农业废物堆肥中木质素降解功能微生物群落结构研究

摘要

堆肥化作为一种有效处理农业废物的方法已经得到广泛的利用，堆肥化过程中有机质是靠堆肥过程中细菌、真菌、放线菌的共同作用来完成。堆肥过程中的微生物组成与堆肥过程中的有机质相互影响，相互作用，成为影响堆肥进程的重要因素。木质纤维素是农业有机废物中的主要难降解有机废物，木质素由于其结构复杂，不易水解，并且细胞壁中的纤维素和半纤维素受到木质素的保护，以及木质素是腐殖质的前体物质，因此木质素的生物降解成为堆肥过程的限速环节。漆酶是木质素降解的三大功能酶之一，可以有效的催化氧化各种酚类以及非酚类底物，并在堆肥木质素生物降解以及腐熟进程中发挥重要作用。
　　本研究利用典型农业废物以及森林表层土壤对农业废物堆肥进行模拟，采用含有愈创木酚以及放线酮抗生素的筛选培养基，从堆肥高温期第4天样品中分离得到一株高产漆酶菌株C1，对其鉴定，分析其产酶特性以及环境有机染料的降解。结果表明，通过对菌株的培养特征，形态特征显微镜观察以及16Sr RNA序列分析，该菌株鉴定为链霉菌，命名为Streptomyces sp.C1。对Streptomyces sp.C1液体发酵所产的漆酶SCLAC经过膜过滤、硫酸铵沉淀、DEAE-52纤维素色谱柱、Sephadex G-100凝胶柱纯化后，漆酶比活力提高到24.42 U·mg-1，纯化倍数为25.7，回收率3.45％。通过SDS-PAGE电泳图表示，纯化后的漆酶分子量较小，约为38kDa。根据纯化蛋白质测得的氮端氨基酸序列和较小分子量，该漆酶很可能为新型的 two-domain漆酶。SCLAC最适宜反应pH值分别为7.0（2,6-DMP）和8.0（ABTS和愈创木酚），最适宜的反应温度为40℃。该漆酶SCLAC具有一定的耐碱性和耐热性，在pH10.0的缓冲液中培育24h，或在50℃条件下保温120 min，剩余酶活仍在60%以上。浓度仅为1mM的DDC和NaN3以及浓度为20mM的抑制剂EDTA能完全抑制漆酶的酶活性。酶活能被某些低浓度的金属离子激活如Cu2+, Co2+和Fe3+，除Cu2+外，高浓度的金属离子都会抑制酶活。漆酶SCLAC对 ABTS的 Km值最小，约为0.43mM, kcat/Km达到了1.76×104 M-1 s-1，表明与ABTS结合的最为紧密。SCLAC对环境污染物的降解时发现，在小分子介体丁香醛连氮存在的情况下，漆酶SCLAC对染料靛红和钻石黑具有较好的降解效果。结果表明，从堆肥代表时期样品中能分离得到表达量高、热稳定性较好的漆酶，为进一步研究堆肥环境中木质素降解微生物的重要功能基因提供了借鉴作用，具有重要的理论意义和应用前景。
　　越来越多的研究致力于采用13C固体核磁共振波谱法（solid13C-NMR）表征堆肥以及土壤样品中有机质的动态变化过程，堆肥过程中的有机质的变化与微生物的种群组成及动态变化相互影响，不同有机质的对细菌和真菌的种群组成的影响大小不同。在本研究中，采用PCR-DGGE分析了堆肥期间细菌及真菌微生物群落结构变化，13C NMR分析堆肥过程中参与碳化学的变化，并采用冗余分析 RDA研究残余碳化学对细菌和真菌微生物群落变化的影响。结果表明，显著影响细菌群落结构的因子为C/N、芳香基碳Aryl-C、pH值和氧烷基类碳O-alkyl-C（P<0.05），对于真菌群落结构而言，显著因子为WSC、Di-O-alkyl-C、N-alkyl-C以及堆体温度（P<0.05）。芳香基碳Aryl-C与细菌群落的相互影响，表示堆肥过程中的细菌微生物群落结构参与堆肥木质素生物降解。结果表明，残余碳化学变化与堆肥微生物种群结构相互作用，为进一步理解堆肥过程中可利用有机碳与微生物群落结构提供了理论参考。
