杜氏盐藻番茄红素β-环化酶全长cDNA的克隆和序列分析

摘要

杜氏藻(Dunaliella)广泛存在于淡水、海水甚至高浓度盐环境中，其耐盐浓度范围很宽，在超盐环境中常常是优势物种。杜氏藻属的两个重要种类，杜氏盐藻(Dunaliellasalina)和巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)能在适宜的条件下合成和积累大量的β-胡萝卜素，是公认的产β-胡萝卜素最好的天然资源。 D.salina和D.bardawil是迄今发现的β-胡萝卜素含量最高的生物，含量为干重的3％～5％，高于其他生物至少一个数量级。杜氏藻能如此高度累积β-胡萝卜素，我们认为与其代谢途径中关键酶的催化机理及其基因调控直接相关。因此从分子生物学的角度研究盐藻合成和累积合成β-胡萝卜素的机理有重大的科学意义。从应用角度来说，只有分离相关合成酶基因，充分弄清类胡萝卜素的次生代谢过程，进而阐明盐藻β-胡萝卜素高度累积的机制，才能对类胡萝卜素代谢途径进行调控，为构建类胡萝卜素工程菌株奠定基础，解决类胡萝卜素的工业生产瓶颈，满足食品、日化和工业生产的需求。 番茄红素β-环化酶是催化番茄红素转化成β-胡萝卜素的关键酶，盐藻高度累积β-胡萝卜素与该酶的基因调控及其酶催化机理直接相关。本研究旨在克隆盐藻番茄红素β-环化酶全长cDNA，对其序列进行生物信息学分析，为体外重建β-胡萝卜素合成路径提供前提条件，为研究盐藻中该次生代谢途径的调控提供了更坚实的基础。 对相近物种的番茄红素β-环化酶基因eDNA序列进行比对，寻找具有高度保守性的序列，并根据该段序列设计引物，利用RT-PCR和半巢式PCR方法扩增得到杜氏盐藻LycB的eDNA保守片断524bp，同雨生红球藻与莱茵衣藻的LycB基因eDNA和氨基酸序列同源性较高，从而确定了该片段确实为LycB基因的一部分。为使片段向3’端延伸，继续设计特异性引物，获得3个长短不一的片段，拼接后得到1.049kb的片断。采用略有修改的SMART技术进行3’RACE和巢式PCR，获得了1383bp的片段；进行5’RACE和巢式PCR，获得了1.934kb的片断。将得到的各片断做了拼接，得到1934bp的片断，再次克隆盐藻番茄红素β-环化酶eDNA的CDS区，验证拼接结果。 对该eDNA进行序列分析，包括与其它物种的相同功能基因进行序列同源性比较和进化分析，密码子的偏好分析，推测其可能的结构和功能的特殊性，并与雨生红球藻和莱茵衣藻作比较，从生物信息学角度解释了盐藻高度积累β-胡萝卜素的原因。密码子分析显示，盐藻的同义密码子以A结尾居多，推测对转录和三级结构有影响；在进化关系上盐藻与雨生红球藻和莱茵衣藻甚远；氧化还原酶家族保守区增强了盐藻LyeB脱氢部位的催化能力，导致番茄红素末端环化生成β-胡萝卜素的过程更加直接快速；三级结构推测表明盐藻LycB的催化位点或结合位点富有更多的结构优势。这些特点为盐藻高度积累β-胡萝卜素的原因提供了各方面证据。

目录

文摘

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第一章绪论

1.1类胡萝卜素及其研究进展

1.1.1分布，来源与理化性质

1.1.2功能与生物功效

1.1.3生物合成途径

1.1.4研究进展

1.1.5类胡萝卜素的基因工程

1.2杜氏盐藻

1.2.1盐藻的生物学性质

1.2.2盐藻累积β-胡萝卜素的条件

1.2.3盐藻研究进展

1.2.4盐藻的基因工程

1.3本论文研究的目的、主要内容和意义

第二章杜氏盐藻番茄红素β-环化酶cDNA保守序列的扩增及同源性分析

2.1杜氏盐藻番茄红素β-环化酶cDNA保守序列的扩增

2.1.1材料与方法

2.1.2结果与分析

2.2杜氏盐藻番茄红素β-环化酶cDNA保守序列的延伸

2.2.1材料与方法

2.2.2结果与分析

2.3本章小结

2.3.1 RNA的提取

2.3.2 PCR操作

2.3.3盐藻番茄红素β-环化酶cDNA保守序列的扩增

2.3.4 PCR产物的测序

第三章杜氏盐藻番茄红素β-环化酶全长cDNA的克隆与同源性分析

3.1 3'RACE方法扩增杜氏盐藻番茄红素β-环化酶cDNA的3'

3.1.1材料与方法

3.1.2结果与分析

3.2 5'RACE方法扩增杜氏盐藻番茄红素β-环化酶cDNA的5'

3.2.1材料与方法

3.2.2结果与分析

3.3本章小结

3.3.1 RACE技术

3.3.2套峰

第四章杜氏盐藻番茄红素β-环化酶cDNA的CDS区克隆和序列分析

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果与分析

4.2.1 cDNA全长的拼接

4.2.2 CDS区的扩增

4.2.3 CDS区的克隆与酶切鉴定

4.2.4 cDNA序列的生物信息学分析

4.2.5氨基酸的序列分析

4.3本章小结

4.3.1同源性

4.3.2密码子的偏好

4.3.3进化关系

4.3.4结构预测

结论与展望

1.结论

2.创新点

3.展望

参考文献

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢

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