栾树查尔酮合酶基因克隆与表达分析

摘要

【目的】查尔酮合酶(CHS)是苯丙烷途径的限速酶之一,在植物次生代谢物的合成中起着重要的作用。本研究通过对栾树CHS基因进行克隆与生物信息学分析,以及分析栾树CHS基因表达与类黄酮合成的关系,期望为后续深入研究栾树类黄酮代谢途径其他相关基因、CHS基因家族以及锦叶栾呈色机制提供参考。【方法】以栾树叶片为材料,采用RTPCR技术进行查尔酮合酶基因的克隆并进行生物信息学分析;通过实时定量PCR(qRT-PCR)技术分析CHS基因在栾树不同组织以及在5月、7月、9月的栾树和锦叶栾叶片中的表达模式;通过代谢组测定筛选出栾树与锦叶栾的类黄酮差异代谢物。【结果】克隆获得两个CHS基因的全长DNA,命名为KpCHS1和KpCHS2。其中KpCHS1序列全长为2492 bp,ORF为1173 bp,编码含有390个氨基酸的蛋白质;KpCHS2序列全长为1321 bp,ORF为1182 bp,编码含有393个氨基酸的蛋白质;进一步的序列比对和系统发育分析表明,KpCHS1和KpCHS2蛋白高度同源,具有四个CHS特异性保守基序和一个查尔酮合成酶活性位点;KpCHS1和KpCHS2在栾树根、茎、叶、种子中都普遍表达,其中,KpCHS2在种子中的表达量最高,KpCHS1在叶片中表达量高,而在根和茎中,两个基因的表达量相似且较低;表达模式分析显示,在栾树和锦叶栾叶片中,随着月份增加,KpCHS1的表达量呈现出下降的趋势,而KpCHS2表达量未表现出明显的规律。在7月份的叶片样本中,KpCHS1基因在锦叶栾中表达量显著高于栾树;代谢组结果显示,山奈酚-7-O-葡萄糖苷、7-羟基香豆素、槲皮素-3β-D-葡萄糖苷、以及类黄酮生物合成途径重要的中间产物山萘酚、柚皮苷等黄酮类物质在锦叶栾叶中含量显著升高。【结论】KpCHS1和KpCHS2属于栾树查尔酮合酶家族并且高度同源,但在系统进化树上分布在很远分支上,推测这两个蛋白在氨基酸活性催化功能上可能存在较大差异;KpCHS1和KpCHS2在根、茎、叶、种子中均有表达,且在叶和种子中较高。研究结果初步显示,KpCHS1基因与栾树类黄酮的生物合成高度相关。