ウシ切断2分離あるいはバイオプシーした胚の超低湿保存後の生存性に及ばす要因

摘要

切断2分離あるいはバイオプシーしたウシ胚のガラス化および緩慢凍結保存後の生存性に及ぼす要因を検討した。 ホルスタイン種33頭（乾乳牛および未経産牛）を用い、過剰排卵処理を実施した。 人工授精後7日日に胚回収を実施し、後期桑実胚～拡張胚盤胞のグレード1および2の品質の胚を、切断2分離あるいはバイオプシーした。 これらの胚を3～5時間培養し、生存しており形態の良好な胚をガラス化あるいは緩慢凍結保存に供試した。 ガラス化保存（ガラス化区）は、Dulbecco's PBS（DPBS）を基礎媒液とし、20％Gly、20％EG、0.3M Suc、0.3M Xlyおよび3％PEGを添加した液を用いて実施した。 綬慢凍結保存（ダイレクト区）は、DPBSを基礎媒液とし、1.5M EG、0.1M Suc、4mg／ml BSA、20％csあるいはFCSを添加した凍結媒液を用いて実施した。 切断2分離胚のin vitroにおける生存性の検討では、ガラス化区が、加温後24および48時間において、ダイレクト区に比べ、有意に高い生存率を示した（75.5 vs. 51.0％，24時間，p＜0.05および75.5 vs. 49.0％，48時間，p＜0.01）。 ガラス化およびダイレクト区の発育ステージにおける胚の生存性に有意な差は認められなかった。 また、in vivoにおける生存性の検討では、ガラス化区が33.3％、ダイレクト区が16.7％、新鮮区が52.4％の受胎率だった。 バイオプシー胚のin vitroにおける生存性の検討では、いずれの観察時間においても有意差が認められなかった。 しかし、発育ステージにおいて、すべての観察時間のCMおよびEBが、BLおよびExpBに比べて生存率が高かった（p＜0.05）。 In vivoにおける生存性の検討では、ガラス化区が47.1％、ダイレクト区が60.0％、新鮮区が68.8％の受胎率を示し、有意差は認められなかった。 しかし、発育ステージにおいて、CMおよびEB（73.3％，n＝30）が、BLおよびExpB（43.5％，n＝23）に比べて受胎率が高かった（p＜0.05）。 ガラス化および緩慢凍結保存したバイオプシー胚の生存細胞数、死滅細胞数および生存細胞割合に、有意な差は認められなかった。 どちらの保存方法によっても死滅細胞は胚の特定の場所に局在していなかった。以上のことから、切断2分離した胚は、ガラス化保存が緩慢凍結保存に比べて高い生存性を示したが、今回の方法を用いた場合、その受胎率は実用可能となるには不十分であり、さらなる改善が必要と考えられた。 バイオプシー胚は、どちらの保存法においても差がなく、CM～EBの発育ステージの胚を利用することで、高い生存性が確保できる可能性が示された。