水溶性ブルランフィルムを用いて超急速ガラス化保存した ゥシ体外生産胚のストロー内一段階希釈法の検討

摘要

本試験では、ガラス化保存したゥシ体外生産胚 を二段階希釈、一段階希釈、ストロー内一段階希 釈により希釈、加温して、その後の生存性を調査した。供試胚は媒精後7日間、合成卵管液を用い て培養して作出した。ガラス化液は、D-PBSに 20%FBS (m-PBS)を添加したものに15%EG、 15%DMS0、 0.6Mスクロース加えたEDS30液を 用いた。胚を室温でm-PBSに2分間、 50%EDS30液に4分間平衡し、プルランフィル ム上にEDS30液とともにのせ、1分以内に液体 窒素に浸漬した。一定期間液体窒素で保存した後、以下の3つの 方法を用い希釈及び加,温を行った。二段階希釈 (TSD)では、プルランフィルムを38°Cの0.6M Sue m-PBSに直接浸漬して2分間、0.3M Sue m-PBS (0.3MS)に2分間、m-PBSに移して静置し 加温した。一段階希釈（OSD)では、プルラン フィルムを38°Cの0.3MS液に4分間置き、次い でm-PBSに移して静置した。ストロー 内一段階希釈（OSID)では、0.3MS液をあらかじめ封入 したストローを38°Cの温湯に縦に保持し、そこ ヘプルランフィルムを揷入して4分間保持し、 シャーレに取り出しm-PBSに移し静置した。ガ ラス化しない胚を非ガラス化区とした。加温後の 胚はO.lmM /S メ ノレカプトエタノール及び 20%FBS添加TCM199で培養し、生存性を調査 した。培養24時間後の生存率はTSDで89.3%、 OSDで92.6%、 OSIDで75.0%、非ガラス化区で 100%であった。一部の胚で、保存30分前と加温 30分後に呼吸量を測定したところ、各区の胚の 呼吸量は、保存前と加温後で有意な低下は認められなかった。これらのことから水溶性プルラン フィルムを用いたゥシ体外生産胚の超急速ガラス 化保存後のストロー内希釈が可能なことが示され た。