Characterization of cDNA of lycopene β-cyclase responsible for a high level of β-carotene accumulation in Dunaliella salina

摘要

Lycopene b-cyclase (Lyc-B) is the key enzyme in the catalysis of linear lycopene to form cyclic b-carotene, annindispensable part of the photosynthetic apparatus and an important source of vitamin A in human and animal nutrition.nStudies showing that the microalga Dunaliella salina can accumulate a high level of b-carotene are lacking. We hypothesizenthat D. salina is closely involved with the catalytic mechanism of Lyc-B and the molecular regulation of its gene. Innthis study, we used RT–PCR and RACE–PCR to isolate a 2475 bp cDNA with a 1824 bp open reading frame, encoding anputative Lyc-B, from D. salina. Homology studies showed that the deduced amino acid sequence had a significant overallnsimilarity with sequences of other green algae and higher plants, and that it shared the highest sequence identity, up ton64%, with Lyc-B of Chlamydomonas reinhardtii. Codon analysis showed that synonymous codon usage in the enzyme hasna strong bias towards codons ending with adenosine. Two motifs were found in the Lyc-B sequence, one at the N terminus,nfor binding the hypothetical cofactor FAD, and the other was a substrate carrier motif in oxygenic organisms sharednby an earlier carotenogenesis enzyme, phytoene desaturase, and Lyc-B. A tertiary structure prediction suggested that thencatalytic or binding site structure within LycB from D. salina is superior to that of both H. pluvialis and C. reinhardtii.nThe LycB protein from D. salina was quite removed from that of H. pluvialis and C. reinhardtii in the phylogenetic tree.nTaken as a whole, this information provides insight into the regulatatory mechanism of Lyc-B at the molecular level andnthe high level of b-carotene accumulation in the microalga D. salina.%Re´sume´ : La lycope`ne b-cyclase (Lyc-B) est l’enzyme cle´ qui catalyse la cyclisation du lycope`ne line´aire en b-carote`ne,nun compose´ indispensable a` l’appareil photosynthe´tique et une source importante de vitamine A dans la nourriture humainenet animale. Les travaux cherchant a` comprendre le fait que Dunaliella salina puisse accumuler de hauts niveaux denb-carote`ne manquent toujours; nous posons l’hypothe`se qu’il existe une relation e´troite entre le me´canisme catalytique denla Lyc-B et la re´gulation mole´culaire de son ge`ne. Un ADNc d’une longueur de 2475 pb posse´dant un cadre de lecture ouvertnde 1824 pb et codant une Lyc-B pre´sume´e a d’abord e´te´ isole´ de D. salina par RT–PCR et RACE–PCR. Des recherchesnd’homologies ont montre´ que la se´quence de´duite en acides amine´s posse´dait un degre´ total sde similarite´ significatifnavec les se´quences trouve´es chez d’autres algues vertes et chez les plantes supe´rieures, l’identite´ de se´quence la plus e´leven´e, soit 64%, e´tant partage´e avec la Lyc-B de Chalmydomonas reinhardtii. L’analyse des codons a permis de de´terminernque l’utilisation de codons synonymes de cette enzyme e´tait fortement biaise´e en faveur d’une ade´nosine terminale. Deuxnmotifs ont e´te´ trouve´s au sein de la se´quence de Lyc-B : un premier, e´tait situe´ a` l’extre´mite´ N-terminale pour lier vraisemblablementnle cofacteur FAD; le deuxie`me constituait un motif de transporteur de substrat chez les organismes oxyge´-nniques, retrouve´ chez une enzyme carote´noge`ne, la phytoe`ne de´saturase. Une pre´diction de la structure tertiaire sugge`re lanpre´sence d’une structure de niveau plus e´leve´ au sein du site catalytique ou du site de liaison de Lyc-B de D. salina comparativementna` H. pluvialis et C. reinhardtii. La prote´ine Lyc-B de D. salina e´tait ve´ritablement e´loigne´e de celle de H.npluvialis et C. reinhardtii dans l’arbre phyloge´nique. La combinaison de ces caracte´ristiques pourrait donner des indices etnun aperc¸u du me´canisme de re´gulation de la Lyc-B au niveau mole´culaire et des me´canismes subse´quents responsables dunhaut degre´ d’accumulation de b-carote`ne dans l’algue microscopique D. salina.