　　传统的细菌和真菌three-domain漆酶基因结构及多样性已经有了较为深入的研究，而最新的研究发现，two-domain漆酶是比一般的漆酶基因氨基酸残基少，分子量小的新型漆酶。这类漆酶被认为广泛存在于链霉菌属中，链霉菌属为堆肥过程中的优势放线菌，链霉菌属漆酶具有热稳定性好、耐碱性以及作用底物范围广等优势。本研究为了评价链霉菌属two-domain漆酶基因多样性及分布，从而进行链霉菌属漆酶基因的相关木质素降解及产酚氧化酶活功能分析。本研究根据链霉菌属two-domain漆酶基因的保守氨基酸及其cDNA序列，设计了针对于多铜结合2区和4区之间扩增链霉菌two-domain漆酶基因的特异性引物对Cu2SF/Cu4SR。克隆文库分析表明，堆肥期间的链霉菌two-domain漆酶基因多样性较高，以及处于不断的动态变化之中。系统发育分析表明，堆肥中的链霉菌属two-domain漆酶主要与天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor、紫黑链霉菌Streptomyces violaceusniger、灰色链霉菌Streptomyces griseus以及甘薯链霉菌的two-domain漆酶基因聚类。测得的序列共分为8个进化枝，大多数与已知的链霉菌two-domain漆酶基因聚类，但是分枝III和VIII未与已知链霉菌two-domain漆酶基因序列聚类。此外，碱性条件下（pH8.0）测得堆肥期间酚氧化酶活变化与链霉菌属two-domain漆酶基因数量显著正相关（R2=0.830，P=0.012），但酸性条件下测得的酶活却不显著相关。链霉菌属two-domain漆酶基因数量与半纤维素降解率线性显著正相关（R2=0.651，P=0.05），与纤维素和木质素降解率正相关（R2=0.484和R2=0.466）。结果表明，堆肥链霉菌属微生物很可能参与酚氧化酶活的产生以及木质纤维素降解相关功能，链霉菌属two-domain漆酶基因多样性的相关研究对于拓展漆酶基因的分子生物学发展及其环境应用具有十分重要意义。
　　传统的研究认为真菌对堆肥中的木质素降解发挥主要作用，最近的研究发现，许多细菌也能产生漆酶，对木质素发生溶解作用，而且细菌漆酶具有耐碱性及耐热性等有利特性，这些特性使得细菌在高温及弱碱性的堆肥环境中具有优势，因此推测堆肥中的细菌种群同样对堆肥中的木质纤维素的降解发挥关键作用。并且针对于堆肥期间漆酶细菌多样性，分布以及其相关功能的研究还比较少。采用细菌漆酶通用引物Cu1AF/Cu2R，对堆肥期间代表时期样品（D1，D4，D8，D15，D30，D50）的细菌漆酶基因进行扩增。共建立6个克隆文库，得到189条有效序列，共划分为59个OTUs（10%遗传进化距离）。堆肥期细菌漆酶香农指数在第4天高温期达到最大值，为3.42，表明堆肥高温期的细菌物种种群较为丰富。克隆测序所得到的189个序列与已知细菌漆酶基因共同建立的系统发育树表明，α变形菌门α-proteobacteria，γ变形菌门γ-proteobacteria，放线菌门或厚壁菌门Actinobacteria/Firmicutes占序列总数的71.89%，在选取的6个克隆文库中，为堆肥期间的细菌漆酶基因的优势种群。皮尔森Pearson相关分析表示，堆体温度和WSC含量与细菌漆酶基因数量，Chao1丰富度指数，香农指数正相关。RDA相关性分析表示，在选取的环境因子中，富里酸对堆肥期间细菌漆酶基因分布影响最大。结果表示，细菌漆酶基因数量，多样性指数以及分布结构与堆肥中环境因子变化相互影响，堆肥过程中的环境因子的变化是推动和形成堆肥过程细菌漆酶群落结构的主要驱动因子。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

插图索引

附表索引

第1章 绪 论

1.1 有机废物堆肥化及研究进展

1.2 堆肥中木质纤维素降解功能微生物及其作用机理

1.3漆酶简介

1.4本文结构与主要内容

第2章 农业废物堆肥中分离的新菌株Streptomyces sp. C1产漆酶特性研究

2.1 实验材料与设备

2.2 分析方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第3章 残余碳化学与农业固体废物堆肥期间微生物群落结构关系研究

3.1 材料与设备

3.2 分析方法

3.3结果与讨论

3.4 本章小结

第 4 章 链霉菌 two-domain 漆酶基因的多样性及其潜在木质素降解功能研究

4.1 材料与设备

4.2 分析方法

4.3结果与讨论

4.4 本章小结

第5章 农业废物堆肥产漆酶细菌种群变化特征及对基质条件变化的响应

5.1 材料与设备

5.2 分析方法

5.3结果与讨论

5.4 本章小结

结论

参考文献

附录A 攻读学位期间发表的论文目录

附录B 攻读学位期间申请的发明专利

附录C 攻读学位期间参与的研究课题

致谢