植物内源性植物磺肽素含量的定量检测方法

摘要

本发明公开了植物内源性植物磺肽素含量的定量检测方法。本发明所提供的植物内源性植物磺肽素的检测方法包括：1)向待测样本中加入内标，内标添加量为S0，得到待测样本与内标的混合物；内标为将磺肽素中的部分或全部原子替换为各自的同位素得到的化合物；2)提取混合物中磺肽素和内标，得到提取液；3)对提取液进行除杂和纯化，得到提取物；4)用LC‑MS/MS检测提取物，得到磺肽素和内标的测得值，将磺肽素和内标的测得值分别记为Pd和Sd；根据公式1计算待测样本中磺肽素的含量：磺肽素的含量＝Pd×S0/Sd(公式1)。本发明能够实现对植物内源的植物磺肽素的准确定量分析，且简便快捷、选择性好、准确性高、灵敏度高。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及植物内源性植物磺肽素含量的定量检测方法。

背景技术

植物磺肽素(Phytosulfokine,PSK-α)是近年发现的一种植物内源性多肽类激素。它的序列结构为Tyr(SO₃H)-Ile-Tyr(SO₃H)-Thr-Gln-OH，是一种带有2个磺酸化修饰基团的五肽分子。作为一种翻译后修饰的分泌型多肽，PSK-α发挥着细胞间信号分子的作用，对植物细胞分裂、叶绿素合成、下胚轴发育、不定芽的形成、木质部分化、体细胞胚胎发育、花粉细胞萌发及花粉管生长、生物胁迫响应等生理过程具有重要的调控功能。因此，对植物内源PSK-α进行准确的定性定量分析对研究其生理功能及分子作用机理具有非常重要的意义。

虽然PSK-α在植物中的生理作用在近些年受到越来越多的关注和研究，但是由于含量极低，植物材料基质复杂等原因，对PSK-α进行准确定量检测一直是一个困扰性的难题。目前，已经报道的植物PSK-α定量检测方法需要将植物细胞分离出来在培养基中进行体外培养，利用PSK-α是分泌型多肽的特点，收集细胞分泌到培养基中的PSK-α进行纯化富集和检测。这类方法的最大问题在于不能准确地反映植物正常生长的生理状态下内源PSK-α的含量。

发明内容

本发明所要解决的问题是克服现有检测技术的不足，提供一种简单、快速、准确的植物样品中内源性植物磺肽素的检测方法，可对植物磺肽素进行绝对定量。

本发明所提供的内源性植物磺肽素的检测方法，包括1)和2)：

1)向待测样本中加入同位素标记的植物磺肽素作为内标，将内标的添加量记为S0，得到所述待测样本与所述内标的混合物；所述内标为将植物磺肽素中的部分或全部原子替换为各自的同位素得到的化合物；

2)提取所述混合物中植物磺肽素和所述内标，得到提取物；

3)检测所述提取物中的植物磺肽素和所述内标的含量，得到植物磺肽素和所述内标的测得值，将植物磺肽素和所述内标的测得值分别记为Pd和Sd；根据公式1计算所述待测样本中植物磺肽素的含量：

所述待测样本中植物磺肽素的含量＝Pd×S0/Sd(公式1)。

步骤2)具体可包括：向所述混合物中添加提取溶剂，得到提取液；裂解所述提取液中细胞，得到裂解产物；利用含有胺基的物质富集纯化所述裂解产物中的植物磺肽素和所述内标，得到含有植物磺肽素和所述内标的提取物，即所述提取物。

所述提取溶剂为可以溶解植物磺肽素的液体。

所述提取溶剂具体可为甲醇水溶液、甲醇、乙腈或乙腈水溶液。所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分比含量可大于等于20％小于100％。所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分比含量进一步可大于等于50％小于等于80％。所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分比可为80％。所述乙腈水溶液中乙腈的体积百分比含量可大于等于20％小于100％。所述乙腈水溶液中乙腈的体积百分比含量可为50-80％。所述乙腈水溶液中甲醇的体积百分比可为80％。

所述提取溶剂的添加量满足所述混合物中所述待测样本与所述提取溶剂的配比可为100mg:0.5-2mL。所述提取溶剂的添加量满足所述混合物中所述待测样本与所述提取溶剂的配比进一步可为100mg:1mL。

