Untersuchung des Mechanismus der Signalweiterleitung zwischen Basenfehlpaarung und GATC-Erkennungssequenz im bakteriellen mismatch-Reparatursystem

摘要

Für die Untersuchung/Unterscheidung der verschiedenen Modelle der DNA-mismatch-Reparatur sind geeignete, qualitativ hochwertige DNA-Substrate entscheidend. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass auch sehr kurze lineare mismatch-Substrate für die Analyse des MMR geeignet sind, sofern sich die GATC-Erkennungssequenz in zentraler Position befindet. Weiterhin spielt die Ionenstärke während der mismatch und MutS, -L abhängigen Aktivierung von MutH eine große Rolle. Bei physiologischer Ionenstärke (130 und 150 mM KCl) ist eine mismatch-spezifische, MutS, -L-induzierte Spaltung von MutH an der GATC-Erkennungssequenz gewährleistet. MutS ist das Schlüssselprotein während der mismatch-Reparatur, es muss den mismatch erkennen und das Strangdiskriminierungssignal weiterleiten. Diverse Modelle zur Kommunikation dieser beiden Prozesse und der Stöchiometrie der beteiligten Proteine sind seit Jahren in der Fachwelt umstritten. Innerhalb dieser Arbeit konnte, durch Analyse der MutH-induzierten Spaltung an der GATC-Erkennungssequenz bestätigt werden, dass obwohl MutS Tetramere bilden kann, diese nicht essentiell für seine in vivo- und in vitro-Aktivität sind. Eine Dimervariante (MutSD835R) von MutS zeigte im Vergleich zum Wildtyp zwar eine stärkere Ionenstärke-Sensitivität, war aber in der Lage, die mismatch-induzierte Aktivierung der MutH-Endonuklease zu bewirken. Darüber hinaus wurde das MutS-Dimer mit Hilfe eines crosslinkers zwischen den clamp-Domänen auf der DNA fixiert. Damit konnten in DNA-Bindungs-Experimenten stabile MutS-DNA-Komplexe visualisiert werden. Hiermit wurde eindeutig gezeigt, dass ein Öffnen der clamp-Domänen notwendig ist, damit MutS durch direkte Dissoziation DNA mit blockierten Enden verlassen kann. Trotzdem war das quervernetzte Protein noch in der Lage, DNA über deren Enden nach Ausbildung einer sog. sliding clamp zu verlassen (end-dependent dissociation) und mit Hilfe von MutL die Endonuklease MutH zu aktivieren. Durch Verwendung verschieden langer crosslinker konnte belegt werden, dass die clamp-Domänen von MutS eine gewisse Flexibilität benötigen, um die Umwandlung in eine sliding clamp zu ermöglichen.Kernpunkt bestehender Diskussion über die Modelle, zur Kopplung der mismatch-Erkennung mit der Strangdiskriminierung, ist die Frage nach einem mobilen (sliding clamp) bzw. stationären (DNA-looping) MutS. Zur Unterscheidung dieser prinzipiell verschiedenen Modelle wurden zwischen der Basenfehlpaarung und GATC-Erkennungssequenz diverse Blockaden in die Substrate eingeführt und anschließend untersucht, ob die Transduktion des Signals zur Aktivierung der Endonuklease MutH durch MutS, noch möglich ist. Eine Blockade bestand dabei aus einem Biotin-Streptavidin-Komplex, der die Signalweiterleitung um ca. 60 % inhibierte, allerdings wurde das Substrat damit noch dreieinhalbmal besser gespalten als der entsprechende Homoduplex. Dies ist nicht vereinbar mit einem einfachen MutS-sliding clamp-Modell. Die zweite Blockade war ebenfalls ein Biotin-Streptavidin-Komplex, der in diesem Fall zwei DNA-Stränge verbrückt (Homoduplex-DNA mit GATC-Erkennungssequenz und/oder Heteroduplex-DNA). Kontrollexperimente mit Typ-IIS- und Typ-IIF-Restriktionsendonuklease zeigten, dass sich auf diesen Substraten DNA-loops ausbilden können. Allerdings konnte auf diesen Substraten keine Aktivierung der MutH-Endonuklease auf dem Homoduplex-Substrat detektiert werden, sodass ein einfaches, passives DNA-looping-Modell für die mismatch-Reparatur unwahrscheinlich ist. Im nächsten Abschnitt wurde untersucht, inwiefern die Geometrie zwischen mismatch und GATC-Sequenz einen Einfluss auf die Aktivierung von MutH hat. Hierzu wurden DNA-Substrate mit zwei GATC-Erkennungssequenzen und einer Basenfehlpaarung eingesetzt. Die Geometrien der Substrate wurden systematisch variiert, indem verschiedene Abstände zum DNA-Ende bzw. zwischen GATC-Sequenz und mismatch verwendet wurden. Dabei zeigte sich, dass nicht der Abstand der GATC-Erkennungssequenz zum mismatch, sondern der Abstand zum DNA-Ende für eine effiziente Aktivierung bedeutsam ist. Die GATC-Erkennungssequenz, die am zentralsten lokalisiert ist, wird bevorzugt gespalten. Dies wurde als weiteres Indiz für einen beweglichen Komplex, der über die DNA-Enden zerfallen kann, interpretiert.Um ein stationäres MutS-Modell (MutS am mismatch) endgültig zu widerlegen, wurden DNA-Substrate eingesetzt, bei denen mismatch und GATC-Erkennungssequenz nur zwei Basen auseinander liegen, und somit eine gleichzeitige Bindung von MutS an die Fehlpaarung und MutH an die GATC-Erkennungssequenz nicht möglich ist. Dennoch erfolgte eine mismatch-abhängige Akivierung von MutH, sodass der aktive Komplex bestehend aus MutS, MutL und MutH beweglich sein muss.