Aspetti di ecologia microbica della valorizzazione degli scarti dei frantoi oleari: dinamiche delle comunità microbiche durante il processo di compostaggio e applicazione in strategie di biorisanamento

摘要

La gestione degli scarti delle lavorazioni industriare e agrarie costituisce uno dei problemilegati allo sviluppo economico che ora più che mai mira a diventare sviluppo economicosostenibile. Per questo motivo, nel nostro Paese, secondo produttore di olio d’oliva, ilcompostaggio dei sottoprodotti derivanti dai frantoi oleari (OMW) rappresenta una formadi riciclaggio e valorizzazione di questi scarti. Tra i molteplici usi che questa tipologia dicompost può consentire, un modo efficace ed economico risulta essere la sua applicazionein strategie di biorisanamento. Infatti, l’aggiunta di ammendanti organici a matricicontaminate può facilitare la degradazione dei contaminanti presenti. In questo contesto, ilcompost rappresenta sia una fonte di nutrimento, che può stimolare l’attività degradativadel microbiota autoctono, sia rappresentare una fonte di biomassa microbica con grandipotenzialità degradative che può essere integrata alla matrice contaminata. Nelcompostaggio, come anche nel biorisanamento, i microrganismi rappresentano la chiave divolta che garantisce la riuscita o meno del processo. E’ chiaro quindi come studi diecologia microbica possano aiutare a comprendere i meccanismi che sono alla base diquesti processi, fornendo gli strumenti adeguati per intervenire e ottimizzare i processistessi al fine di conseguire il successo della strategia applicata.In quest’ottica, questo lavoro di tesi ha come obiettivo quello di approfondire leconoscenze legate agli aspetti di ecologia microbica del processo di valorizzazione degliOMW con particolare attenzione all’applicazione in strategie di biorisanamento.L’approccio sperimentale utilizzato per gli studi di ecologia microbica nei vari esperimenti,ha coinvolto sia metodi coltura-dipendenti, sia coltura-indipendenti. I metodi colturadipendentiche prevedevano la coltivazione di funghi e batteri in terreni appropriati, eranofinalizzati alla conta vitale e alla valutazione delle attività enzimatiche. I ceppi diparticolare interesse erano poi isolati e successivamente identificati mediante ilsequenziamento dei loro geni ribosomali (rRNA). Queste tecniche venivano integrate conmetodi indipendenti dalla coltivazione quali quelli molecolari basati sul DNAmetagenomico. Questo tipo di approccio è stato applicato per lo studio della biodiversità edelle dinamiche delle comunità microbiche attraverso l’elettroforesi su gel a gradientedenaturante (DGGE) del frammento del gene ribosomale (18S per i funghi e 16S per ibatteri) che forniva dei fingerprinting di comunità; l’analisi numerica dei profili ottenutipermetteva di valutare sia la similarità delle varie comunità e di seguire l’evoluzione di unacomunità del tempo, sia ottenere per ciascun profilo gli indici ecologici. La valutazionedell’abbondanza delle varie comunità microbiche era ottenuta grazie all’uso della PCRquantitativa (qPCR).La prima parte del lavoro di tesi ha riguardato lo studio del processo di compostaggio discarti proveniente da frantoi a due fasi, realizzato in collaborazione con l'Istituto per iSistemi Agricoli e forestali del Mediterraneo (CNR, Perugia). Il processo è statomonitorato per 140 giorni durante i quali venivano periodicamente raccolti dei campioniper la valutazione della trasformazione della materia organica e per lo studio dellepopolazioni microbiche coinvolte in questo processo. I parametri chimici mostravano iltipico trend del compostaggio in cui la temperatura mostrava una fase di attivazioneiniziale, seguita da una fase termofila, risultato di un’intensa attività microbica e una fasefinale mesofila durante la quale la temperatura diminuiva e rimaneva stabile fino alla finedel processo. Inoltre, si assisteva a un’alta mineralizzazione e umificazione della sostanzaorganica, associata a un’alcalinizzazione della matrice, nonché ad un abbattimento deipolifenoli ottenendo così la trasformazione di questo scarto in un ammendante di buonaqualità. Le analisi microbiologiche effettuate sia per la valutazione della biodiversità chedell’abbondanza, mostravano come molte popolazioni batteriche e fungine, eranodominanti e venivano osservate solo in fasi specifiche, indicando la presenza dimicrorganismi specializzati e con ruoli diversi durante la