所述裂解可利用超声进行。所述超声可在低温(如0或4℃)条件下进行。所述超声的条件可为频率40KHz。所述超声的时间可为1-2小时。

所述含有胺基的物质中的胺基可与植物磺肽素中的磺酸基团产生相互作用进而实现对植物磺肽素和所述内标的富集。所述含有胺基的物质具体可为含有仲胺和/或叔胺的物质。所述含有胺基的物质进一步可为N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物基质-CH₂-哌嗪环。

在利用含胺基物质富集所述裂解产物中的植物磺肽素和所述内标前，可先将所述裂解产物进行离心，取上清液，然后利用所述含富集材料富集所述上清液中的植物磺肽素和所述内标。所述离心可在低温(如4℃)条件下进行。所述离心的离心力可为25000g。所述离心的时间可为15分钟。

所述利用含有胺基的物质富集所述裂解产物中的植物磺肽素和所述内标可利用弱阴离子交换-反相吸附混合模式的固相萃取柱完成，所述固相萃取柱为含有胺基基团的弱阴离子反相吸附剂的萃取柱。所述固相萃取柱具体可为Waters公司产品。

利用所述弱阴离子交换-反相吸附混合模式的固相萃取柱富集所述裂解产物中的植物磺肽素和所述内标时，可利用洗脱溶剂洗脱已吸附有植物磺肽素和所述内标的所述固相萃取柱，得到的洗脱液即为所述提取物。所述洗脱溶剂可为氨水-甲醇溶液。所述氨水-甲醇溶液可为5％氨水-50％甲醇，所述5％氨水-50％甲醇由水、氨水和甲醇组成，水、氨水和甲醇的体积比为30:20:50，所述氨水中氨的浓度为25％～28％。

利用所述弱阴离子交换-反相吸附混合模式的固相萃取柱富集所述裂解产物中的植物磺肽素和所述内标时，还可先在利用所述洗脱溶剂洗脱前，利用淋洗溶剂淋洗除杂。所述淋洗溶剂可为用80％(体积比)甲醇水溶液和/或甲醇。

在检测所述提取物中植物磺肽素和所述内标前还可先对所述提取物进行干燥，得到干燥提取物。

3)所述检测所述提取物中植物磺肽素和所述内标可通过质谱进行，具体可通过超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)进行。在利用质谱检测所述提取物中植物磺肽素和所述内标前可利用乙腈溶解所述干燥提取物，得到提取物乙腈溶液，然后利用质谱检测所述提取物乙腈溶液，得到Pd和Sd。

所述将植物磺肽素中的部分或全部原子替换为各自的同位素具体可包括如下至少一种：

c1)将所述植物磺肽素中部分或全部的碳原子替换为¹²C的同位素(如¹³C)；

c2)将所述植物磺肽素中部分或全部的氮原子替换为¹⁴N的同位素(如¹⁵N)；

c3)将所述植物磺肽素中部分或全部的氢原子替换为¹H的同位素；

c4)将所述植物磺肽素中部分或全部的氧原子替换为¹⁶O的同位素；

c5)将所述植物磺肽素中部分或全部的硫原子替换为³²S的同位素。

上述方法中，所述同位素可为重同位素。所述重同位素是指某一元素中质量较大的同位素，相对于质量较小的同位素而言，称为重同位素。

上述方法中，所述内标可为将植物磺肽素中的至少一个氨基酸残基的部分或全部原子替换为各自的同位素得到的化合物。

具体的，所述内标可为将植物磺肽素中异亮氨酸残基的部分或全部原子替换为各自的同位素得到的化合物。

进一步，所述内标可为将植物磺肽素中异亮氨酸残基的C和/或N替换为各自的同位素得到的化合物。

更进一步，所述内标可为将植物磺肽素中异亮氨酸残基的原子进行如下a1)和/或a2)的改造得到的化合物：

a1)将全部的碳原子(¹²C)替换为¹³C；

a2)将氮原子(¹⁴N)替换为¹⁵N。

上述方法中，所述待测样本可为植物的完整植株、器官、组织和/或细胞。

上述方法中，所述植物磺肽素可为所述植物的内源植物磺肽素。

在所述待测样本为植物的完整植株、器官、组织和/或细胞时，可先将所述待测样本研磨成粉末，然后向所述待测样本的粉末中添加所述内标。所述内标的添加量无特殊要求，可根据具体需要调整。

