150rpm、37℃过夜，加入2mM的IPTG于25℃诱导12h，超声破碎后离心取上清，利用植物查尔酮合酶活性比色法定量检测试剂盒(上海哈灵生物试剂检测中心)测定突变体及野生型菌株的查尔酮合酶酶活，获得初筛结果。

初筛具有提高的查尔酮合成酶酶活的突变菌株再经过摇瓶扩大培养表达进行复筛，发酵培养基为LB液体培养基(100μg/ml卡那霉素)，150rpm、37℃过夜培养，加入2mM的IPTG于25℃诱导12h后离心收集菌体，PBS重悬沉淀细胞，超声破碎细胞，12000rpm、4℃离心20min，保留上清，上镍柱，使表达的重组蛋白结合到镍柱上，洗脱，透析，浓缩，即可获得大量可溶性重组金银花查尔酮合酶或其突变体蛋白，纯化结果见图4，其中泳道1为阴性对照(空载体)，泳道2为纯化前蛋白，泳道3为纯化后蛋白，结果显示，成功纯化得到纯度较好的LjCHS突变体或野生型蛋白，所获得的纯化重组蛋白以吸光光度法进行定量。

纯化获得的重组金银花查尔酮合酶或其突变体蛋白通过HPLC定量检测酶活。

具体即：体外酶促反应体系总体积250μl，含有3.75μmol的4-香豆酰辅酶A与14μmol的丙二酰辅酶A、0.1mol/L的PBS缓冲液(pH 7.0)以及2.0μg的纯化重组LjCHS或其突变体，30℃反应1小时，加入12.5μL乙酸，再加入250μl乙酸乙酯萃取，吸取有机相，离心，取上清进行干燥，干燥后加入250μl 50％(V/V)的甲醇水溶液获得酶促反应产物提取物；利用Agilent 1100 HPLC/MSD trap VL鉴定酶促反应产物，色谱柱为：ZORBAX Eclipse XDB-C18,4.6mm×150mm，5μm，柱温30℃，进样量20μl，流动相为水(A)和甲醇(B)，流速1.0ml/min，洗脱程序：30％B 3min，30％-80％B 17min，80％B 3min，检测波长为289nm；以柚皮素标准品作为对照进行定量。

经由上述筛选过程，最终获得一株酶活显著提升的突变体，将其命名为LjCHS-mt-H，经由HPLC法测定柚皮素产量可知，LjCHS-mt-H的酶活高达1314U/ml，而野生型LjCHS的酶活则仅有935U/ml，即相较于野生型LjCHS，突变体的酶活提高了40.5％。酶活单位定义为：在30℃，pH7.0的条件下，一分钟内生成1纳摩尔柚皮素的查尔酮合成酶的量为一个酶活单位(U)。

实施例3：LjCHS-mt-H的序列解析

将筛选得到的突变转化子提取质粒后使用高保真DNA聚合酶扩增突变的LjCHS-mt-H基因片段，得到的片段与T载体连接后测序，测序结果如SEQ ID NO：2所示。

与野生型LjCHS的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)相比，LjCHS-mt-H发生了7处核苷酸碱基突变，以SEQ ID NO：1为参照序列，发生碱基突变的位置分别位于第347、481-482、830、979、1129-1130位。

LjCHS-mt-H编码的突变体的蛋白质序列如SEQ ID NO：4所示，其与SEQ ID NO：3所示的野生型LjCHS的氨基酸序列相比，发生了5处氨基酸突变，以SEQ ID NO：3作为参照序列，突变分别发生在第116、161、277、327和377位，具体分别由第116位的谷氨酸(Glu)突变为甘氨酸(Gly)、由第161位的谷氨酰胺(Gln)突变为精氨酸(Arg)、由第277位的赖氨酸(Lys)突变为精氨酸(Arg)、由第327位的苏氨酸(Thr)突变为丙氨酸(Ala)和由第377位的亮氨酸(Leu)突变为苏氨酸(Thr)。

经推定，谷氨酸突变为的甘氨酸缺乏大的侧链，可以使多肽链中的N-Cα键和Cα-C具备构象柔性，柔性的改变可能引起酶构象的微变化，使酶与底物结合亲和力增强，催化效率提高；而苏氨酸突变为丙氨酸，也导致苏氨酸侧链上羟基易于与其他残基形成的氢键缺失，从而使酶的刚性降低，柔性增加，从而引起酶催化效率的提高；由于亮氨酸与苏氨酸侧链都较小，且都易于形成氢键，因此亮氨酸突变为苏氨酸对酶活的影响力不明显；而位于酶催化活性位点或查尔酮合酶保守序列附近的第161位谷氨酰胺、或第277位赖氨酸突变为精氨酸也由于谷氨酰胺突变引起的氢键的改变而导致该部位相关氨基酸残基侧链柔性增加，从而更有助于底物向活性部位靠近，促进酶催化效率的提升，导致酶活性的增强。