biotrasformazione di questoscarto. In particolare, la fase termofila, in cui si registrava la più alta attività degradativa,era caratterizzata da una più alta biodiversità, mentre in corrispondenza dallastabilizzazione chimica del processo, le comunità erano caratterizzate da una biodiversitàpiù bassa e la struttura tendeva a stabilizzarsi. Era interessante notare come la maggiorparte dei batteri tannasi-positivi erano stati isolati durante la fase termofila, suggerendoquindi un ruolo fondamentale di queste popolazioni nella trasformazione della materiaorganica. L’identificazione delle popolazioni fungine durante il processo evidenziava comeanche questi, abbiano un ruolo strategico in questo processo, in particolare durante la fasetermofila erano presenti specie termofile e termotolleranti molte delle quali già note per lacapacità di degradare sostanze complesse quali lignina o cellulosa.Come diretta conseguenza dello studio delle popolazioni microbiche coinvolte nelcompostaggio degli OMW, venivano anche analizzate le comunità batteriche di differenticompost ottenuti dallo stesso tipo di sottoprodotto ma prodotti variando alcuni parametritecnologici. Lo scopo di questo studio, era quello di cercare una possibile relazione tra ladiversità microbica, le tecnologie di compostaggio e le caratteristiche chimiche delcompost prodotto. L’analisi DGGE dei 15 compost ha mostrato una grande variabilità deifingerprinting delle comunità batteriche. Interessante era notare come la diversità battericasembrava negativamente correlata con il pH ma positivamente con il rapporto C/N,principalmente a causa di una correlazione negativa con l’azoto totale. L’analisi statisticaavanzata della coinerzia ha evidenziato come la diversità dei vari compost sia lega alprocesso di maturazione. Infatti, i compost caratterizzati da una bassa complessità dellastruttura della comunità batterica indicavano una stabilizzazione del processo e quindi unamaturazione della matrice compostata caratterizzata da valori di pH, azoto e rapporto C/Ntipici di un compost maturo. Quest’analisi, conferma e rafforza i risultati ottenuti durante ilmonitoraggio del processo di compostaggio nel quale la biodiversità microbica erastrettamente legata al livello di maturazione raggiunto dalla matrice. Nel loro insiemequeste indicazioni hanno suggerito l’utilizzo di un possibile indice aggiuntivo per lavalutazione della maturità del compost basata sulla diversità batterica.La seconda parte del lavoro di tesi è stata finalizzata alla valutazione degli effetti delcompost sul microbiota indigeno di ambienti contaminati, con particolare attenzione aldestino delle comunità microbiche del compost. Con quest’obiettivo, il compost OMWcaratterizzato nella prima parte della tesi, nominato TPOMW, è stato utilizzato perrealizzare due studi di biorisanamento su scala di laboratorio che coinvolgono un terrenostoricamente contaminato con diesel-oil e un fango contaminato da farmaci.Nella prima prova, il suolo storicamente contaminato da diesel-oil veniva ammendato conil compost TPOMW e due spent mushroom compost (SMC) derivanti dalla coltivazione diAgaricus bisporus e Pleorotus ostreatus, e incubati per 120 giorni. I campioni sono statiprelevati per le analisi a intervalli regolari. Gli effetti del compost TPOMW eranoconfrontati con quelli di SMC. Per studiare gli effetti ecologici di questa strategia dibonifica sulle comunità microbiche indigene, tutti i compost sono stati utilizzati siasterilizzati che non, con l'obiettivo di simulare rispettivamente una strategia dibiostimulation (nutrienti presenti nel compost) e bioaugmentation (biomasse di compost).I risultati ottenuti dall'analisi DGGE indicavano che l’aggiunta dei compost al suolocontaminato ne modificavano profondamente le comunità batteriche e fungine chemostravano dei fingerprinting estremamente complessi e stabili durante tutto il periodo diincubazione. Al contrario, quando il terreno veniva ammendato con i compost sterilizzati ifingerprinting microbici mostravano un’evoluzione dalle comunità che passavano da unastruttura molto semplice (tipica di suoli contaminati) ad una complessa, ricca dibiodiversità. La quantificazione delle popolazioni batteriche e fungine, mediante qPCR,confermavano che i compost utilizzati fornivano al suolo una biomassa microbica moltoricca, mentre i compost sterilizzati erano in grado di stimolare la crescita di popolazionimicrobiche