所述内标也属于本发明的保护范围。

下述任一应用，也属于本发明的保护范围：

X1)所述内标在制备检测植物磺肽素含量产品中的应用；

X2)所述内标在检测植物磺肽素含量中的应用；

X3)所述方法在磺肽素定量分析中的应用。

本发明提供了一种可以对植物内源的植物磺肽素进行定量检测分析的方法，该方法能够实现对植物内源的植物磺肽素进行准确定量分析，并且简便快捷、选择性好、准确性高、灵敏度高，对研究植物磺肽素的生理功能及分子作用机理具有非常重要的意义。

附图说明

图1为[¹³C₆¹⁵N]-PSK-α同位素内标谱图。

图2为水稻幼穗样品PSK-α谱图。

图3为水稻茎秆样品PSK-α谱图。

图4为萌发的水稻种子样品PSK-α谱图。

图5为水稻根样品PSK-α谱图。

图6为拟南芥幼苗样品PSK-α谱图。

图7为拟南芥叶片样品PSK-α谱图。

图8为拟南芥花序样品PSK-α谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明提供了一种植物磺肽素含量的检测方法，该方法包括1)和2)：

1)向待测样本中加入同位素标记的磺肽素作为内标，将内标的添加量记为S0，得到待测样本与内标的混合物；内标为将植物磺肽素中的部分或全部原子替换为各自的同位素得到的化合物；

2)提取混合物中植物磺肽素和内标，得到提取物；

3)检测混合物中的植物磺肽素和所述内标的含量，得到植物磺肽素和内标的测得值，将植物磺肽素和内标的测得值分别记为Pd和Sd；根据公式1计算待测样本中植物磺肽素的含量：

待测样本中植物磺肽素的含量＝Pd×S0/Sd(公式1)。

下面以将植物磺肽素中异亮氨酸残基的六个碳原子(¹²C)均替换为¹³C、氮原子(¹⁴N)替换为¹⁵N得到的化合物为内标，以水稻幼穗、水稻茎秆、萌发的水稻种子、水稻根、拟南芥幼苗、拟南芥叶片和拟南芥花序分别为待测样本来具体阐述植物磺肽素含量的检测方法，其结果如图1-8所示。

实施例1、水稻幼穗中PSK-α的测定

一、合成内标：该内标为将植物磺肽素中异亮氨酸残基的六个碳原子(¹²C)均替换为¹³C、氮原子(¹⁴N)替换为¹⁵N得到的化合物，记为[¹³C₆¹⁵N]-PSK-α同位素内标。

二、水稻幼穗中PSK-α的测定

1、PSK-α的提取：

称取213mg水稻幼穗样品并在液氮条件下研磨成粉末，向粉末中加入2mL 80％(体积比)甲醇水溶液和5ng[¹³C₆¹⁵N]-PSK-α同位素内标，得到提取液；将提取液在冰水浴(0℃)中超声提取1h，得到裂解产物，超声条件为40kHz；将裂解产物在4℃条件下，以15000rpm(离心力为25658g)的转速离心15分钟，收集上清液。

2、PSK-α的纯化：

植物样品提取物中PSK-α的纯化富集采用WAX固相萃取柱(Waters公司)。WAX是一种混合型弱阴离子交换反相吸附剂，它的填料含有胺基基团，能够和PSK-α的磺酸基团产生离子作用，适合对PSK-α进行纯化富集。

将WAX固相萃取柱依次经过甲醇和80％(体积比)甲醇水溶液的活化平衡后，向柱中加入步骤1得到的上清液使WAX填料吸附目标化合物(PSK-α和内标)；然后依次用80％(体积比)甲醇水溶液和甲醇的淋洗溶剂淋洗固相萃取柱，最后用5％氨水-50％甲醇洗脱目标化合物，收集洗脱液，即为提取物，用氮气吹干，得到干燥提取物。