实施例4：金银花查尔酮合酶显著提高拟南芥黄酮含量

按照实施例1的真核表达载体构建方法，将LjCHS-mt-H的基因片段构建到pBASTA载体中，获得的重组质粒转化农杆菌，并PCR验证、测序，测序正确的保存菌种和质粒，命名为pBASTA-LjCHS-mt-H。

将农杆菌pBASTA-LjCHS和农杆菌pBASTA-LjCHS-mt-H活化培养后用于侵染拟南芥。

准备好的农杆菌菌液加入500ml渗透培养基，加入Silwet L-7725μL，振摇混匀，利用Floradip法侵染拟南芥，收获的T0代拟南芥种子春化处理后播种到无菌土中，待拟南芥长出4片真叶时，用1％Basta筛选剂进行喷洒处理，每隔1天喷洒1次，共3次，收获T1代种子保存备用，将T1代种子播种，待拟南芥小苗长出4片真叶时，用1％Basta筛选剂进行喷洒，1周后将存活下来的T2代小苗进行移栽，利用植物基因组试剂盒对获得的小苗进行基因组提取，PCR验证阳性植株。

取PCR验证正确的拟南芥株系进行黄酮的测定，拟南芥黄酮粗提取液制备方法如下：将拟南芥叶片清洗后干燥并粉碎过40目筛，取0.5g加入10mL 65％乙醇，50℃下超声震荡提取30min，离心取上清液备用，利用HPLC法测定黄酮含量(槲皮素、金丝桃苷和4’5’7-三羟黄烷酮)。转基因突变体pBASTA-LjCHS-mt-H拟南芥(A)、转基因pBASTA-LjCHS拟南芥(B)、野生型拟南芥(C)各取10株进行上述黄酮含量(μg/g)测定，取平均值，并进行统计分析。结果如表1所示：

12345678910均值A589.6650.9650.2602.3662.4630.6756.9654.5726.5739.4666.3±6.8B550.2498.6552.3465.2490.1476.2479.2490.8551.1473.1502.7±8.1C389.6435.2450.1360.5320.8420.1413.5460.2386.9401.2403.8±5.6

由植株的黄酮含量可知，金银花查尔酮合酶突变体LjCHS-mt-H在植株内能够显著提升植株的黄酮含量，相对于野生型金银花查尔酮合酶LjCHS，转基因植株的黄酮含量提升了约32.7％，具有显著差异(p＜0.05)；相对于野生型植株的黄酮含量提升了65.2％，具有极显著差异(p＜0.01)，因此，本申请的金银花查尔酮合酶突变体LjCHS-mt-H在金银花黄酮类物质含量提升方面有巨大的应用潜力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 济南广盛源生物科技有限公司

<120> 一种金银花查耳酮合酶突变体及其用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1170

<212> DNA

<213> 金银花(Lonicera japonica)

<400> 1

atggtgaccg tcgaggaggt tcggaaggcg caacgggccg agggccccgc caccgtcatg 60

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ttccgcatca caaacagcga gcacaagacg gagctcaagg aaaaattcaa gcggatgtgc 180

gagaaatcga tgatcaggaa gcgttacatg tacttgactg aggagttctt gaaagagaat 240

ccgagtatgt gtgaatacat ggcgccgtca ttggacgcta gacaggacat ggtggtggtc 300

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aagtctaaga tcacccacct agtcttttgc accactagtg gtgtcgacat gcccggagcg 420

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<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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gagaaatcga tgatcaggaa gcgttacatg tacttgactg aggagttctt gaaagagaat 240

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<211> 389

<212> PRT

<213> 金银花(Lonicera japonica)

<400> 3

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Gly Leu Ile Ser Lys Asn Ile Glu Lys Ser Leu Val Glu Ala Phe Lys

275 280 285

Pro Leu Gly Ile Ser Asp Trp Asn Ser Ile Phe Trp Ile Ala His Pro

290 295 300

Gly Gly Pro Ala Ile Leu Asp Gln Val Glu Lys Lys Leu Ala Leu Lys

305 310 315 320

Pro Glu Lys Met Gly Ala Thr Arg His Val Leu Ser Glu Tyr Gly Asn

325 330 335

Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe Ile Met Asp Glu Met Arg Lys Lys

340 345 350

Ser Ala Asn Glu Gly Leu Lys Thr Thr Gly Glu Gly Leu Glu Trp Gly

355 360 365

Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Val Glu Thr Val Val Leu

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His Ser Val Ser Thr

385

<210> 4

<211> 389

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Arg Gln Gly Cys Phe Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Leu Ala Lys Asp

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