Caractérisation de l’estérase PrbA conférant une résistance accrue aux parabènes chez Enterobacter cloacae.

摘要

Les esters de l'acide 4-hydroxybenzoïque, aussi dénommés parabènes, sont des agents de préservationantibactériens communément utilisés parplusieurs industries pharmaceutiques, alimentaires et cosmétiques. Il existe pourtant des bactéries capables de dégrader ces agents de conservation, et ainsi de poser un danger de contamination dans des produits commerciaux. Une telle souche d'Enterobacter cloacae, nommée EM, a été isolée d'un supplément minéral diététique d'origine commerciale normalement bien stabilisé aux parabènes. Cette souche est hautement résistante aux parabènes et démontre des concentrations minimales inhibitrices approximativement doubles de celles citées dans la littérature. Cette souche est capable de dégrader les parabènes en acide 4- hydroxybenzoïque par l'action d'une estérase et de transformer complétement l'acide 4- hydroxybenzoïque ainsi produit en phénol. Le gène codant pour cette estérase a été cloné par diverses approches de PCR et d'hybridation et a été nommé prbA. Ce gène est situé sur l'ADN chromosomique de la souche EM et code pour une enzyme mature de 54.6 k.Da contenant un peptide signal, la localisant ainsi à l'espace périplasmique. Le transfert du gène prbA à une souche d'Escherichia coli sensible aux parabènes a résulté enudl 'acquisition d'une résistance aux parabènes semblable à celle de la souche EM. L 'estérase PrbA présente plusieurs homologies avec des carboxylestérases de type B d'origine eucaryotique aussi bien que procaryotique. Il a été déterminé que deux souches d'Enterobactergergoviaecapables d'hydrolyser les parabènesenacide 4- hydroxybenzoïque contenaient aussi un gène dont le N-terminal était à plus de 95% identique à celui de prbA. L'estérase PrbA a été purifiée par diverses chromatographies sur colonne. Le poids moléculaire de l'estérase mature a été estimé à 54 kDa par SOS­ PAGE et a été mesuré à 54 619 ± l Da par spectrométrie de masse. L'esterase PrbA est fortement active envers les parabènes avec des substituants méthyle jusqu'à butyle avec une préférence envers les parabènes à courte chaîne alkyle. PrbA présente une faible activité envers 1'acétate de p-nitrophényle. L'estérase est aussi capable d'hydrolyser des analogues structurels des parabènes, notamment le 3-hydroxybenzoate de méthyle, le 4-aminobenzoate de méthyle et Je vanillate de méthyle. Les conditions optimales d'activité estérasique ont été détenninées à 31oc et à pH 7.0. L 'estérase PrbA est capable de transestérifier le méthyle ou le propyle parabène avec une série d'alcools allant duudméthanol au n-butanol avec des taux de rendement de 64% avec 5%) de méthanol en moins de deux heures. L'activité de l'enzyme est partiellement inhibée par des inhibiteurs modifiant spécifiquement les histidines tels que le 1-chloro-3-tosylamido-4-phényle-2- butanone (TPCK) et le 1-chloro-3-tosylamido-7-amino-2-heptanone (TLCK), et complètement inactivée par le diéthylpyrocarbonate (DEPC), indiquant la participation possible d'une histidine au site catalytique. L'enzyme est aussi totalement inhibée par le diisopropylfluorophosphate (DFP), un composé modifiant spécifiquement les sérines. Il a été détenniné qu'une seule molécule de DFP ajoutée à l'enzyme était suffisante pour inhiber totalement l'activité. Des analyses des fragments tryptiques obtenus de l'enzyme modifiée au DFP ont démontré que le site d'attachement du DFP était la sérine 189, indiquant ainsi la position de la sérine catalytique.