autoctone. Complessivamente questi dati suggerivano che l’aggiunta dicompost, anche di tipologie molto diverse tra loro (OMW compost e Smc), potrebbe essereconsiderata come una strategia di bioaugmentation, dove le comunità esogene moltocomplesse sono state in grado di vincere la competizione con la microflora endogena delsuolo colonizzando completamente la matrice contaminata. Al contrario, una strategia dibiostimulation, simulata con l’utilizzo dei compost sterilizzati, sembrava stimolare lacrescita della flora microbica endogena che, teoricamente, potrebbe essere la più adatta alladegradazione dei contaminanti. Anche se i dati relativi rimozione dei contaminanti chimicisono, al momento, non disponibili, si può ipotizzare che l'aggiunta di compost ai terrenicontaminati può non essere adatta per una strategia di biorisanamento, poiché le complessecomunità microbiche del compost tendono ad inibire le popolazioni microbiche endogenepotenzialmente attive.La seconda prova di biorisanamento su scala di laboratorio veniva effettuata su fanghi,derivanti da un impianto di depurazione, contaminati da farmaci. Per monitorare meglio lacapacità degli ammendanti di stimolare il risanamento, il fango veniva arricchito conconcentrazioni note di carbamazepina, un farmaco antiepilettico altamente persistente ecomunemente presente in questa tipologia di matrice. Per studiare gli effetti microbiologicisul microbiota indigeno durante il biorisanamento di questi fanghi contaminati ad hoc,sono stati utilizzati due diversi tipi di compost derivati da OMW dei frantoi che utilizzanoil processo a due fasi: compost TPOMW ottenuto dal processo di compostaggio normale (egià utilizzato nella prima prova di bioremediation) e un compost, denominato "compost bigbag", prodotto con un procedimento innovativo che consiste in una stabilizzazione delloscarto mediante un processo di compostaggio statico. Come nella prima prova, i compostvenivano utilizzati non sterilizzati e sterilizzati per capire se gli effetti di biorisanamentopotevano essere dovuti alle sostanze nutritive o alle comunità microbiche aggiunte con gliammendanti. Durante la sperimentazione durata 30 giorni, le dinamiche delle comunitàmicrobiche sono state monitorate tramite le analisi DGGE e qPCR. L’applicazione deicompost tal quali in una matrice contaminata, sembrava non produrre risultatisoddisfacenti, in quanto le comunità dei compost tendevano a colonizzare il substrato,inibendo la microflora endogena potenzialmente in grado di degradare il contaminante. Alcontrario, l’apporto di nutrienti, forniti con compost sterile, sembrava stimolareadeguatamente le popolazioni indigene favorendo l’espressione delle loro potenzialitàdegradative, con conseguente rimozione anche solo parziale, del contaminante in tempirelativamente più brevi rispetto ad una attenuazione naturale. Per quanto riguarda lecomunità fungine, mentre nel controllo e nei trattamenti in cui erano usati i compoststerilizzati non veniva rilevata la presenza di alcuna popolazione, se non quelle imputabiliad una colonizzazione successive di microrganismi ambientali, nei fanghi trattati con icompost non sterilizzati la comunità fungina subiva un brusco calo della biodiversitàprobabilmente dovuta alle alte concentrazioni del farmaco. Dati questi risultati, econfrontati con quelli delle comunità batteriche, si può supporre che le comunità funginenon abbiano avuto una forte rilevanza sull’attività di degradazione del farmaco.Questo lavoro di tesi ha fornito una buona dimostrazione di come gli studi di ecologiamicrobica siano in grado di supportare l'ottimizzazione della valorizzazione degli scartiagro-industriali e le definizioni di strategie ottimali di biorisanamento. In particolare, èstato dimostrato come, durante il processo di compostaggio di OMW, una rapidasuccessione di diverse popolazioni microbiche specializzate sia responsabile dellabiotrasformazione della sostanza organica con conseguente produzione di un compost dibuona qualità. E' stato anche dimostrato che si deve prestare massima attenzione nellascelta della strategia da adottare in interventi di biorisanamento che prevedono l’uso diquesta tipologia di compost. La ricca e complessa comunità microbica che caratterizzaquesta matrice può, infatti, inibire il potenziale degradativo delle popolazioni endogene,mentre le strategie di biostimaltion, basate sull’aggiunta di nutrienti, possono rappresentareun approccio di successo.