其中，5％氨水-50％甲醇由水、氨水和甲醇组成，其中水、氨水和甲醇的体积比为30:20:50，所述氨水中氨的浓度为25％～28％。

3、PSK-α的定量分析

将步骤2得到的干燥提取物用100μL 10％(体积比)乙腈水溶液重新溶解，得到提取物乙腈溶液；将提取物乙腈溶液进行高效液相色谱-串联质谱分析，进样体积为5μL。PSK-α在电喷雾离子源条件下主要以双电荷形式，因此选择[M-2H]^2-为母离子进行定量分析。使用的色谱仪器为Waters公司ACQUITY>

实验结束后分析计算得到Pd为36500，Sd为2090000，根据公式1计算水稻幼穗中PSK-α的含量，计算得到水稻幼穗中PSK-α的含量为0.408ng/g>

本方法建立了简便、高效的样品纯化方法，并采用稳定同位素标记的[¹³C₆¹⁵N]-PSK-α作为内标来对植物內源磺肽素进行定量分析。稳定同位素内标与未标记化合物的物理化学性质具有极高的相似度，在样品提取和纯化、色谱分离及质谱离子化及碎裂过程中表现出几乎完全一致的行为。因此，利用加入已知量的稳定同位素内标可以校正实验过程中的待测物损失及质谱检测中的基质效应等干扰因素，提供准确、可靠的绝对定量结果。

实施例2、水稻茎秆中PSK-α的测定

按照实施例1的方法，将水稻幼穗样品替换为水稻茎秆样品，其他步骤均不变，实验结束后分析计算得到Pd为16400，Sd为1480000，根据公式1计算水稻茎秆中PSK-α的含量，计算得到水稻茎秆中PSK-α的含量为0.276ng/g>

实施例3、萌发的水稻种子中PSK-α的测定

按照实施例1的方法，将水稻幼穗样品替换为萌发的水稻种子样品，其他步骤均不变，实验结束后分析计算得到Pd为2090，Sd为472000，根据公式1计算萌发的水稻种子中PSK-α的含量，计算得到萌发的水稻种子中PSK-α的含量为0.104ng/g>

实施例4、水稻根中PSK-α的测定

按照实施例1的方法，将水稻幼穗样品替换为水稻根样品，其他步骤均不变，实验结束后分析计算得到Pd为4170，Sd为1300000，根据公式1计算水稻根中PSK-α的含量，计算得到水稻根中PSK-α的含量为0.074ng/g>

实施例5、拟南芥幼苗中PSK-α的测定

按照实施例1的方法，将水稻幼穗样品替换为拟南芥幼苗样品，加入[¹³C₆¹⁵N]-PSK-α同位素内标的量为2.5ng，其他步骤均不变，实验结束后分析计算得到Pd为3350，Sd为214000，根据公式1计算拟南芥幼苗中PSK-α的含量，计算得到拟南芥幼苗中PSK-α的含量为0.185ng/g>

实施例6、拟南芥叶片中PSK-α的测定

按照实施例1的方法，将水稻幼穗样品替换为拟南芥叶片样品，其他步骤均不变，实验结束后分析计算得到Pd为13800，Sd为878000，根据公式1计算拟南芥叶片中PSK-α的含量，计算得到拟南芥叶片中PSK-α的含量为0.376ng/g>

实施例7、拟南芥花序中PSK-α的测定

按照实施例1的方法，将水稻幼穗样品替换为拟南芥花序样品，其他步骤均不变，实验结束后分析计算得到Pd为31300，Sd为1270000，根据公式1计算拟南芥花序中PSK-α的含量，计算得到拟南芥花序中PSK-α的含量为0.583ng/g>

实施例8、植物磺肽素含量的检测方法的灵敏性

将0.25pg的[¹³C₆¹⁵N]-PSK-α加入200mg水稻幼穗样品中，按照步实施例1的方法进行检测，进行LC-MS/MS检测。计算色谱图的信噪比，信噪比为10时即可计算得到本方法的检测植物磺肽素的定量限(LOQ，即检测的最低含量)为0.042ng/g fw，当信噪比为3时即可计算得到本方法的检测植物磺肽素的检测限(LOD)为0.014ng/g>